多肽固相合成

1、发明英文解释：solid phase peptide synthesis简写为SPPS在肽合成的技术方面取得了突破性进展的是R.Bruce Merrifield,他设计了一种肽的合成途径并定名为固相合成途径。由丁R.BruceMerrifield在 肽合成方面的贡献，1984年获得了诺贝尔奖。下面给出了肽固相合成途径 的简单过程（合成一个二肽的过程）。氯甲基聚苯乙烯树脂作为不溶性的固相载体，首先将一个氨基被封闭基团（图中的X）保护的氨基酸共价连接在固相载体上。在三氟乙酸的作 用下，脱掉氨基的保护基，这样第一个氨基酸就接到了固相载体上了。然 后氨基被封闭的第二个氨基酸的埃基通过N,N,-二环己基

2、碳二业胺（DCC,Dicyclohexylcarbodiimide ）活化，埃基被DCC活化的第二个氨基酸再与已 接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就 生成了一个带有保护基的二肽。重复上述肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度。最后脱去保护基X,用HF水解肽链和固相载体之间的酯键，就得到了合成好的肽。固相合成的优点主要表现在最初的反应物和产物都是连接在固相载体 上，因此可以在一个反应容器中进行所有的反应，便丁自动化操作，加入 过量的反应物可以获得高产率的产物，同时产物很容易分离。化学合成多肽现在可以在程序控制的自动化多肽合成仪上进行。Merr

3、ifield成功地合成出了舒缓激肽（9肽）和具有124个氨基酸残基的核 糖核酸酶。1965年9月，中国科学家在世界上首次人工合成了牛胰岛素。固相合成法的诞生多肽合成研究已经走过了一白多年的光辉历程。1902年，Emil Fischer首先开始关注多肽合成，由丁当时在多肽合成方面的知识太少，进展也相 当缓慢，直到1932年，Max Bergmann等人开始使用节氧球基（Z）来保护氐氨基，多肽合成才开始有了一定的发展。到了20世纪50年代，有机化学家们合成了大量的生物活性多肽，包 括催产素，胰岛素等，同时在多肽合成方法以及氨基酸保护基上面也取得 了不少成绩，这为后来的固相合成方法的出现提供了实验和

4、理论基础。1963年，Merrifield首次提出了固相多肽合成方法(SPPS),这个在多肽化学上具有里程碑意义的合成方法，一出现就由丁其合成方便，迅速，成 为多肽合成的首选方法，而且带来了多肽有机合成上的一次革命，并成为 了一支独立的学科 一一固相有机合成(SPOS)。因此，Merrifield荣获了1984年的诺贝尔化学奖。Merrifield经过了反复的筛选，最终屏弃了节氧球基(Z)在固相上的使用，首先将叔丁氧球基(BOC)用丁保护a-氨基并在固相多肽合 成上使用，同时，Merrifield在60年代末发明了第一台多肽合成仪，并首次 合成生物蛋白酶，核糖核酸酶(124个氨基酸)。1972

5、年，Lou Carpin。首先将9-协甲氧球基(FMOC)用丁保护a-氨基， 其在碱性条件下可以迅速脱除，10min就可以反应完全， 而且由丁其反应条件温和，迅速得到广泛使用，以BOC和FMOC这两种方法为基础的各种肽自动合成仪也相继出现和发展，并仍在不断得到改造和完善。同时，固相 合成树脂，多肽缩合试剂以及氨基酸保护基，包括合成环肽的氨基酸正交 保护上也取得了丰硕的成果。多肽合成仪的介绍多肽合成仪的诞生虽然Merrifield在发明固相多肽合成科学并取得巨大成功的同时，使用了自主研发的合成设备，但却没因此将多肽合成仪引入市场。1970年，Beckman公司开发的全自动多肽合成仪Beckman

6、 990 Peptide Synthesizer作为第一台投入市场的科研用多肽合成仪，被美国多所大学的实验室采用。几乎同一时间,Vega Biotechnologies, Inc.公司开发出两款经济型多肽合成仪：Vega s Coupler 1000与Vega s Coupler 250(不久乂推出Vega s Coupler296),其将多肽合成后续的在线切割理念结合到设备中， 所有反应器 采用防爆玻璃材质，防止TFA的腐蚀。被当时的肽化学界称为最经济适用 的多肽合成仪。而今，Beckman与Vega s两家公司均停止的多肽合成仪的研发与制造， 而转向到更多面的化学合成、分离、检测技术设备的

7、研制产业中。多肽合成仪的发展第一代多肽合成仪是以Beckman公司推出的Beckman 990 PeptideSynthesizer以及Vega sBiotechnologies公司推出的Vega s296 Peptide Synthesizer为代表的，诞生在上世纪七十年代。虽然随着生产工艺的改进和发展，如今第一代多肽合成仪已全部退出 了市场。但1990年以前的众多肽化学文献都是在此实验设备上运行研发而 来，第一代的多肽合成仪为之后的合成仪研发与制造产生了重大意义。第二代多肽合成仪是以Protein Technologies公司推出的PS3 PeptideSynthesizer以及Advan

8、ced ChemTech公司推出的ACT peptide synthesizer Model 90为代表的，诞生在上世纪八十年代。此两款设备也是目前市场上 仍在销售的最早的多肽合成仪。PS3的设计原理是采用氮气鼓泡的反应方式来对反应物进行搅拌，即 合成仪上反应器是固定的，氮气从反应器的下方通过反应器到上部排出， 在这一过程中产生的汽泡把固相和液相混合起来。这样设计的好处是结构 简单，成本低，但反应相对温和：1）有时候多肽-固相载体在静电作用下会抱团”，使其不能与液相充分混合，在这种情况下需要调高氮气的压力以消除静电作用；而在静电作用消除后要把压力立刻调低，不然的话较高的压 力会把多肽-固相载体

9、 吹”到反应器液面上方。由丁多肽-固相载体具有较强的粘壁性，一旦被粘到反应器液面上方就再也无法下来，也就是无法再参 加反应。显然第一代机器是无法自动作这样的压力调整的，这就是造成反 应 死角”的重要原因。反应死角会降低多肽合成的效率和多肽的纯度，有的甚至造成合成的失败。2）长时间氮气鼓泡会使溶液挥发，液面降低后一部分多肽-固相载体就粘在液面上方，也无法再参加反应。3）氮气消耗量大，运行成本增大。ACT90的设计原理是反应器在直立下围绕原点作左右摆动，或者圆周 运动。ACT的多肽合成仪同样具有反应温和的特点，即转动角度与速度都 不能够完全达到氨基酸耦合的极限，反应往往需要更长的时间。第三代多肽合

10、成仪是以Applied Biosystems公司的ABI 433 peptidesynthesizer与C S Bio公司的CS336为代表的无死角多肽合成仪为代表的， 诞生在上世纪九十年代。ABI433的设计原理是反应器上方相对固定，而下方作圆周360度快速旋转，带动反应器里的固液两相从底部向上作螺旋运动，一直达到反应器 的最上方。换句话说，溶液可以达到反应器内部的任意点，真正做到了无 死角。由丁搅拌速率可达每分钟1800转的高速，反应得以充分完全。由丁无死角的搅拌方式保证的肽的合成纯度，ABI433型多肽合成仪（其退出多肽合成仪市场后最后一款仪器）至今在世界上还占有着很大的比例。当然,AB

11、I产品的售价也是最高的。由丁部件使用频率高，电磁阀会经常损坏， 而ABI将7个电磁阀做成模块化的设计，坏掉一个电磁阀必须要更换整个 模块，无形中增加了维修成本。CS336的设计原理是反应器中点为圆心，上下做180度旋转搅拌，搅拌速度可达180rpm,同时其采用了氮气鼓泡反应方式的优越性，将氮气吹 动作为可选反应方式融入反应方法中，多肽合成仪在科研领域的高耦合率 效果得到充分体现。多肽合成仪的现状进入二十世纪以来，各大合成仪制造公司相继推出了升级产品和新产品，如Protein Technologies公司推出Tribute双通道多肽合成仪，将 短信 通知”功能融入产品，增添了用户与设备之间的紧密

12、感，更加人性化；C S Bio公司对其从研发型到生产型设备的UV Online Monitor系统配置统一升级，用户可直观看到每一部氨基酸偶联反应的状态并可根据数据调整出最佳合 成效果与工艺；Advanced ChemTech公司自2005年破产重组后分裂为两家 新公司，其中Aapptec延续了其前身的生产步骤，推出Focus XC三通道合 成仪。美国另一家公司CEM以蛋白质有机反应设备的制造著称，推出了微波多肽合成仪同样可以合成简单的小分子多肽。其采用微波加热方式，大大提高了反应速度，将反应的速率增加到之前多肽合成仪的几倍甚至十几 倍。可惜的是在加热的情况下副反应也相应增多，多肽纯度不能与之

13、前的 第三代甚至第二代产品媲美。另外，微波加热方法无法放大，故不适合用作多肽药物的研发活化基团Fmoc与tBoc多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序一般从C端（埃基端）向N端（氨基端）合成。固相合成法，大大的减轻了每步产品提纯 的难度。为了防止副反应的发生，参加反应的氨基酸的侧链都是保护的。埃基端是游离的，并且在反应之前必须活化。固相合成方法有两种， 即Fmoc和tBoc。由丁Fmoc比tBoc存在很多优势，现在大多采用Fmoc法合成具体合成由下列几个循环组成：1.去保护：Fmoc保护的柱子和单体必须用一种碱性溶剂（piperidine） 去除氨基的保护基团。2.激活和交联：下一个

14、氨基酸的埃基被一种活化剂所活化。活化的单 体与游离的氨基反应交联，形成肽键。在此步骤使用大量的超浓度试剂驱 使反应完成。循环：这两步反应反复循环直到合成完成。3.洗脱和脱保护：多肽从柱上洗脱下来，其保护基团被一种脱保护剂（TFA） 洗脱和脱保护。树脂的选择及氨基酸的固定将固相合成与其他技术分开来的最主要的特征是固相载体，能用丁多肽合成的固相载体必须满足如下要求：必须包含反应位点 （或反应基团），以使肽链连在这些位点上，并在以后除去；必须对合成过程中的物理和化 学条件稳定；载体必须允许在不断增长的肽链和试剂之间快速的、不受阻 碍的接触；另外，载体必须允许提供足够的连接点，以使每单位体积的载 体给

15、出有用产量的肽，并且必须尽量减少被载体束缚的肽链之间的相互作 用。用丁固相法合成多肽的高分子载体主要有三类：聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯-乙二醇类树脂及衍生物，这些树脂只有导入反应基团，才能直接连上（第一个）氨基酸。根据所导入反应基团的不同， 乂把这些树脂及树脂衍生物分为氯甲基树脂、埃基树脂、氨基树脂或酰月并型树脂。BOC合成法通常选择氯甲基树脂，如Merrifield树脂；FMOC合 成法通常选择埃基树脂如王氏树脂。氨基酸的固定主要是通过保护氨基酸的埃基同树脂的反应基团之间形成的共价键来实现的，形成共价键的方法 有多种：氯甲基树脂，通常先制得保护氨基酸的四甲铉盐或钠盐、钾盐

16、、 饨盐，然后在适当温度下，直接同树脂反应或在合适的有机溶剂如二氧六 环、DMF或DMSO中反应；埃基树脂，则通常加入适当的缩合剂如DCC或埃基二咪口坐，使被保护氨基酸与树脂形成共酯以完成氨基酸的固定；氨 基树脂或酰月井型树脂，却是加入适当的缩合剂如DCC后，通过保护氨基酸与树脂之间形成的酰胺键来完成氨基酸的固定。氨基、蔑基、侧链的保护及脱除要成功合成具有特定的氨基酸顺序的多肽，需要对暂不参与形成酰胺 键的氨基和埃基加以保护，同时对氨基酸侧链上的活性基因也要保护，反 应完成后再将保护基因除去。同液相合成一样，固相合成中多采用烷氧球 基类型作为a氨基的保护基，因为这样不易发生消旋。最早是用节氧球

17、基，由丁它需要较强的酸解条件才能脱除，所以后来改为叔丁氧球基（BOC）保护，用TFA（三氟乙酸）脱保护，但不适用含有色氨酸等对酸不稳定的 肽类的合成。changMeienlofer和Atherton等人采用Carpino报道的Fmoc（9-协甲氧球基）作为a氨基保护基，Fmoc基对酸很稳定，但能用哌噬-CH2CL2或哌噬-DMF脱去，近年来，Fmoc合成法得到了广泛的应用。埃基通常用 形成酯基的方法进行保护。甲酯和乙酯是逐步合成中保护埃基的常用方法， 可通过皂化除去或转变为月井以便用丁片断组合；叔丁酯在酸性条件下除去； 节酯常用催化氢化除去。对丁合成含有半胱氨酸、组氨酸、精氨酸等带侧 链功能基

18、的氨基酸的肽来说， 为了避免由丁侧链功能团所带来的副反应，一般也需要用适当的保护基将侧链基团暂时保护起来。保护基的选择既要 保证侧链基团不参与形成酰胺的反应，乂要保证在肽合成过程中不受破坏， 同时乂要保证在最后肽链裂解时能被除去。如用三苯甲基保护半胱氨酸的S-,用酸或银盐、汞盐除去；组氨酸的咪哇环用2,2,2-三氟-1-节氧球基和2,2,2-三氟-1-叔丁氧球基乙基保护，可通过催化氢化或冷的三氟乙酸脱去。 精氨酸用金刚烷氧球基（Adoc）保护，用冷的三氟乙酸脱去。固相中的接肽反应原理与液相中的基本一致，将两个相应的氨基被保 护的及埃基被保护的氨基酸放在溶液内并不形成肽键，要形成酰胺键，经常用的

19、手段是将埃基活化，变成混合酸酎、活泼酯、酰氯或用强的失去剂 （如碳二业氨）形成对称酸酎等方法来形成酰胺键。其中选用DCC、HOBT或HOBT/DCC的对称酸酎法、活化酯法接肽应用最广。裂解及合成肽链的纯化BOC法用TFA+HF裂解和脱侧链保护基，FMOC法直接用TFA,有时根据条件不同，其它碱、光解、氟离子和氢解 等脱保护方法也被采用。合成肽链进一步的精制、分离与纯化通常采用高 效液相色谱、亲和层析、毛细管电泳等。HPLC分析和纯化分析HPLC使用柱子和泵系统，可以经受传递高压，这样可以用极细 的微粒（3-10H m）做填料。由此多肽要在几分钟内高度被分析。HPLC分两类：离子交换和反相。离子

20、交换HPLC依靠多肽和固相问的直接电荷相互作用。柱子在一定PH范围带有特定电荷衍变成一种离子体，而多肽或多肽混合物，由其氨基酸组成表现出相反电荷。分离是一种电荷相互作用，通过可变PH ,离子强度，或两者洗脱出多肽，通常，先用低离子强度的溶液，以后逐渐加强或一步一步加强，直到多肽从柱中洗脱出。离子交换分离的一个例子使用强阳离子交换柱。如sulfoethylaspartimide通过酸性PH中带正电来分离。反相HPLC条件与正常层析正相反。多肽通过疏水作用连到柱上，用 降低离子强度洗脱，如增加洗脱剂的疏水性。通常柱子由共价吸附到硅上 的碳氢烷链构成，这种链长度为G4-G8碳原子。由丁洗脱是一种疏水

21、作用。 大的疏水肽用短链柱洗脱好。然而，总体实践中，这两类柱互变无多少显著差别，别类载体由碳水化合物构成，比如苯基。典型的操作常由两绶冲剂组成，0.1%TFA-H2o和80% acetonitrile0.1%TFA-H2o稀acetonitrile。用线型梯变以每分钟0.5%到1.0%改变的速度混合。常见分析和纯化用柱为4.6 250mm（3- 10 H m）和22X 250mm（10卜m）.如果用径向填柱，那么大小是8X100 （3-10叩）和25 x 250mm（10卜m）。大量各种缓冲剂含许多不同试剂，比如heptafluorobutyric 酸，0.1%磷 酸，稀Heformic酸（5

22、-6%, pH2-4）, 10-100mM NH4HCO3,醋酸钠/氨，TFA/TEA,磷酸钠或钾，异戊酚。这样许多不同组合可形成缓冲剂，但要 注意一点：硅反相柱料不能长时间暴露丁高pH,甚至微碱pH,因为这样会破坏柱子。Fmob氨基酸的制备和侧链保护Fmoc基团是在有NaHCO3或Na2CO3存在的二氧六环溶液中，理想的Fmoc-氨基酸的侧链保护基应在碱性条件下稳定，在酸性条件下脱除侧链保护1.1. AspAsp和GluGluAsp和Glu侧链埃基常用t-Bu保护.可用TFA、TMSBr等脱除.但是用t-Bu保护仍有侧链环化形成酰业胺的副反应发生.近年来，发展了一些新的保护基如环烷醇酯、金刚

23、烷醇酯等可减轻这一副反应，这些保护基可用TMSOTf(三氟甲磺酸三甲硅烷酯)除去.2.2. SerSer、ThrThr和TyrTyrser、Thr的羟基及Tyr的酚羟基通常用t-Bu保护.叔丁基的引入比较麻 烦，首先ser制成节氧球基酯，再在酸催化下与异丁烯反应.Ser和Thr还可用节基保护，Ser用节醇引入节基、Thr用漠节引入节基.3.3. AsnAsn和GlnGlnAsn和Gln侧链的酰胺键在肽合成中一般不加以保护.但合成大肽时，Asn和Gln的a-埃基活化时可能会发生分子内脱氢反应生成袱基化合物.碱性时Gln的侧链可以环化生成酰胺 .而且不保护的Fmoc-Gln和Fmoc-Asn在DC

24、M中溶解度很差.为了避免这些问题，可以用9-咕吨基，2, 4, 6-三甲氧节基，4, 4甲氧二苯甲基或三苯甲基等保护，这四种基因均可用TFA脱除.4.4. HiHiHis是最容易发生消旋化的氨基酸，必须加以保护对咪哇环的非危N开始用节基(Bzl)和甲基磺酰基(TOS)保护.但这两种保护基均不太理想.TOS对亲核试剂不稳定，Bzl需要用氢解或Na/NHs除去，并且产生很大程度消旋.Boc基团是一个较理想的保护基，降低了咪哇环的 碱性，抑制了消旋，成功地进行了一些合成.但是当反复地用碱处理时，也表现出一定的不稳定性.哌噬球基在碱中稳定，但是没能很好地抑制消旋， 而且脱保护时要用很强的亲核试刘如.对

25、咪哇环 危N保护，可以完全抑制消旋，危N可以用节氧甲基（Bom）和叔丁氧甲基（Bum）保护，（Bum）可以用TFA脱除，Bom更稳定些，需用催化 氢解或强酸脱保护，Bum是目前很有发展前途的His侧链保护基，其不足之处在丁Fmoc（His）Bum在DCM和DMF中的溶解度较差.5.5. CyCyCys的SH具有强亲核性，易被酰化成硫酰，也易被氧化为二硫键， 必须加以保护.常用保护基有三类：一类用TFA可脱除，如对甲节基、对甲 氧节基和三苯甲基等；第二类可用（CF3CO）3T1 /TFA脱除，对TFA稳定.如t-Bu、Bom和乙酰胺甲基等.第三类对弱酸稳定，如节基和叔丁硫基（stBu）等，Cys

26、（StBu）可用筑基试剂和磷试剂还原，Cys（Bzl）可用Na/NH3（1）脱保护.6.6. ArgArgArg的月瓜基具有强亲核性和碱性，必须加以保护.理想的情况是三个氮都加以保护，实际上保护1或2个月瓜基氮原子.保护基分四类：（1）硝基烷氧球基（3）磺酰基（4）三苯甲基.硝基在制备、酰化裂解中广生很多副反应，应用不广.烷氧球基应主要有Boc和二金刚烷氧球基（Adoc）2、Fmoc（Arg）Boc的耦联反效率不高，哌噬理时不处稳定，会发生副反应；Adoc保护了两个非 兀-N,但有同样的副反应发生.对磺酰基保护，其中TOS应用最广，但它较难脱除 .近年来2, 3, 6-三甲基-4-甲氧苯横酰基

27、（Mtr）较受欢迎，在TFA作用下，30分钟即可脱除， 但是它们都不能完全抑制侧链的酰化发生.三苯甲基保护基可用TFA脱除.缺点是反应较慢，侧链仍有酰化反应，且其在DCM、DMF中溶解度不好.7.7. LyLyLys的&NH2必须加以保护.但与a NH2的保护方式应不同，该保护 基要到肽链合成后除去.b NH2的保护无消旋问题，可以采用酰基保护基， 其它常用的保护基有节氧碳基8.8. FmocFmoc基团的脱除Fmoc基团的所环系的吸电子作用使9-H具有酸性，易被较弱碱除去， 反应条件很温和.反应过程可表示如下： 哌噬进攻9-H, 6消除形成二苯协烯， 很容易被二级环胺进攻形成稳定的加

28、成物.Fmoc基团对不同的碱稳定性不同，可根据实际条件选用 .9.9.耦联反应固相中的接肽反应原理与液相中基本一致.将两个相应的氨基被保护的及埃基被保护的氨基酸放在溶液内，并不形成肽键.要形成酰胺键，经常用的手段是将埃基活化, 其方法是将它变成混合酸酎， 或者将它变为活泼酯、 酰氯，或者用强的失去剂 (碳二业胺)也可形成酰胺键。碳二业胺是常用的活化试剂， 其中Dcc使用范围最广， 其缺点是形成 了不溶丁DCM的DCH，过滤时乂难丁除尽.其他一些如二异丙基碳二业胺(DCI)、甲基叔丁基碳二业胺也用丁固相合成中，它们形成的脉溶丁DCM中，经洗涤可以除去.其他活化试剂，还有Bop(Bop C1)、氯

29、甲酸异丙酯、 氯甲酸异丁酯、SOC12等.其中Dcc、Bop活化形成对称酸、SOC12形成 酰氯，其余三种形成不对称酸酊。)V#e8E2c10.10.对称酸法用Dcc形成对称酸酎的方法使用较广.其缺点是有些氨基酸在DCM中不易溶解，生成的Fmoc氨基酸酎溶解度更差.同时还有些副反应，如形成二肽、消旋等.â? %Bz9g n69b11.11.混合酸酎法最常用试剂是氯甲酸的异丙基酯和异丁基酯.前者得到的酸酎稳定性好只产生很少消旋，在适当的化学计量及溶剂条件下，耦联反应很快.而且， 在此反应中使用的N-甲基吗琳和N-甲基哌噬对Fmoc基团无影响12.12.酰氯法在Boc法中不常用

30、的酰氯，因为比较激烈，一些保护基如Boc不稳定.但是，Fmoc基团可以耐受酰氯处理，生成的Fmoc氨基酰氯也很稳定.在三 甲基乙酸/三胺或苯并三氮口坐/二异丙基乙二胺中，反应速度很快，消旋 很少.酰氯法在固相合成中应用还不多，但已表明，Fmoc氨基酰氯适用丁合成有立体障碍的肽序列 .13.13.活化酯法活化酯法在固相合成中应用最为广泛.采用过的试剂也很多，近来最常用的有HOBt 酯、ODhbt 酯、OTDO酯等.HOBt酯反应快，消旋少，用碳二业胺很容易制得；ODhbt酯很稳定，容易进行分离纯化， 与HOBt酯具有类似的反应性和消旋性能，它还有一个优越之处， 在酰化时有亮黄色、 耦联结束时颜色

31、消失， 有利丁监测反应；OTDO酯与ODhbt酯类似，消旋化极低，易分离，酰化时伴有颜色从桔红 色到黄色的变化等.b1Z7n+k:E5w3n2E2l714.14.原位法将碳二业胺和a- N保护氨基酸直接加到树脂中进行反应叫做原位法.o用DIC代替Dcc效果更好.其他的活化试剂还有Bop和Bop-C1等.原位法反应快、副反应少、易操作.其中DIC最有效，其次是Bop、Bop-C1等.遗憾的是Bop酰化时生成致癌的六甲基磷酰胺，限制了其应用15.15.裂解及侧链保护基脱除Fmoc法裂解和脱侧链保护基时可采用弱酸.TFA为应用最广泛的弱酸试剂，它可以脱除t-Bu、Boc、Adoc、Mtr等；条件温和

32、、副反应较少.不足之处：Arg侧链的Mtr彳艮难脱除，TFA用量较大；无法除掉Cys的t-Bu等基因.也有采用强酸脱保护的方法：如用HF来脱除一些对弱酸稳定的保护基，如Asp、Glu、Ser、Thr的Bzl（节基）保护基等，但是当脱除Asp的吸电子保护基时，会引起环化副反应.而TMSBr和TMSOTf在有苯甲硫酰存在 时，脱保护速度很快.此外，根据条件不同，碱、光解、氟离子和氢解等脱 保护方法也有应用.固相合成法对丁肽合成的显著的优点：简化并加速了多步骤的合成； 因反应在一简单反应器皿中便可进行，可避免因手工操作和物料重复转移 而产生的损失；固相载体共价相联的肽链处丁适宜的物理状态，可通过快

33、速的抽滤、洗涤未完成中间的纯化，避免了液相肽合成中冗长的重结晶或 分柱步骤，可避免中间体分离纯化时大量的损失；使用过量反应物，迫使 个别反应完全，以便最终产物得到高产率；增加溶剂化，减少中间的产物 聚焦； 固相载体上肽链和轻度交联的聚合链紧密相混， 彼此产生一种相互 的溶剂效应，这对肽自聚集热力学不利而对反应适宜。固相合成的主要存 在问题是固相载体上中间体杂肽无法分离，这样造成最终产物的纯度不如 液相合成物，必需通过可靠的分离手段纯化。多肽的不稳定多肽的不稳定性是其制剂研究中存在的主要问题之一，其原因较多。但对某一个多肽来说引起不稳定的主要原因并不多。详细研究外界条件（如PH、温度、光照、氧浓度等）对多肽稳定性的影响有助丁设计合理的制剂 配方。尽管添加剂稳定多肽的机制还不十分活楚，使用添加剂仍是目前提高多肽制剂稳定性的主要手段之一。应用CD、DSC等分析手段可帮助快速筛选道合适的添加剂。引起多肽不