动物细胞工程制药

1、动物细胞工程制药动物细胞工程制药 第一节第一节 概述概述 德国的植物学家Schleiden和动物学家Schwann创立了细胞学说 1885年Roux用生理盐水成功培养鸡胚组织 1907年Harrison成功地培养了离体的蛙胚神经组织，并观察到神经细胞突起的生长过程。开创现代细胞培养的新纪元 细胞工程是以细胞为单位，按人们的意志，应用细胞生物学、分子生物学等理论和技术，有目的地进行精心设计，精心操作，使细胞的某些遗传特性发生改变，从而达到改良或产生新品种的目的，以及使细胞增加或重新获得产生某种特定产物的能力，从而在离体条件下进行大量培养、增殖，并提取出对人类有用的产品 动物细胞生产各类生物制品：

2、疫苗（如乙肝疫苗，狂犬病疫苗，脊髓灰质炎疫苗和乙脑疫苗）、人淋巴因子（如、b和干扰素、白细胞介素l 、2和6）、纤维蛋白溶酶原激活剂（如pro-UK和t-PA）、单克隆抗体、红细胞生成素（EPO）、第8因子、肿瘤坏死因子（TNF）、粒细胞聚落刺激因子（G-CSF）、上皮生长因子（EGF）及过氧化物歧化酶等第二节第二节 动物细胞形态和生理特性动物细胞形态和生理特性 一、动物细胞的形态一、动物细胞的形态 贴壁细胞：细胞的生长必须有可以贴附的支持物表面，依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长、增殖，当细胞在该表面生长后，一般形成两种形态，即成纤维样细胞型或上皮样细胞型 悬浮细胞：悬

3、浮状态生长，如淋巴细胞、Namalwa细胞 兼性贴壁细胞：中国仓鼠卵巢细胞、小鼠L929细胞 二、动物细胞的化学组成和代谢二、动物细胞的化学组成和代谢 动物细胞的化学组成：无机成分如水和无机盐；有机成分，如蛋白质、糖类、脂质和核酸 动物细胞的代谢：糖，脂肪和蛋白质的代谢分为三个降解阶段（大分子降解为小分子，小分子代谢产生三个主要的中间产物，中间产物进入三羧酸循环） 细胞的分裂周期长：一般为12-48h 细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象 正常二倍体细胞的生长寿命是有限的：时间长短决定于细胞来源的种族和年龄 三、动物细胞的生理特点三、动物细胞的生理特点 动物细胞对周围环境十分敏感：对各种物理

4、化学因素的变化耐受力弱 动物细胞对培养基的要求高 动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同第三节第三节 生产用动物细胞的要求和获得生产用动物细胞的要求和获得一、生产用动物细胞的要求一、生产用动物细胞的要求 只有从正常组织中分离的原代细胞才能用来生产生物制品，如鸡胚细胞，兔肾细胞等 二倍体细胞，即使经多次传代也可用于生产，如WI-38，2BS细胞等 用异倍体传代细胞生产重组基因产品，如t-PA、EPO、因子等二、生产用动物细胞的获得二、生产用动物细胞的获得 原代细胞：直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化而获得的细胞悬液。如鸡胚细胞、原代兔肾或鼠肾细胞、淋巴细胞等 用原代细胞生产生物制品常

5、需要大量的动物，费钱费劳力 二倍体细胞系：原代细胞经过传代、筛选、克隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株 由于该类细胞寿命有限，一般从动物的胚胎组织中获取。如WI-38、MRC-5、2BS等 转化细胞系：通过某个转化过程形成的细胞，常常由于染色体的断裂变成了异倍体，失去了正常细胞的特点，而获得了无限增殖的能力 自发转化，人工转化，直接从动物肿瘤组织中建立的细胞系。如Namalwa、CHO、BHK-21、Vero细胞等 融合细胞系：细胞融合指两个或两个以上的细胞合并成一个细胞的过程 融合方法：仙台病毒融合法、聚乙二醇融合法、电融合法 重组工程细胞系三、基因工程细胞的

6、构建和筛选三、基因工程细胞的构建和筛选 真核细胞基因表达载体的构建 病毒载体：如牛痘病毒、腺病毒、反转录病毒和杆状病毒等 质粒载体：穿梭质粒载体 基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选 磷酸钙沉淀法和电穿孔法 用HAT (次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶) 选择系统，筛选tk+、hgprt+的转化细胞；用G418 (geneticin) 选择系统，筛选neor的转化细胞；用MTX选择系统，筛选dhfr+的转化细胞四、常用生产用细胞的特性四、常用生产用细胞的特性 BHK-21细胞、C127细胞、CHO-K1细胞、COS细胞、MDCK细胞、MRC-5细胞、Namalwa细胞、sf-9细胞、Vero细

7、胞、WI-38细胞、鼠骨髓瘤细胞、SP2/0-Ag14细胞五、细胞库的建立五、细胞库的建立 按我国和美国FDA的规定，用于生产的工程细胞必需建立两个细胞库：原始细胞库（master cell bank，MCB）和生产用细胞库（manufacturers working cell bank，MWCB）或称工作细胞库（working cell bank，WCB）第四节第四节 动物细胞的培养条件和培养基动物细胞的培养条件和培养基 培养成功必备条件培养成功必备条件 所有的与细胞接触的设备、器材和溶液，都必须保持绝对无菌，避免细胞外微生物的污染 必须有足够的营养供应，绝对不可有有害的物质，避免即使是极微

8、量的有害离子的掺入 保证有适量的氧气供应 需要随时清除细胞代谢中产生的有害产物 有良好的适于生存的外界环境 及时分种，保持合适的细胞密度 器材的清洗和消毒 水质 pH：动物细胞培养的最适pH为7.2-7.4，低于6.8或高于7.6时会对细胞产生不利影响，严重时可引起细胞退变甚至死亡一、动物细胞的培养条件一、动物细胞的培养条件 渗透压：290-300mOsm/kg。一般采用加减NaCl的办法调整培养液的渗透压 温度：动物细胞特别是哺乳动物细胞的最佳培养温度为(37士0.5)，而昆虫细胞则为27 空气：动物细胞在体内的生存条件一般都低于空气中氧的饱和值的60% 天然培养基：细胞培养早期阶段多采用这

9、类培养基，如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液、羊水、腹水等 缺点：成分复杂，组分不稳定，来源有限，不适于大量培养和生产的需要二、动物细胞培养基的种类和组成二、动物细胞培养基的种类和组成 l950年Morgan等配制成了第一个合成培养基-199培养基。现有BME、MEM、DMEM、HAM F12、RPMI1640、ISOCOV、199和McCoy5A等 成分：氨基酸、维生素、糖类、无机盐、其他成分（小牛血清或胎牛血清） 优点：成分明确，组分稳定，可大量生产合成培养基合成培养基 提供有利于细胞生长增殖所需的各种生长因子和激素 提供有利于细胞贴壁所需的贴附因子和伸展因子 提供识别金属、激素、维生素和

10、脂质的结合蛋白 提供细胞生长所必需的脂肪酸和微量元素 提供良好的pH缓冲系统小牛血清小牛血清或或胎牛血清胎牛血清 提高了细胞培养的可重复性，避免了由于血清批次之间差异的影响 减少了由血清带来病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险 供应充足、稳定 细胞产品易于纯化 避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性 减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于对实验结果的分析无血清培养基无血清培养基 无血清培养基：合成培养基+不同种类的添加剂 添加剂：激素和生长因子、结合蛋白、贴附和伸展因子、其他有利于细胞生长的因子和元素第五节第五节 动物细胞培养的基本方法动物细胞培养的基本方法一、细胞分离一、细胞分离 离心分离

11、法：主要用于从含有细胞的体液如血液、羊水、胸腹水中分离细胞 消化分离法：先从生物体取来组织块，将其剪碎，并用消化液将其消化，使组织松散成细胞悬液，然后用缓冲液洗涤、离心、去除残留的消化液而获得所需的细胞 常用的消化物：胰蛋白酶（trypsin）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、或胰酶-柠檬酸盐、胰酶-EDTA联合使用、胶原酶（collagenase）、链霉蛋白酶（pronase）、木瓜蛋白酶（papain）等二、细胞计数二、细胞计数 自动细胞计数器计数 血球计数板计数 结晶紫染色细胞核计数法 MTT染色计数法 一般来说，二倍体只能传

12、40-50代，而异倍体细胞可无限制地进行传代 悬浮细胞的传代：加入一倍或几倍的生长液，然后分种两只或多只培养瓶即可 贴壁细胞的传代：先消化再分种三、细胞传代三、细胞传代四、细胞的冻存和复苏四、细胞的冻存和复苏 细胞的冻存：采用液氮低温（-196）冻存；加保护剂如甘油和二甲基亚枫；冷冻速度以1/min的速度下降为宜 细胞的复苏：快融第六节第六节 动物细胞大量培养的方动物细胞大量培养的方法和操作方式法和操作方式一、动物细胞大规模培养的方法一、动物细胞大规模培养的方法 悬浮培养（suspension culture） 贴壁培养（anchorage-dependent culture） 贴壁-悬浮培养

13、：微载体培养（microcarrier culture）、包埋和微囊培养和结团培养悬浮培养悬浮培养 悬浮培养：让细胞自由地悬浮于培养基内生长增殖 优点：操作简便，培养条件比较均一，传质和传氧较好，容易扩大培养规模，在培养设备的设计和实际操作中可借鉴许多有关细菌发酵的经验 缺点：细胞体积较小，较难采用灌流培养(perfused culture)，因此细胞密度一般较低 贴壁培养贴壁培养 贴壁培养是必须让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法 优点：适用的细胞种类广，较容易采用灌流培养的方式使细胞达到高密度 缺点：操作比较麻烦，需要合适的贴附材料和足够的面积，培养条件不易均一，传质和传氧较差贴壁贴壁

14、- -悬浮培养（假悬浮培养）悬浮培养（假悬浮培养） 微载体培养：1967年荷兰van Wezel 采用葡聚糖 Sephadex A50 微小颗粒培养贴壁细胞成功，开创了微载体细胞培养 军事医学科学院、华东理工大学和中国科学院化工冶金研究所等单位制备成功一批葡聚糖类（MC-1型、CT-1型、CT-3型）、聚苯乙烯类（SH-2型、PS-1型）和胶原类（GT-2型）等微载体 微载体培养的优点：既可创造相当大的贴附面积供细胞贴附生长增殖，满足绝大多数细胞的基本要求，又由于载体体积很小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由地悬浮在培养基内，充分发挥了悬浮培养的一切优点 理想微载体需具备的条件 从固体微

15、载体发展到多孔微载体（porous microcarrier）或多孔微球：极大增大了供细胞贴附的比表面积，同时适用于悬浮细胞的培养 包埋和微囊培养：细胞被包埋或包裹在凝胶载体或徽囊内。微囊培养由包埋培养衍生而来，即将包埋的颗粒经液化处理而成为微囊 用于包埋细胞的载体材料：人工合成的高分子聚合物（如聚丙烯酰胺、环氧树脂、聚氨基甲酸酯、聚乙烯醇等）、糖类（如纤维素、琼脂、琼脂糖、K-卡拉胶、海藻酸钙、脱乙酰几丁质等）、蛋白质（如胶原、明胶、纤维蛋白等 ） 包埋或微囊培养法的优点：包埋或包裹在载体或微囊内的细胞可获得保护，避免了剪切力的损害。可以获得较高的细胞密度，一般都在107-108个/ml以上

16、。当控制微囊膜的孔径后，可使产品浓缩在微囊内，从而有利于下游产物的纯化。可采用多种生物反应器进行大规模培养，如搅拌罐式生物反应器，气升式反应器等 结团培养：1980年Tolbert首创，该方法用细胞本身作为基质，相互贴附后，再用悬浮的方法进行培养 优点：操作简便，节省了用于微载体的成本 二、动物细胞培养的操作方式二、动物细胞培养的操作方式 分批式操作 补料-分批（或流加式）操作 半连续式操作 连续式操作 灌流式操作 分批式操作分批式操作 一种将细胞和培养基一次性加入反应器内进行培养，此后细胞不断增长，产物不断形成和积累，最后将条件培养基，即经培养已含有细胞产物的培养基，或连同细胞一并取出，结束

17、培养 另一种先将细胞和培养基加人反应器，待细胞生长至一定密度后，往反应器内加入诱导剂或病毒等，经一段时间作用后，将反应物取出半连续式操作半连续式操作 定义：当细胞和培养基一起加人反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，取出部分培养物，或单纯是条件培养基，或连同细胞、载体一起，然后补充同样数量的新鲜培养基，或另加新鲜载体，继续培养 半连续式操作在动物细胞培养和药品生产中被广泛采用 优点：操作简便，生产效率高，可长时期进行生产，重复收获产品，而且可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平灌流式操作灌流式操作 定义：当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部

18、分条件培养基取出，同时不断地补充新鲜培养基 灌流式操作是近代用动物细胞培养生产各种药品最受推崇的方式 优点：细胞可处在较稳定的良好环境中，营养条件较好，有害代谢废物浓度较低。可极大地提高细胞密度，一般都可达107-108个/时，从而极大地提高了产品产量。产品在罐内停留时间缩短，可及时收留在低温下保存，有利于产品质量的提高。培养基的比消耗率较低，加之产量质量提高，生产成本明显降低第七节第七节 动物细胞生物反应器动物细胞生物反应器生物反应器必备条件生物反应器必备条件 制造生物反应器所采用的一切材料，尤其是与培养基、细胞直接接触的材料，对细胞必须是无毒性的 生物反应器的结构必须使之具有良好的传质、传

19、热和混合的性能 密封性能良好，可避免一切外来的不需要的微生物的污染 设备成本尽可能低 对培养环境中多种物理化学参数能自动检测和调节控制，控制的精确度高，而且能保持环境质量的均一 可长期连续运转 容器加工制造时要求内面光滑，无死角，以减少细胞或微生物的沉积 拆装、连接和清洁方便，能耐高压蒸汽消毒，便于操作维修一、生物反应器的类型及其基本结构一、生物反应器的类型及其基本结构 搅拌罐式生物反应器 气升式生物反应器 透析袋或膜式生物反应器 中空纤维生物反应器 固定床或流化床式生物反应器二、生物反应器的检测控制系统二、生物反应器的检测控制系统 培养过程中需检测的物化参数：温度、pH、搅拌速度、溶氧；活细

20、胞数，氨基酸浓度分析、葡萄糖、乳酸和氨离子的测定；细胞的群体倍增时间、细胞的比增长率、葡萄糖消耗率、乳酸产率、生物反应器生产率等 主要参数的检测和控制方法：在线经传感器检出，取样离线检测第八节第八节 动物细胞产品的纯化方动物细胞产品的纯化方法和质量要求法和质量要求下游纯化工作费钱、难度大下游纯化工作费钱、难度大 工程细胞表达的产品，常常和细胞内容物、培养基成分，特别当采用有血清培养基时小牛血清中的各种蛋白成分都将与产物混杂在一起，这些成分的物化性质常常和目的产物非常相似，因此很难将它们分离开 由于产品多数用于人体，为防杂质对人体的有害作用，对产品的纯度要求很高 大多数动物细胞表达的产物产量低、

21、生物活性很不稳定，因此要求纯化过程中所有的操作都应该非常温和、精细，包括溶液的温度、pH和盐离子强度等都需要严格控制，要有相当精密的设备和检测仪器 由于细胞产品多种多样，它们的氨基酸组成、结构、相对分子质量大小和等电点等都不尽相同，因此分离纯化技术的通用性差，必须根据每一种产品的特点研究开发出适合于该产品的专用的分离纯化技术一、动物细胞产品常用的纯化方法一、动物细胞产品常用的纯化方法 离心、超滤、透析 酸处理、盐析或有机溶剂沉淀 凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、高压液相色谱二、动物细胞产品的质量要求二、动物细胞产品的质量要求对工程细胞的要求： 有细胞系的历史资料 有细胞特性的资料 无细菌、真

22、菌、支原体和各种病毒，包括反转录病毒等外来有害因子的污染生产工艺（细胞培养和纯化工艺）的要求 对生产厂房、原材料和试剂的要求 对细胞培养的要求 对纯化过程的要求 对产品的质量要求：产品纯度、产品生物活性、产品比活性，产品蛋白质性质的鉴定，产品中杂质的检测，产品的稳定性，产品临床前的安全性和有效性评价，产品临床试验的安全性和有效性评价第九节第九节 动物细胞制药的前景与展望动物细胞制药的前景与展望一、改进表达载体，提高表达水平和产一、改进表达载体，提高表达水平和产量量 采用更强的启动子和增强子 更好地利用扩增系统或寻找高表达位点 采用和改造更好的宿主细胞二、利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本

23、二、利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本 采用代谢工程改造工程细胞 代谢工程（metabolic engineering），即采用基因工程的手段，使工程细胞增加或减少某种酶，改造它的代谢能力和途径，使其降低对某些营养物质的需要，减少某些代谢产物的产生和危害，以及控制工程细胞的增殖速度和制造产品的能力 改进培养工艺，降低生产成本 优化培养工艺三、抑制细胞凋亡，延长培养周期三、抑制细胞凋亡，延长培养周期 细胞凋亡：一种由遗传基因决定的程序性细胞主动死亡 防止细胞培养过程中细胞凋亡的三种措施：通过培养基和氧的优化供应防止营养和氧的缺乏；用化学添加剂如抗氧化剂等阻断细胞凋亡过程；采用抗细胞凋亡基因

24、改造工程细胞 Simpson等将TB/C3细胞稳定转染bcl-2后，细胞活力增强，抗体滴度上升 Itoh等发现转染了bcl-2的2E3细胞，其抗体生产能力比未转染细胞提高了4倍 Huang等实验表明，当共表达bag-1和bcl-2基因时，可产生相同的或协同的抗细胞凋亡作用四、采用糖基化工程，提高产品质量四、采用糖基化工程，提高产品质量 蛋白质有两种糖基化方式：N-糖基化和O-糖基化。O-糖链对蛋白质特性影响不大，N-糖链的不同对产品可产生较大的影响 决定糖链类型的主要因素：合成肽链的不同、细胞内糖基化酶的不同、细胞培养环境的影响 糖基化工程(glycosylation engineering)

25、，即用基因工程的手段，人为地改变肽链结构、增加某些酶基因以及改进和控制某些培养条件等，以达到正确糖基化的目的 Fusseneger等报道在t-PA基因中进行点突变，改变一个氨基酸，使之增加一个糖基化位点，此时t-PA在血浆中的清除率，较原先的t-PA减少了10多倍 Minch等将t-PA与-2,6-唾液酸转移酶基因共转染CHO细胞，表达的t-PA糖基化与人类的接近 Lamotte等将-干扰素基因与-2,6-唾液酸转移酶基因共转染CHO细胞，结果-干扰素中-2,6-唾液酸化程度较对照提高了68%(不加丁酸钠)和82%(加丁酸钠) 五、转基因动物的研究五、转基因动物的研究 1982年Palimit

26、er等首次提出用转基因动物来生产药用蛋白。现有1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶和蛋白C 等多种产品 优点：产量高、成本低、产品质量基本上与天然的一样 转基因的方法还不十分成熟，现有高效载体不多，整合位置随意性很大，因此成功率较低 转基因动物的健康问题：基因产品对动物的健康影响；产品对人体的健康影响转基因动物的问题转基因动物的问题六、组织工程的研究六、组织工程的研究 组织工程：通过对细胞的大量培养，并用细胞直接作为一种治疗手段用于临床，或用培养的细胞进一步加工构成一种组织，如人造皮肽、人造肝脏、人造胰腺、人造血管和人造骨等，并用于临床治疗 人造皮肤已被广泛用于烧伤患者的植皮中 Brugger等在体外培养CD34细胞，输入患者的效果与非培养的细胞相同 Williams等用无血清培养基，加入人血白蛋白和细胞因子PIXY321，扩增的细胞中以粒细胞为主，用于患者后未发现毒性，而重新组成的血相与历史资料对照一样或更快 人造肝脏的研究 人造胰腺的研究（用微囊培养胰岛细胞和用膜管培养胰岛细胞） 人造血管的研究：仅美国一年血管手术就超过350,000起，需要做冠状动脉