蛋白质分子设计

1、蛋白质分子设计引言蛋白质是一类非常有用的物质，在生物体的进化过程中起着非常重要的作用。与其它化学试剂比拟：1分子量非常大；2在机体内稳定；3专一性的优劣。分子生物学的开展弥补了上述缺点，如定位突变、PCR使蛋白质可能工程化生产。蛋白质设计蛋白质的结构、 功能预测涉及多学科的交叉领域， 包括材料学、化学、生物学、 物理及计算机学科。其应用范围涵盖了药物、食品工业中的酶、污水处理、疫苗、化学传感 器等，设计的蛋白质也不仅仅限于20种天然氨基酸，也包括非天然氨基酸、 有机/无机模块。蛋白质设计的目的：1为蛋白质工程提供指导性信息；2探索蛋白质的折叠机理。蛋白质设计分类：1基于天然蛋白质结构的分子设计

2、；2蛋白质从头设计。存在问题：与天然蛋白质比拟：1缺乏结构独特性；2缺乏明显的功能优越性。第一节 基于天然蛋白质结构的分子设计一、概述蛋白质结构与功能的认识对蛋白质设计至关重要，需要多学科的配合。 蛋白质设计循环如下：1.对要求的活性进行筛选。2.对蛋白质进行表征，如测定序列、三维结构、稳定性及催化活性。3.专一型突变产物。4.计算机模拟。5.蛋白质的三维结构。在PDB中搜索，无纪录即进行X射线、NMR方法或预测并构 建三维结构模型。6.蛋白质结构与功能的关系。蛋白质突变体设计的三个主要步骤：1.突变位点和替换氨基酸确实定。1确定对蛋白质折叠敏感的区域。2功能上的重要位置。3其它位置对蛋白质突

3、变体的影响。4替换或加减残基对结构特征的影响。2.能量优化和蛋白质动力学方法预测修饰后蛋白质的结构。3.预测结构与原始蛋白质结构比拟，预测新蛋白质性质。上述设计工作完成后，再进行蛋白质合成或突变实验，别离、纯化并对新蛋白质定性。二、蛋白质设计原理1.内核假设。假设蛋白质独特的折叠形式主要由蛋白质内核中的残基相互作用决定。所谓内核指蛋白质在进化过程中的保守区域，由氢键连接的二级结构单元组成。2.所有蛋白质内部都是密堆积且没有重叠。3.所有内部的氢键都是最大满足的(主链和侧链)。4.疏水和亲水基团需要合理地分布在溶剂的可及与不可及外表。分布代表了疏水效应的主要驱动力。要在原子水平上区分疏水和亲水局

4、部；外表安排少许疏水基团、 内部安排少许荣水基团。5.金属蛋白质中配位残基的替换要满足金属配位几何。6.对于金属蛋白，围绕金属中心的第二壳层的相互作用是最重要的。金属的第二壳层通常涉及蛋白主链的相互作用，有时也参与同侧链或水分子的相互作用。这些相互作用符合蛋白质折叠的热力学要求；氢键固定在空间的配位位置。7.最优的氨基酸侧链几何排列。蛋白质侧链构象决定于立体势垒和氨基酸的位置。8.结构及功能的专一性。三、蛋白质设计中的结构一功能关系研究蛋白质的序列、三维结构、热力学与功能性质之间的关系对蛋白质工程、蛋白质设计非常重要。选择突变残基，最重要的信息来自于结构特征。通过定位突变鉴定蛋白质功能残基、探

5、讨作用机理。这些研究为研究蛋白质一蛋白质相互作用、酶催化的本质提供理论根底，也为蛋白质 工程和蛋白质设计提供理论依据，也可用于药物开发。定位突变技术分类为对一个或多个氨基酸进行：(1)插入；(2)删除；(3)替换。功能上的分析：最重要的是数据的解释。所有突变检测中共同存在的困难在于：如何区别功能残基替换引起的效应及蛋白质构象变化引起的效应？对于三维结构未知的蛋白质，这个问题特别严重：(1)不能确定残基的立体位置；(2)残基所处的周围环境不确定；(3)残基对溶剂的暴露程度；(4)残基间的相互作用。目前的检测方法：(1)在某些情况下，溶解度与突变蛋白质的稳定表达可作为结构整体性的一种标志。因为突变

6、可能破坏蛋白质的球形整体结构，引起蛋白质失活、不溶性以及在细胞种降解。 突变引起的结构变化可通过蛋白质种引进另一种突变来检测。这种多重突变中单一突变是有加性的，偏离这个规那么说明残基间相互作用引起构象的变化。(2)热力学分析 可用于测量突变蛋白质的热稳定性及化学变化自由能，并可作为构 象整体性的检测。(3) X射线晶体学及NMR谱 可直接提供突变蛋白质的高分辨率结构及评估结构整 体性。(4)圆二色散方法用于分析突变体结构。(5)单克隆抗体利用分析一系列构象灵敏的McAb的结合能力可以探测突变蛋白的 构象变化。(一) 根据结构信息确定残基的突变对于三维结构已经确定、并抑制剂、辅酶及受体的三维结构

7、的蛋白质，根据氨基酸来推测专一性残基的功能作用的方法非常有效。残基一配体上的受体基团间的距离、 取向决定它们之间形成的氢键、 离子对或疏水相互作用。 这样的残基通过定为突变取代后， 能证 实某一残基对键合过程的参与、每一个相互作用对复合物结构的奉献。例：酪氨酸一tRNA合成酶(图24)。过渡态稳定性的说明。底物专一性的认识。蛋白质三维结构指时对突变设计谋略的帮助。二其他实验方法鉴定功能残基随机突变、删除分析及连接段扫描分析linker scanning mutagenesis 等实验方法可鉴 定功能残基。1随机突变技术：优点：用一种简单方法就可以产生突变体。缺点：对突变没有控制；必须进行大量的

8、突变产生大量的可解释数据。2删除分析及连接段扫描分析涉及整个基因位置删除或插入小数目的核昔酸，通过重组DNA技术很容易构建。原理：利用能识别序列内的多重位点的限制酶可以局部降解基因，并别离得到在单一位点被切断的线性片段。为了进行分散插入小的合成DNA片段，常常编码一个有限位点的片段linker ,可以把它配位到断开位置。 为了建立分散删除， 在重新配位形成之前用外核 酸酶降解DNA ,目的是快速扫描编码序列的长度以及鉴定重要功能区域，然后可进行单一 氨基酸替换的更仔细的分析。扫描删除分析曾用于鉴定鼠和人的粒状白细胞大噬菌体激活因子GM-CSF的重要区域。GM-CSF的功能是刺激造血细胞的增值。

9、 通过突变在5个氨基酸里删除3个，再在E.coli表达及检测活性。三利用蛋白质同源性鉴定功能残基每个残基所起作用的信息来自不同原蛋白质的序列比拟或一类具有相应活性的蛋白质 的序列比拟。同源蛋白质的保守的残基是保持那类蛋白质共同功能或是维持共同结构的关键 因素。相反，在一类蛋白质内变化的残基看来对结构及功能不重要，但涉及在分子识别中起作用的专一性。这两个假设已用于指导位点突变分析蛋白质。缺点：不能确定效应有突变引起还是结构的微小变化引起。解决方法：减少结构的破坏。要求：预先尽可能多了解蛋白质的结构、进化保守及生物化学信息X-射线、NMR结 构信息，特别是蛋白质分配体或底物形成的复合体的结构信息、

10、原子水平上结构与活性的关系及分子相互作用等。突变策略：结构并可进行序列对准的突变，使用不同二级结构单元的转换，如“loop-交换。一组同源蛋白质同感兴趣的蛋白质比拟，鉴定出高度保守的残基，它们是突变、功能 进化的很好的候选残基；而非保守残基即涉及每个蛋白质的独特功能。如底物、专一性。优点：转换的序列与蛋白质的整体结构协调，突变对结构破坏少。四、天然蛋白质的剪裁分子剪裁：在天然蛋白质的改造中替换1个肽段或一个结构域。反平行四螺旋束Rop重新设计的成功例子。Lm Rop与Wt Rop类似地折叠证实了蛋白质设计原理中的内核假设。蛋白质结构对残基的替换有一定的容忍度，即结构与功能有一定的稳健度。不同的

11、氨基酸序列具有相近的设计结构。第二节全新蛋白质设计一、引言概念：反折叠研究：根据所希望的蛋白质结构及功能设计序列，从相反的方向了解决定蛋白 质结构及功能的根本物理、化学规律及蛋白质折叠过程与步骤。全新蛋白质合成属于另一类蛋白质工程，它合成具有新奇的结构及功能的蛋白质。选择序列的方法： 生物进化；全新蛋白质设计。全新蛋白质设计包括从头结构设计和从头功能设计。二、蛋白质结构的从头设计中心问题：设计一个具有稳定基独特的三维结构的序列。根本障碍：线性聚合链的构象痼。RTln101oo=568.48kj/mol。策略：1使相互作用的强度与数目到达最大。2通过共价交叉连接减小折叠的构象痼。根据第一原理设计

12、一个蛋白质，我们必须依赖于分析结构的天然蛋白质中的二级结构单元，例如螺旋、6叠片、环以及转折，得到一些结构知识，这些知识涉及氨基酸形成二及结构的倾向性等。 对于螺旋已有很好的认识，近来重点研究二级结构在三维空间形成的独特的构象通过长程相互作用可控形成超二级结构。螺旋合成、3折叠、3 3模块形成规律较清楚，设计合成成功率较高。复杂的三级折叠和四级结构可分解为有效的二级结构单元，如：螺旋、折叠、串、转 角通过loop连接为三级结构。对蛋白质结构和稳定性很好的认识，在蛋白质设计中可安排残基的最大的疏水相互作用形成一个紧密的疏水内核。离子相互作用与氢键可进一步稳定蛋白质的结构。另一种途径是根据主链的构

13、象限制设计二级结构。全新蛋白质设计的策略：1.1.二级结构模块单元的自组装最简单、最直接的策略：合成单一的两亲性的二级结构单元a螺旋、6折叠作为多 肽链的片段模块，然后复制这些片段并把它们连接位整个蛋白质结构。疏水外表埋藏在内核形成紧密的蛋白质结构中。模块方法的特点：1它是最简单的。2容易合成。与单链天然类蛋白质比拟，缺点：1蛋白质的稳定性差。2结构的简单重复。a螺旋通过氢键到达结构稳定，单一a螺旋在溶液中是稳定的。螺旋设计使用的策略：1使用大的、能形成螺旋倾向的残基，如Leu/Glu/La等。2使用适宜的基团去除端基的电荷，防止与螺旋偶极不适宜的电荷相互作用。3使用极化或荷电氨基酸引入稳定的

14、氢键或在螺旋中相隔一圈残基间的例子相互作 用。4使用在螺旋中相隔一圈的残基间疏水的范德华相互作用。5使用芳香-荷电或芳香-硫的相互作用。最简单的在自然界中观察到的a螺旋结构是coiled-coil及四螺旋束。这些结构在全新蛋白质领域首次通过模块方法设计成功。Degrad。的工作：四螺旋束被成功应用于n螺旋束的设计中。不适宜的构象痼由非共价相互作用氢键、电荷 -电荷、疏水相互作用补偿。两亲螺 旋的聚集主要是基于疏水相互作用提供足够的结合能去驱动折叠平衡。不适宜的折叠痼的作用在实践中逐步由结合足够数目的疏水残基所克服。Coiled-coilCoiled-coil 模型体系：由2-4个a螺旋彼此以平

15、行或反平行堆积在一起，螺旋的交叉角接近20。Hodges的工作：设计7肽重复组成的Coiled-coil及其特征。图2-8途中序列设计要求同时稳定a螺旋二级结构、双条螺旋间的相互作用。设计合成：(1)考虑疏水界面、离子间相互作用。结果合成的结构比天然结构更稳定。(2)长度：至少含有29个残基才能自由组装成Coiled-coil。(3)二聚界面改变疏水接触的影响。(4)两个a螺旋之间增加一个二硫桥，加强了稳定性。(5)二硫桥对Coiled-coil结构稳定性的加性效应。Oshea的工作：异二聚体Coiled-coil的从头设计。结论：(1)分子间盐桥可稳定复合物结构。(2)形成异二聚体的倾向大于

16、均二聚体10万倍。纯化肽表征、pH、离子强度。实验结果证明：残基的接触决定Coiled-coil的寡聚态。四螺旋束模型体系：Degrado的工作：16残基的两亲螺旋，组装依赖于浓度。& 1、也2、也4的稳定性比拟。Chin的工作：78肽螺旋Coiled-coilCoiled-coil 与四螺旋束的比拟：(1)都有两亲螺旋。(2)疏水面的宽窄。3折叠片蛋白的研究目前的研究集中在转折序列的设计，研究折叠协同作用及整体的稳定性。 转折具有形成6折叠片的高倾向性，也具有聚集的倾向。对于模块设计，什么特征是最根本的？是否有设计形成二级结构及自组装肽的一般规 律？(1)自组装主要涉及疏水相互作用，

17、设计的序列必须是两亲性的。极性和非极性的残 基的周期性对二级结构的形成及自组装起着决定作用。如：a螺旋形成者组成的序列，极性 /非极性周期为2,形成自组装的6折叠。6形成者组成的序列，极性/非极性周期为3, 4,那么形成a螺旋。2.2. 配体诱导组装第二个策略是使用一个配体(如金属离子)诱导模块蛋白片段的合成。在蛋白结构中几个相互作用片段的界面处设计一个配位结合位点，如果这个位点对配体有很高的亲和力，那么结合配体的适宜的自由能将充分克服痼消耗并驱动肽自组装。例：Lieberman和Sasaki的Fe( n)诱导组装15肽 两亲a螺旋 双毗嚏Ghadiri的Ni( n)、Co( n )、Ru(n

18、 )的优到组装15肽 两亲a螺旋 双毗嚏3.3. 通过共价交叉连接实现它的自组装肽链的构象痼是涉及全新蛋白质的主要障碍，共价交叉连接可减少构象痼。自然界唯一用于交叉连接的方法是二硫键。在蛋白质设计中也使用其它方法。如Richardson,Erickson等 在Betabillin的设计中使用称为DAB的新的交叉连接方法。不使用二硫键和人工连接片段的方法：赖氨酸的侧链基团，谷氨酸、天冬氨酸的侧链愈酸彼此间能形成肽键。缺点：导致枝杈结构。优点：链交叉连接限制了链彼此间的位置，因而减少了形成独特结构的痼消耗。4.4. 在合成模板上肽的组装Mutter研究组开展了模板组装合成蛋白(TASPs)方法。不

19、使用天然蛋白质中的turn和loops连接二级结构单元，而用人工模块。a螺旋和。折叠股在一个特殊折叠过程有一个正确的相对取向。TASP分子的螺旋和股通过模板结构导向形成所希望的构象。他们使用的模板是寡肽，如：环十聚体。这个模板用于形成两个反平行6折叠股，通过一个在一端的Pro-Gly转折和一个在另一端的二硫键形成两个反平行的3折叠股。特点：(1)有一个环结构，因此构象因受到限制而较确定，残基侧链的取向也较确定。(2)每条肽链显示最低限度的浓度依赖关系，但是一旦连接到模板上，它们的结构倾向于稳定并且不依赖浓度。缺点：能模拟单链肽而不能模拟天然蛋白的性质。优点：TASP策略能模拟天然蛋白的关键性质

20、。Sasaki研究组使用吓咻作模板连接a两亲螺旋的4条复制序列得到的最终蛋白质Helichrome形成稳定的球形结构，而且具有酶活性。5.5. 线性多肽折叠为球状结构全新蛋白质设计追求的目标之一是不用模板或交叉连接而通过线性多肽折叠形成球形确实定的三维结构。把一个线性肽折叠形成独特的三维结构的主要障碍是构象痼，这需要精心设计一系列的相互作用才能稳定结构。这方面的工作已取得重大进展。第一个成功例子是Degrad。研究组完成的a4结构。最小化途径：把全新设计的复杂性简化为几个涉及天然蛋白稳定性的关键特征并优化。稳定也4的最重要的特征：也螺旋明显的两亲性；形成明显的疏水核。最小化途径的缺点：(1)结

21、构简单且有更多的重复局部；(2)重复的序列使结构易变难于精确测定；(3)缺少天然蛋白那样好的互补堆积。对a 4的修饰：用非极性侧链残基Val、Phe、Ile替代埋藏的残基赖氨酸，使之具有更多的构象限制、增加螺旋间堆积的立体互补性。引入一个金属结合位点可减少链内侧柔性。四螺旋束 FelixFelix 的设计：Hecht研究组完成。设计的目标：合成一个由不同侧链间特殊相互作用所稳定的独特的三维结构的类天然蛋 白。设计的特点：防止了简单的重复序列；四螺旋中每一条都不同；每条螺旋本身没有重复的片段；包括19种天然氨基酸。设计的优点：(1) 4条a螺旋均为两亲性。(2)引入二硫键：作用是减少并稳定构象痼

22、；它可探测第一条及第四条链 彼此间的取向。(3)结合了 “负设计的某些特征。设计的缺点：(1)不是非常稳定；(2)没有一个独特的很好堆积的疏水内核。构建的合成基因在E.coli中的表达的蛋白质结果：(1)谱学研究证明了Felix折叠成紧密的球形结构；(2)CD谱证明a螺旋在蛋白中占优势；(3)Cys11-Cys71二硫键的形成说明它们在三维空间结构上彼此靠近，第一条a螺旋 堆积靠近第四条a螺旋；(4)二硫键在分子内而不是在分子间；(5)荧光谱证明在位置15的色氨酸埋藏在小极性环境中；(6)色氨酸接近Cys11-Cys71二硫键。GorajGoraj 等设计的 OctarellinOctarel

23、lin ：为8股a / 3 barrel(丙糖磷酸异构酶)。结构单元是turn strand-turn- a helix。构建的合成基因在E.coli中的表达的蛋白质结果：(1)存在有序结构；(2)8次重复序列的蛋白处于一个紧密的球形折叠结构与尿素诱导的非折叠的协同-2态过渡态。QunnQunn 等设计的 BetadoubletBetadoublet 的6折叠蛋白质：设计的优点：(1)每一个转折以及大多数3折叠股中包含一个荷电残基；(2)含有由二硫键连接的两个一样的6折叠片；(3)构筑了疏水内核模型，并采用点外表可视化残基间的堆积；构建的合成基因在E.coli中的表达的蛋白质结果：(1)二级结

24、构中占优势的是6。(2)能够加热去折叠。6.6.基于组合库的全新蛋白质设计蛋白质组学包括天然蛋白质的多样性、相互作用、结构及功能。组合库设计的核心问题是埋藏疏水局部。一个常用的方法是基于极性与非极性的土元模式。土元模式要求(1)有利于形成二级结构；(2)埋藏疏水局部。土元模式可用于二级结构的片段，一面完全亲水，一面完全疏水。缺点是没有完全考虑内核的堆积。第二代二元编码蛋白库的优点：(1)由原来的74个残基改为104个残基；(2)对转折区域作了些修改；(3)最重要的修饰是4条螺旋中的每条加6个残基；结果：任取5个证明蛋白质是单体且螺旋程度很高；产生出类似天然蛋白质的全新蛋白。利用组合库寻找全新蛋

25、白质在如下方面取得了成功：a螺旋、6折叠片、单体、自组装为有序的排列、堆积为天然蛋白质、超热稳定性、结合辅因子自的能力、催化活性。三、蛋白质的功能设计功能设计主要涉及键合及催化。途径：(1)反向实现蛋白质与工程底物的契合，改变功能；(2)从头设计功能蛋白质。1.1. 通过反向拟合天然蛋白质设计新功能执行特别生物功能的天然蛋白质能通过反向拟合获得新的活性。通过修饰天然结构得到专一性及活性改变的蛋白质是切实可行的，并在DNA结合专一性、改变辅助因子专一性、底物专一性获得成功。(1)引入金属结合位点使金属一溶菌酶的活性均优于天然酶。(2)位点专一DNA裂解 螯合剂EDTA一序列专一的DNA裂解蛋白。

26、(3)通过改变抗体loop区免疫体系能产生性的结合专一性。2.2. 键合及催化的从头设计图2-22。3.3. 在全新蛋白质中引入结合位点a螺旋引入金属结合位点的设计：全新蛋白质设计除折叠成预想的结构，还要考虑结合位点和催化性质。Degrado和Regan研究组在a 4设计合成后，又进行了修饰使之具有金属蛋白结合位点一能结合Zn2+的四面体结合位点，并为催化活性留有余地。在大肠杆菌E.coli中表达的蛋白质表征：(1) Zn2+的解离常数为2.5X 10-8mol/L。(2)结合位点在单一蛋白质的单体内。(3)结合金属后蛋白质的二级结构没有改变，变为更为有序的结构。(4)结合Zn2+后增加了蛋白质的稳定性。(5)半胱氨酸疏基对结合是最重要的。3折叠片骨架引入金