有机试剂 5,荧光试剂

1、第五章 荧光试剂 荧光的发现及发展 荧光产生的理论基础 分子荧光光谱 荧光强度、荧光量子产率和荧光寿命 有机试剂结构与荧光的关系 代表性荧光试剂荧光的发现及发展 十六世纪被发现，但对荧光的产生原理和条件 1852年Stokes考察奎宁和叶绿素荧光 发现荧光波长比照射光波长要长，认定是物质吸收光后重新发射出的光，提出了“荧光” 1867 Goppetsroder 桑色素荧光检测铝 二十世纪初，已荧光素、稠环芳烃及曙红等600余种化合物有荧光 1924年 Wawwillous测定荧光产率 1926年 Gavila对荧光寿命进行了测定 荧光产生的理论基础 基态和激发态 单重态（S)和三重态 (T)T

2、TSSSFPisciscicicic21102E荧光激发光谱和荧光发射光谱 emex 斯托克斯（stokes）位移 荧光强度、荧光量子产率和荧光寿命 荧光强度 F= 2.3FIobc F荧光强度；F荧光量子产率，Io照射到被测物质上的光强度；该物质的摩尔吸光系数；b检测池厚度；c物质浓度 荧光量子产率荧光量子产率与荧光强度的区别 荧光量子产率是荧光物质的固有属性 其与物质浓度无关 荧光强度与物质浓度有密切关系 同浓度下，荧光量子产率高的荧光越强（排出外界条件影响）荧光寿命 荧光寿命（） lnFo-lnF=-t/ Fo和F分别代表t=0和t=时的荧光强度，通过实验测量不同时间的Ft值，确定lnF

3、tt的关系曲线，应为直线 直线斜率就是荧光寿命 用式子=10-5/max估计荧光寿命，max为最大吸收波长下的摩尔吸光系数，如S0-S1跃迁的值一般为103，估计荧光寿命是10-8s. 影响有机化合物荧光的有机试剂结构因素 分子共轭体系 共轭大键共平面程度及其刚性 .取代基 影响 杂原子影响 分子离子化对荧光的影响 立体结构分子共轭体系大小对荧光的影响 有机荧光团 能发射出荧光的共軛键的基团 （-CH=CH-）n（n2），苯，萘，对苯二醌，苯并杂环、吡喃酮以及占吨酮基团 共轭体系越大，荧光量子强度越高 对于稠环芳烃，具有相同芳香环数的化合物，芳环的连接和排列顺序不同，化合物的有关荧光性能也不同

4、 芳环直线性排列的化合物的荧光发射波长比非线性排列的波长要长 芳香环数越多，共轭体系越大，荧光越强 芳香环或共轭体系增加到一定程度，只是荧光发射波长向长波红移，F不再增加，还可能降低 共轭大键共平面及其刚性的影响 有机分子具有共軛平面结构才显示出荧光特性 分子的共轭体系必须具备共平面性 共軛体系的平面结构还要有一定程度的刚性 C252 (C H ) NN(C H )252+CCOOHON(C H )252+252 (C H ) N取代基的影响 取代基种类的影响 取代基有推电子取代基和吸电子取代基 推电子取代基：-NH2、-NHR、-NR2、-OH、-OR（R=-CH3、-C2H5等 吸电子取代

5、基：C=O、-NO2，-COOH，-CHO、-COR（R=-CH3，-C2H5等）、-N=N-、卤素（-F，Cl，Br，I）等 推电子取代基增强荧光 推电子取代基增强荧光 取代基中O或N上的孤对电子参与有机荧光分子的共轭大键，扩大共轭体系 波长红移，荧光强度明显增加 极性溶剂中易形成氢键，强酸中易质子化，碱性介质中可离解出H 质子化试剂分子带正电，使荧光减弱 离解出H试剂分子带负电荷，荧光增强 吸电子取代基 减弱荧光 类取代基中的n电子跃迁到*属于禁阻跃迁 ，激发态分子数较少 S1T1的体系间跨越占优势，激发态分子放出光子的数大为减少，使荧光减弱 CN氰基（-CN）是不饱和取代基，它应使取代的

6、化合物荧光减弱，但实际结果是表现出推电子的效果荧光增强 F虽是吸电子取代基，但增强荧光 磺酸基含有不饱和键，表现出吸电子性能，应减弱荧光 但它易离解出H带负电荷，又体现出推电子的行为，使荧光增加 增减相低，磺酸根的引入一般无显著荧光变化，最明显的是试剂水溶性的增加 取代基数量及其所处位置的影响 对于不同的发光母体，同类取代基所处位置不同所表达的荧光强弱变化规律也不相同 小体积取代基所贡献的共轭效应小只是体现出其电荷影响 大的取代基如苯或乙炔基苯，其共轭效应大，取代后扩大共轭体系，荧光增强的效应大于其吸电子使荧光减弱的效应 结果是取代后的荧光强度不是减弱而是大大增强 两类取代基共同作用 推电子基

7、和吸电子基共存时，推电子基结合在对于吸电子基共振电子密度减小的原子上，构成荧光性 7-羟基香豆素（F =0.37） 6-和8-羟基取代香豆素无荧光 4-甲基-7-羟基香豆素则因甲基的超共轭效应使荧光增强（F =0.41） OO12345678 两个以上推电子基同时取代，化合物的荧光会受到抑制 如 甲氧基苯的F是0.29 1，4-二甲氧基苯的F是0.21， 再如 甲苯的F是0.17 对甲酚的F等于0.09， （取代基）加重效应对荧光的影响 加重效应减弱荧光 ONONCH3NNCH3CH3NONCH3NNCH3CH3SF是0.22，P（磷光量子产率）是0.14 F等于10-5，P变为0.43 芳香

8、环中杂原子的影响 增强或减弱荧光，看杂原子化合物结构 吡咯、噻吩及呋喃荧光量子产率很小 ，苯并后的吲哚、硫茚及苯并呋喃荧光大大增强 n*跃迁变为 *跃迁 问题：从分子结构和光谱特性讨论有机显色剂和荧光试剂的联系与区别。ONNHF 0.86 F约1.0F 0.90.分子离子化对荧光的影响 分子离子化对荧光影响很大*荧光试剂在不同酸度下离子化产物的荧光强度大小不同*选择适宜条件，使试剂有最大荧光强度，以便于高灵敏检测 分子的立体结构也影响 荧光 1，2-二苯乙烯反式具有较强的荧光，顺式则无荧光 CHCHCHCH无机离子的主要有机荧光试剂 钙黄绿素 类似物22(CH COOH)OHOOCOOH22(

9、CH COOH)CH2NCH2N(CH COOK)22(CH COOK)22ONONOCH2COONCH3CH2OKOHOClClONOCH2CH3NCH2O22(CH COOH)22(CH COOH)(CH COOK)22(CH COOK)22NOCH2NHCOOCH3NCH2OCH3ONCH2OCH3NN(CH COOK)22(CH COOK)22NOCH2OCH3NCH2O22(CH COOH)22(CH COOH)N(CH )32(H C) N32+Cl-(CH COOK)22(CH COOK)22+SO2NHNNNONCH2OOCH2(CH COOK)22(CH COOK)22OCH

10、2NNHCOOOHClClOCOOCOOOOHOCONHNCH2OClClKK2，2-二羟基偶氮苯同系物 HONNHOOHYR 西夫碱和腙类 OHNHOXYCHNRZNCHHOCHNNHCSNH2.2-羟基-1-萘甲醛缩氨基硫脲 0.03-0.7gGa/ml，ex/em=412nm/470nm OHCHNNHNN3-羟基皮考啉醛缩-2-吡啶腙（38）在pH4.7荧光测定Al3+，检测限小于2ng 苄基-2-吡啶酮-2-喹啉腙（37）可以荧光测定10ng的锌 CNNHNCH2N8-羟基喹啉（HQ）和8-羟基喹啉-5-磺酸（HQS -二酮类 黄酮类 蒽醌类OOABCDEFGI三苯甲烷占吨酮类 酸性

11、化合物 1.荧光素同系物曙红和二溴荧光素 2.苯芴酮同系物 碱性化合物 罗丹明6G丁级罗丹明B罗丹明4G罗丹明3B罗丹明B 还有卟啉某些无机阴离子和小分子的荧光试剂 测定亚硝酸根 2，3-二氨基萘 1，2-二氨基-5，7-萘二磺酸 NH2NH2SO3HHO3Sex/em=298nm/429nm ，不需萃取，检测限达到0.09ng/ml 2，3-二氨基萘与Se（IV）形成硒唑测硒，ex/em=366nm/520、560nm，测定范围0.4-6.0ng/ml HOOHOOONH2H2NHOOHOOONHNNNO+O22CONH-NHONH2N(C H )252(C H ) N5 22+CONH-N

12、HNOONH2N(C H )252(C H ) N5 22+NO (NO)2-与NO形成荧光素三氮唑检测生物体内的NO，检测限为5nmol/L 检测限1mol/L CHONNNH2NONCOHOOH+H+ 2-苯乙酰-1，3-茚满二酮-1-腙（2-DBIH）测定溴氧（O3）的荧光试剂，基于在三氯甲烷中溴氧与1，2-二-（4-吡啶基）乙烯反应生成4-甲酰基吡啶，4-甲酰基吡啶与2-DBIH反应生成荧光产物，ex/em=468nm/536nm ，检测限0.02g*在过氧化酶的存在下，过氧化氢（H2O2）氧化7-羟基-6-甲氧基香豆素（莨菪亭，58）并使其荧光下降，据此可以测定H2O2，检测限10-

13、10mol118.还原剂会影响这一反应的进行*在微碱性（pH7.2）溶液中，有过氧化酶存在，H2O2会氧化二乙酰二氯二氢荧光素为强荧光的化合物，用于测定210-11-310-10mol/ml *荧光素-乙酸汞在碱性溶液中具有荧光，ex/em=499nm/520nm，加入S2-后，荧光减弱，可测定微量硫*四氯荧光素汞化合物也用于测定硫化物 测定某些有机物、药物等的荧光试剂 蒽酮测定丙三醇ex/em488nm/575nm，测定10-75g 丙三醇在浓H2SO4中脱水成丙烯醛 OOCHCHCH2CH2CHCHOO+H SO24+O2+ H O2OHCHNNCHHO水杨醛与肼反应生成的席夫碱水杨醛缩连氮 ，测定肼CCCCHOCHHOCH2OHOHOOHCCCCHOCHHOCH2OOOOHNNOOCHOHCH2OHNH2NH2-2H脱氢抗坏血酸与邻苯二胺反应生成具有蓝色荧光的化合物，ex/em=350nm/430nm，可测定0.3pmol-10nmol/L的抗坏血酸 甲醛、乙酰丙