多维色谱—质谱对人血清蛋白组研究及在肿瘤研究中的应用

1、多维色谱质谱对人血清蛋白组研究及在肿瘤研究中的应用 分类号单位代码: 公开密级: 学 号:西北大学硕士学位论文题目:垒笙鱼盘二厦蓝壁厶垒溘墨鱼塑壁塞盈甚查盟擅堑塞主丝廛盟指导教币: 鱼垒 专业技术职务:割塾撞学科专业:垡生金盘垡堂答辩日期学位授予日期及其在肿瘤研究中的应用摘要蛋白质组学及其在肿瘤研究中的应用是目前生命科学中的热点研究领域。人血清中蛋白质数量极大,是非常理想的生物样本。但由于血清中高丰度和低丰度蛋白的含量相差大,且许多低丰度的小分子量蛋白/多肽是和高丰度蛋白结合在一起的,很难检测。而这些低丰度的小分子量蛋白往往对人体起非常重要的作用。本文应用多维色谱和基质辅助激光解吸附/电离飞行

2、时间质谱.结合对人血清中的蛋白进行了分离和检测。通过比较健康人血清和肿瘤患者血清蛋白的差异,筛选出了一些肿瘤标志物。本论文包括以下五个部分:.文献综述。对蛋白质组学作了简单叙述,介绍了蛋白质组学的内容、方法以及研究现状,重点介绍了人血清蛋白组学及其在肿瘤研究中的应用。.实验部分。介绍了实验仪器、试剂以及实验步骤。.和. .脲对对人血清的分离与检测。用力,然后用体积排阻色谱对变性后血清中的蛋白按其分子量的大小进行分离并富集,得到了分子量较小但种类较多的低丰度蛋白,从而消除了高丰度大分子量蛋白质对小分子量蛋白/多肽的影响。经过反相色谱进一步分离后,并用. 在未酶解的情况下直接分析检测这些蛋白。在人

3、血清中共检出余种低分子量蛋白/多肽以下,同时通过比较变性前后这些蛋白/多肽种类及丰度的变化,得到了余种与白蛋自相结合的小分子量蛋白。.和对血清中蛋白的分离与检测。分别用弱阳离子交换色谱、弱阴离子交换色谱对血清作了分离,发现用弱阴离子交换色谱对血清的分离效果较好。并用反相色谱对离子交换色谱的馏分和馏分的酶解液进行了分离,发现用反相色谱直接对离子交换色谱的馏分分离的效果不好,将离子交换色谱的馏分酶解后再用反相色谱分离,通过质谱共测得了多个肽段。通过比较健康人和肿瘤患者血清中所检出肽段的差异就可以确定健康人和肿瘤患者血清中蛋白的差异。.肿瘤标志物的筛选。应用上述方法对例健康人血清和例胃癌患者血清、例

4、肺癌患者血清、例食道癌患者血清中的蛋白进行了分离检测。通过比较健康人和肿瘤患者血清中蛋白的差异,筛选出了一些肿瘤标志物。其中对于胃癌筛选出种肿瘤标志物,质荷比为,。以荷质比为的一种蛋白为胃癌特异性标志物,就能将健康人和胃癌患者正确分组,灵敏度和特异性分别为.%/,%/,若以四种蛋白联合判定,则灵敏度和特异性都可达%。对肺癌筛选出种肿瘤标志物,质荷比为,灵敏度和特异性分别为.%/,%/。对食道癌筛选出了种肿瘤标志物,质荷比为,。以三种标志物联合判定,灵敏度和特异性分别为/,%/。关键词:蛋白质组学血清肿瘤标志物液相色谱?. . ,. , 曲打 ,.? . /, .:. . . . . . .,

5、. , ./,.,?. ./., ./. “ ,. .? . ,、犯.耐. . 咖 谢. . .?.,.孤盘 / ,.,埘 % / . 谢 ,.%/ %/,. /,. %/%/,.:?西北大学学位论文知识产权声明书本人完全了解学校有关保护知识产权的规定,即:研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属于西北大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许论文被查阅和借阅。学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时,本人保证,毕业后结合学位论文研究课题再撰写的文章一律注明作者单位为西北大学。

6、保密论文待解密后适用本声明。学位论文作者签名:越丛坌指导教师签名:?年月日 年月日西北大学学位论文独创性声明本人声明:所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名:影队年月日第一章文献综述.蛋白质组学概述随着人类基因组计划的实施和完成,生命科学研究已进入后基因时代。研究的对象从基因转到基因的产物?蛋白质捌。年杂志把蛋白质组学列

7、为年六大研究热点之一【,其“热度”仅次于干细胞研究。年杂志上的一系列蛋白质组学的综述文章描述了蛋白质组学的巨大应用前景【”】。蛋白质组一词,源于蛋白质与基因组伽两个词的杂合,意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”,即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全都蛋白质。马克.威尔金斯 最先提出来【】,最早见诸于年月的杂志上吼蛋白质组学的研究内容包捌】:蛋白质的分离与鉴定:可以利用二维电泳或多维色谱并结合生物质谱等技术,对蛋白质种类及丰度进行研究。翻译后修饰:蛋白质要。经历翻译后修饰如磷酸化,糖基化,酶原激活等。翻译后修饰是蛋白质调节功能的重要方式,因此对蛋白质翻译后修饰的研究对阐明蛋白质的功能具有重要作用

8、。蛋白质功能的确定【】:如分析酶活性和确定酶底物,细胞因子的生物分析,配基.受体结合分析等。对人类而言,蛋白质组学的研究最终要服务于人类的健康,主要指促进分子医学的发展,如寻找药物的靶标分子。蛋白质组学的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础,也能为众多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径【】。通过对正常个体及病理个体间的蛋白质组进行比较分析,我们可以找到某些“疾病特异性的蛋白质分子”,它们可成为新药物设计的分子靶点】,或者也会为疾病的早期诊断提供分子标志【】。确实,那些世界范围内销路最好的药物本身就是蛋白质或其作用靶点为某种蛋白质分子。因此,蛋白质组学研究不仅。是探索生命奥秘的必须工作

9、,也能为人类健康事业带来巨大的利益【.蛋白质组学中的分离技术从蛋白质组学的研究内容看出,首先需要对特定环境条件下细胞、组织或生物活体中所有蛋白质进行识别和定量分析;其次还要对翻译后蛋白质的修饰磷酸化、糖基化、甲基化、乙酰基化等和加工进行分析,并对相似物进行比较。要完成如此巨大的工作量,目前的技术路线主要集中在高效、快速并便于自动化的分离方法;高灵敏度、低检测限、准确和快速的鉴定方法以及完整、可靠并且方便检索的数据库。其中高分辨率、高通量、高效且易于自动化的分离方法是蛋白质组学的关键问题。一般用于蛋白质研究的方法及技术路线如下四:目前,用于“海量”蛋白质混合物的高效分离方法主要有二维凝胶电泳、高

10、效液相色谱和毛细管电泳等方法。其中因分离度高并具有直观图谱而被普遍采用的方法为二维凝胶电泳.,即。与质谱联用技术已经成为蛋白质组学研究中一个较为成熟的技术平台,被广泛应用于蛋白质组学研究的各个方面。但由于该技术伴随其诞生所固有的缺陷,即:在二维凝胶电泳图谱上,并不是每个蛋白点所包含的蛋白量都足以用于鉴定蛋白;存在歧视性问题,如对于低丰度蛋白、疏水性蛋白、极碱性蛋白、一些极大蛋白相对分子质量,和极小蛋白相对分子质量,二维凝胶电泳还不能够将其很好地显示出来,仅仅只有一些可溶的蛋白被用于研究;费时、费力,而且不容易自动化【”。因此近几年对该方法进行了一些改进田,矧,如对电泳前生物样品进行预浓缩和预分

11、离、分步提取以及对凝胶的染色过程进行优化,但都未有实质性的进展。为了解决这种方法存在的闯题,另一种离效分离方法,即裹效液相色谱方法曲,获得了愈来愈多的威用,特别是各种模式色谱联焉缀成多终色谱分褰技拳遨濒被采髑,共与震港联瓣以克夔二维凝胶电泳存在款缺陵。通常与质谱联用的多维色谱分离方法是基于两种威两种以上不同分离机瑷方法的优往帮缀合,其漳容囊凳爱螽一耱模式色谱辩蔫一种袋凡耱模式色谱分离新掰豹掰有馏分进一步分离的色谱峰的总和。分离方法的选择除了根据分离对象和目的的不同考虑不嗣努离方法以及组合方式外,还应考虑质谱签定的簧求殴及最后从疆自质数据库检索的需要。由于蛋白质缀的庞大和复杂,通常瓮要对其避行预

12、分离以缩小分离藏围,再逃一步进行高效分离。.臻白质缀学中的质谱篷定技术对分离瓣蛋鑫遗褥鉴定燕蛋鑫鬟缀学磷究静核心阕题。袋港签定援零豹警入是蛋囊质组学发展中最重要的技术突破【,它具有高通量、灵敏、准确、自动化等特点,已逐步淑代传统的降解测序和氨基酸组成分析,成为蛋白质鉴定的核心阏题。擞物质谱通过检测离子化的被分析物的成基数来获取信息,生物质谱仪通常包含个部转;离予源、质量分析器和检测器。基质辅助激光解吸附离子化是蛋白震缀,髑电骥雾离予他 研究中最为常用的种离子他方式。常与液相分离工具相连,将被分析物从溶液中离子纯,裁瓣激光躲洚麸干漂结磊豹墓蒺串气纯被分拆凌莠嫠之豢毫。常用于分析较简单的肽段混合物

13、,如二维凝胶电泳蛋白质点或单一蛋白质静酶锑提取酞混合秘,进两获得获葳黧指纹潮谱 ,骞惠,怒目前撰白质组研究中最常用的胶上蛋肉质鉴定技术。同时具有分离和艇定功能,常用于鉴定艇杂肽混合物,如混合蛋自溶液酶切产物。由予常具有串联质谱功能,可铯获褥肽段序列信息,因此褥列敢鉴定结果熨为可靠。质量分析器是质谱的核心元件,决定着生物质谱的灵敏度、分辩率、质璧准确度和生或食大量绥感夔薅片裹子谗强熬戆力。嚣蘸在蛋鑫瓣缀磅究孛舂耪基本静震量分掇器:飞行时间 ,、四极杆,、离子肼,帮较掰应霆静簿羹时变换离予霞旋共振。它们的设计和性能不尽相同,各有篡优点和劣势。这些分析器可以独立使用,间串联质谱仪.。实现对复杂蛋白体

14、系的分离鉴定和定量是蛋白质组学研究要解决的首要问题。目前有种主要的蛋白质鉴定手段【:第一种是肽指纹图谱,将蛋白酶切,通过酶切的特异性位点和各肽段质谱图搜索数据库得出蛋白信息。缺点是不能对混合蛋白进行鉴定,所以常与联用。第二种是肽序列标签【】,通过测定某一肽段的氨基酸序列在蛋白质数据库检索。第三种是肽阶梯序列,通过测定每个肽段的二级质谱来确定蛋白。目前有种主要的蛋白质鉴定体系:一种是基于二维凝胶电泳和生物质谱的鉴定手段。其优点是可以提供其他技术所不能得到的分辨能力,能够有效地呈现出蛋白质的等电点和相对分子质量迁移等信息,但由于二维凝胶电泳所固有的局限性,如检测的线性范围窄,难以有效分离相对分子质

15、量高于的蛋白质,极酸或极碱及疏水性高的蛋白质。虽然也有很好的前的样本预处理和分离技术等,仍很难改善技术体系在分析上述蛋白质时存在的缺陷。第二种鉴定方法是新近开发的多维液相色谱分离与串联质谱的连接,常用的多维分离模式为离线或在线离子交换与反相色谱连接,由髓【等率先提出,用于开展酵母全蛋白质表达谱的分析。结合离子肼质谱仪和算法,一次循环成功鉴定出个蛋白质,该方法被称为多维蛋白质鉴定技术。.血清蛋白组学及其研究现状.血清和血浆血清和血浆是人体最重要的体液。血液凝固时析出的淡黄色透明液体,血浆是血液中的液体成分,在血液中加入抗凝剂如肝素、枸橼酸钠等再离心除去血细胞得到的液体就是血浆。血清与血浆的区别在

16、于血清中没有纤维蛋白原,但含有一些在凝血过程中生成的分解产物。对人血清、血浆、脑脊液、尿液蛋白质组的研究是当前蛋白质组学的热剧。血清组成十分复杂,其中水含%,蛋白质%约?/,无机盐类.%,脂类%,糖类.%,及少量的氨基酸及代谢产物【”。血清蛋白根据其来源和功能可分为:组成性蛋白,主要指肝脏和小肠的分泌蛋白,它们在血浆中发挥作用,如白蛋白等;免疫球蛋白,血浆中大约含有数百万种抗体;“长距离”受体和配体,如胰岛素等生长司子;“局部”受体和配体,如一等蛋白质因子;一过性通过蛋白,如溶酶体蛋白酶;组织渗漏蛋白,如心肌球蛋白;异常分泌蛋白,如等肿瘤相关蛋白;外来蛋白,如病毒蛋白等。其中,前两类是血清蛋白

17、的主要组成成分,含量上占有绝对优势。蛋白含量动态范围很宽,达到了个数量级,血清中种主要蛋白就占了血清总蛋白的%,其中白蛋白占%以上。血清中前几种高丰度蛋白分别为:白蛋白、免疫球蛋白、转铁蛋白、.巨球蛋白、一抗胰蛋白酶、补体片段,结合珠蛋白【】。各种血清蛋白的分子质量、等电点差异也非常大。虽然大多数血清蛋白分子质量集中在之间,但在和范围内仍然存在相当数量的血浆蛋白,尤其是的小分子蛋白,肽多为疾病时释放到血清中的特异蛋白,对分离和鉴定疾。病标志蛋白具有重要意义【.血清蛋白组研究现状血清中的蛋白质种类很多,据估计有万多种,是研究人蛋白质组学非常理想的生物样本。蛋白含量动态范围很宽,达到了个数量级,由

18、于血清中高丰度蛋白的存在,以及蛋白之间的相互作用,使得低丰度蛋白较难检测。和等¨采用不同的技术策略,分别从血浆中鉴定出和种不同的蛋白质。等习总结了截至年初所鉴定的血清蛋白为种,其中种已被美国食品药品管理局批准用于临床检查。表血清中被检定出的蛋白质, ,缅曲, .,?., 一一 啦., . , , 口 组 .:.一,一,./?, ,型兰竺竺竺: 些坚生型一 /, ,. .】 口? ?, ?,.,. ,印, , ,., ,一, .?.?.,一, ,., , ,?, ,.,一?.一 皿? ., , 曲兰生垒堡垒竺:璺坚婴翌皇呈 里兰些: 竺业目前对血清的研究主要集中在血清中全谱蛋白的分离与

19、检测和运用差异蛋白组学筛选肿瘤的生物标志物似们。例如,】和等【】应用表面增强激光解析离子础 化。质谱 ,?对膀胱移行癌和鳞状细胞癌组织及其尿液中蛋白表达情况进行研究,在患者尿液中发现了个新的标志物和蛋白簇,分子量从 不等,联合多种蛋白标志物和蛋白簇进行检测敏感性达%,特异性达%。在恶性前列腺癌方面,等【】发现原癌蛋白、延伸因子、谷胱甘肽转移酶、过氧化物歧化酶及丙糖磷酸异构酶表达明显增,细胞角蛋白表达下降,可用于与良性前列腺增生区别的辅助诊断标志物。在消化系统肿瘤方面,等【】用双向凝胶电泳与氨基酸测序相结合的方法,发现,见于%的结肠癌, 可能成为诊断结肠癌的有力标志一种低分子蛋白物。等【验查了正

20、常结肠粘膜和结直肠癌的相对应部分,辨析并鉴定出与肿瘤有关的环氧合酶表达下调:热休克蛋白的变构体及钙周期素表达上调。等】发现对细胞毒应激起保护作用的在正常组织中含量丰富,而在化生和食管腺癌中含量很低。提示化生中的低水平表达,在监测食管腺癌的发展过程中可能具有一定作用。等【】对例原发性肝细胞癌患者、例肝硬化及名健康人的血清进行蛋白质组学研究,发现种蛋白在原发性肝细胞癌中有差异表达,可作为潜在的肿瘤标志物,其中包括种补体因、结合珠蛋白和结合珠蛋白。等【跏首次应用激光捕获显微分离 ,技术从正常乳腺导管上皮中分离出肌动蛋白连接蛋,其表达量明显高于乳腺导管原位癌,有作为生物标志物的可能。 等以乳腺癌细胞系

21、作为肿瘤细胞蛋白的来源,检测例新诊断乳腺癌患者、例其他肿瘤患者及名健康人的血清。用蛋白质组学方法辨析发现,在%孚腺癌患者血清中存在一种新的循环抗原一调节蛋白质相互作用的原癌蛋,其中例对/.的个异构体产生自身抗体。等使用芯片,在例转移及早、晚期乳腺癌患者的血清中发现分子量为.的核基质蛋白,而在%/榴腺癌血清中未检测到,此蛋白有可能成为乳腺癌新的诊断标志物。在利用蛋白质芯片和飞行时间质谱?筛选肿瘤标志物方面更是非常活跃,已经有了可喜的结果。例如:.等人 】用/和蛋白质芯片技术在人血清中检测出三种蛋白可以将不同的胃癌正确分类,其中两种蛋白分子量在以下。.等人【】在人血清中发现了种分子量在以下的蛋白可

22、正确区分卵巢的肿瘤和非肿瘤疾病。这些都说明用血清蛋白组学发现肿瘤的标志物并用于肿瘤的早期诊断以及治疗方面有非常广阔的前景。在血清蛋白的全谱检测及自动化方面也有了长足发展,最突出的是多维色谱和质谱、串联质谱联用方面,建立了许多高通量、高灵敏度的技术平台删。例如等提出的多维蛋白质鉴定技术,.和将强阳离子交换色谱与反相色谱联用,结合二级串联质谱分离检测了人血清中所有蛋白的酶解液。由于技术不容易在一维色谱一质谱和二维色谱一质谱之间进行转换以满足不同复杂程度样品的分离鉴定,而对大量简单的样品也无须采用此复杂技术,于是等【】设计了一种比较简单的多维色谱.质谱分离鉴定技术平台。其基本思想就是将进样、离予交换

23、色谱、预柱、反相液相色谱和质谱鉴定系统用个六通阀连接起来,可以进行一维或二维色谱分离,并可进行自动或手动进样。该技术具有高的分离效率和分析通量,可用于细胞内、外的蛋白质复合物和亚细胞蛋白质组的研究。由此可得出,针对不同的研究目的和对象,应不断开发新的多维色谱.质谱技术,以满足蛋白质组学发展的需要畔】。为了更准确、灵敏的检测这些低丰度的小分子量蛋白,消除高丰度蛋白对低丰度蛋白的影响,目前通常是用基于抗原抗体相互作用的亲和填料除去白蛋白和免疫球蛋白】和用膜过滤的办法除去大蛋白。例如 等【墚用%的乙腈以减小血清中蛋白质与蛋白质/多肽之间的相互作用力,用超滤的方法除去大分子量蛋白质的影响,并用?在人血

24、清中成功鉴定多种小分子量蛋白质。工等人总结了不同除白蛋白和免疫球蛋白的方法的优缺点及对结果的影响。 ”】讨论了不同亲和填料除去白蛋白的效果。总的来说,这些亲和填料价格较高,很难重复利用,而且这两种方法都存在低丰度蛋白损失的现象。此外,等【醯】讨论了血清样品的取样、保存及处理对质谱结果的影响。血清是一个非常复杂的样品,其中的蛋白据估计有万余种。要对所有的蛋白表达进行检测是一个浩大的工程,不同个体在不同时期的蛋白表达差异很大,而蛋白还存在翻译后修饰等,这些都增加了血清蛋白组学的难度。尽管人们对已经进行了大量的研究,取得了不少成果,但是毕竟血清蛋白组学的研究还处于初级阶段,血清中真正搞清楚的蛋白并不

25、多,很多工作还处在表面,这就需要我们做好多认真扎实的工作。总的来说,血清蛋白组学的研究是一个涉及多学科,利用多种技术的综合性课题,它对于人类生命的探索和疾病的发病机理、早期诊断和治疗手段的研究有着非常重要的作用,有非常广阔的前景。第二章实验部分.仪器与试剂.仪器高效液相色谱仪一,日本岛漳公司,包括色谱泵,紫外可见检测器,检测器,控制器,进样阀,梯度装置,除气装置和私色谱工作站:基质辅助激光解吸附离子化飞行时间质谱仪.,岛滓集团英国克雷斯托分析仪器公司实验所用超纯水由纯水器美国,.制备;冷冻干燥机.一?,德国,型分光光度计上海第三分析仪器厂,型酸度计上海第二分析仪器厂,型高压气动泵装柱机,.紫外

26、分光光度计日本岛津。.化学试剂甲醇分析纯,西安化学试剂厂,氯化钠分析纯,西安化学试剂厂,磷酸二氢钾分析纯,天津市登峰化学试剂厂,三氟醋酸分析纯,国药集团化学试剂,硫酸铵分析纯,天津市科密欧化学试剂开发中心,碳酸氢氨分析纯,上海试四赫维化工,甲酸铵德国,氢氧化钠西安试剂厂。质谱标准样:胰岛素,细胞色素;质谱基质:,二甲氧基羟基肉桂酸;.氰基一一羟基芥子酸均购自公司。正常人血清和病人血清由陕西省肿瘤医院提供。考马氏亮蓝进口分装,三氯乙酸、磷酸和氯化钠等分析纯,西安化学试剂厂,牛血清白蛋白,美国公司。. 比色法测定蛋白含量叫分别在的塑料管中加入. 各、斗,以.?补足至,同时以的.?作空白对照。每管中

27、各加入.的考马氏亮蓝染料溶液,振荡混匀,室温放置。在波长下,用.光程的比色皿测定吸光度值,并以吸光度值对标准蛋白浓度作图,褥到一条标准曲线。网榉条件下测定未知样品的吸光度馕。从的标准曲线确定待测样品的浓度。如果待测样品的浓度过高,可稀释后进行检测,或在较高的检测莛鬟熟蛋叁憨量在. 捧男一条标壤艟线逡行检测。.斑清的处理清的处理对结果的准确性、可靠性和黧现性非常重要。血清的处理包括血清的采集、储存、离心、稀释、交毪等内容。本实验所用健康人血清及肿瘤患翡血清有陕西黔癯医院提供,健康人血潢由健康鼹查采集所得,年龄性别具有代表性。肿瘤患者由多种阪学手段确定为肿瘤患者,男女比铡适满,年龄寿些镶大。将采集

28、型熬敷涛馕褥子.冰箨,避免反复冻融。使霜融褥离心,离心转速为转,离心时间。离心后用.¨缓冲液按:魄耩稀释。凌瞧盘潦弱 。艨滚滚与艇清按:邃麓混合,健最终滚液孛淼豹浓度为 .。若处理后斑清样鼎混浊可用膜过滤,过滤膜为醋酸纤维膜,孔径.。血清样品每次进完群后立帮放入猿籍冷藏。怠谱条件.捧阻色漤.色谱柱为 填料安法玛西妲墩璃钢械,内装填公司,瑞典。?“流动相: 流动相 . ?.。.流动相 .流动胡 ?¨弧.流速设为. ,蒋梯度洗脱,检测波长为。每次实验之前用流动相较大滚速;孛浚惫谱纹黎色谱较臻议上,平衡.强舜戆实验。.反相色谱色谱柱为.不锈钢柱,.,儇谱填料。:滚动楱 珏.%流劝

29、相 十.%流速为 ,检测波长为。每次实验之前用流动相冲洗色谱仪和德谱柱以上,用流动相平衡.开始实验。梯度为线性梯度和线性梯度,流动相从/一%。.离子交换色谱色谱柱为.×玻璃钢柱,分别装填弱阴填料日本和弱阳填料西大分离科学研究所。. .。.流动相.流动相 ?.:流动相.流动相 ?. ?流速为 ?,检测波长为。每次实验之前用流动相冲洗色谱仪和色谱柱以上,用流动相平衡.开始实验。梯度为线性梯度,流动相从%。.酶解条件将离子交换色谱馏分冻干浓缩,除去大部分的甲酸铵。用少量水溶解后沸水浴酶液进一步除去残余甲酸铵。加碳酸氢铵溶液调节值为.,加入.酶解小时,用超级恒温水浴严格控制实验温度。.基质辅

30、助激光解吸附,电离飞行时间质谱仪对血清中蛋白的检测.仪器及原理?利用激光脉冲从干燥结晶的基质中气化被分析物并使之带电,带电粒子在电场中加速,由飞行的时间可测得粒予的质荷比。以下是离子化机理及示意图和检测示意图.实验方法将色谱馏分冻干样品用少量超纯水溶解,点样/.于靶板上,再覆盖.“基质。空气吹干后将靶板放入质谱仪,等真空度达到后开始检测,用线性正离子模式采集质谱图,激光能量.,重复采集数据次。每次测定前用标准蛋白牛胰岛素或细胞色素.来校正仪器。强渺摩,.? 妒嚣豳工一碣.袖霪随王图带电粒子质荷比测定示意图 / 第三章排阻色谱和反相色谱联用对血清的分离及质谱检测.前言血清中的蛋白数目非常多,据估

31、计有万余种,而且蛋白还存在翻译后修饰等。血清中蛋白含量的动态范围非常大,含量高的蛋白是含量低的蛋白的倍,其中种主要蛋白就占了血清总蛋白的%,白蛋白的含量在总蛋白含量中就占%以上】。另外,血清中蛋白的分子量范围也很宽,血清中蛋白多为糖蛋白,分子量高的达上百万,分子量低的小肽片断只有几百。】总结种血浆蛋白分予质量的分布范围图.。虽然大多数血浆蛋白分子质量集中在之间,但在和范围内仍然存在相当数量的血浆蛋白,尤其是的小分子蛋白/肽多为疾病时释放到血浆中的特异蛋白,对分离和鉴定疾病标志蛋白具有重要意义【朔。如”如¨口芑基。缸声日,/.但是这些低丰度的小分子量蛋白,多肽往往是和高丰度蛋白,如白蛋

32、白、免疫球蛋白等结合在一起的,很难检测。而这些低丰度的小分子量蛋白往往对人体起非常重要的作用。例如:.等人用们埘在人血清中检测出三种蛋白可以血清中发现了种分子量在以下的蛋白可正确区分卵巢的肿瘤和非肿瘤疾病。为了更准确、灵敏的检测这些低丰度的小分子量蛋白,消除高丰度蛋白对低丰度蛋白的影响,通常需要对血清中的蛋白进行预处理或预分离。目前常用基于抗原抗体相互作用的亲和填料除去白蛋白和免疫球蛋白和用膜过滤的办法除去大蛋白。例如等卅采用%的乙腈以减小血清中蛋白质与蛋白质/多肽之间的相互作用分予量蛋白质。.等人【删总结了不同除去白蛋白和免疫球蛋白的方法的优缺点及对质谱结果的影响。 等【刀讨论了不同亲和填料

33、除去白蛋白的效果。但是,这些亲和填料价格较高,很难重复利用,而且这两种方法都存在低丰度蛋白损失的现象。因此说,要使用一种方法或技术来分离检测血清中的所有蛋白难度很大。本论文提出将血清中蛋白按不同的性质分为多个组,然后再分别研究每组的蛋白组成及含量。实验方法示意图见图。血清标本稀释变性色谱样品圈圈圈曰圈同画画画图实验方法示意图本章用 .脲对人血清进行稀释和变性,以消除血清中蛋白质一蛋白质,肽之间的相互作用力,然后用体积排阻色谱寸变性后血清中的蛋白按其分子量的大小进行分离富集,得到了两组分子量较小但种类较多的低丰度蛋白,从而消除了高丰度大蛋白质对小分子量蛋白,肽的影响。经过反相色谱对这两组馏分进一

34、步分离,按时间收样分成组。这样,我们就将血清中的小分子量蛋白按分予量大小和疏水性强弱分成了组,并用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱. 在未酶解的以情况下直接分析检测这些蛋白。在人血清中共检出余种低分子量蛋白/肽下,同时通过比较变性前后这些蛋白瞅种类及丰度的变化,得到了余种与白蛋白相检测技结合的小分子量蛋白。建立了离线的多维色谱对血清的分离及术平台。将血清分为两份做对照,按第二章所示方法处理,一份稀释变性,对照组只稀释。将处理好的血清样品通过进样阀进到排阻柱中,每次,按峰形收样,重复收集三次。所收馏分用冷冻干燥机冻干浓缩,用少量水溶解后再用反相色谱分离,按时间收样,共收份。同样重复收集三次,

35、将馏分冻干后用质谱仪检测。.结果与讨论.捧阻色谱对血清的分离排阻色谱法是依据蛋白质分子体积的大小进行色谱分离的。分离蛋白质回收率高,不会造成蛋白的损失。考虑到人血清中白蛋白的分子量为,故选择公司的 填料,它的排阻范围为,最大承受压力为.。对于排阻色谱法,最大的影响因素是流速,我考察了流速对血清样品分离的影响。图?是用流动相在不同流速下的排阻色谱分离图。从图可以看出,在流速为.?时分离效果比较好,流速再变小时分离效果没有明显改善。考虑到分离时间,选用.?为最佳流速。理想的排阻色谱溶质与固定相之间应该没有相互作用力,固定相表面应为亲水性的羟基,但是由于填料合成时实验条件的限制,固定相表面不可避免的

36、存在一些羧基、氨基等带电基团,因此溶质与固定相表面会有一些静电作用力。为了消除这些作用力,通常在流动相中加入一定浓度的盐。流动相采用的盐通常为流动相,丽相。这主要是因为甲酸铵和碳酸氢铵易挥发,在样品冻干时很容易除去,便于用冷冻干燥的方法来对蛋白进行浓缩。而碳酸氢铵在温度稍高时易分解,在流动相中产生气泡,?甲酸铵流动相为流动相。影响分离效果,因此最终采用./ 图不同流速下对血清中蛋白的分离图,. ?。;,. ?;,. ?;?,. .;,. ?;,.为验证该色谱柱的分离能力和排阻范围,对标准蛋白进行了分离。以下是和的排阻色谱分离图图。.。 图标准蛋白的掉阻色谱分离图.从色谱图可以看出,以./甲酸铵

37、流动相为流动相,在流速.下,该色谱柱对标准蛋白的分离效果很好。我们的目标是将高丰度的大分子量蛋白和低丰度的小分子量蛋白分离,该色谱柱完全能满足分离要求。.分别用对以. .甲酸铵流动相为流动相,流速为.正常人血清和 .脲变性的血清样品进行分离,色谱分离图如图所示。号峰分子量,在以上,主要是一些免疫球蛋白和抗体,号峰主要是人血清白蛋白用人血清白蛋白标准品对照,从色谱图上可以看出白蛋白的含量很高。分别收集号峰和号峰,这样就除去了血清中的白蛋白和其他大蛋白,得到了丰度较低但种类较多的小分子量蛋白。. ,八、/一?/图 对血清样品的色谱分离图.,.对色谱馏分的分离.反相色谱柱柱效的测定为了用反相色谱对排

38、阻馏分进行更好的分离,在分离血清中的蛋白之前,先用反相色谱柱对标准蛋白进行分离,测定反相色谱柱的分离能力及柱效。以下是该反相色谱柱对苯、甲苯、萘的分离及五个标准蛋白的分离图图,图.。图反相色谱对苯、甲苯、萘的色谱分离图 ,.;.经过计算,得出该色谱柱的理论塔板数为块/米,具有较高的理论塔板数,色谱柱性能良好。从图.来看,该色谱柱对于生物大分子的分离效果也是比较好的。.对色谱馏分的分离对于反相色谱,对分离效果影响较大的是流速和梯度的设置,经过条件优化,最终确定流速为 ?,梯度为分钟线性梯度流动相从%到%。用对的色谱馏分和进行第二维色谱分离,色谱图如图.所示。图和图分别为的色谱馏分和再用分离的色谱

39、图。从色谱图可以看出这些小分子量的蛋白质/多肽的丰度差异很大。我们按时间段对的色谱馏分和馏分分别收集份馏分,并用冷冻干燥机冻干。图 对色谱馏分和的色谱分离图 , , . .,;. ;.质谱分析对所收集的色谱馏分进行检测,质谱检测结果如图用.所示。图给出了一组健康人的变性及未变性血清色谱馏分的?质谱图的比较。图变性及未变性的健康人血清质谱图的比较: :采用的是软电离技术,在检测过程中样品不发生裂解,质谱图比较简单,主要为分子离子峰,即】峰,这样它就可以用于混合蛋白样品的检测,一般情况下一个质谱峰就代表一种蛋白,它的质荷比就是它的分子量。为保证结果的准确和重现性,我们将信噪比大于的信号认为是一个质

40、谱峰。将所检测到的蛋白数目列于表.。从表.以及图和图.比较可看出,血清变性后可检出的小分子量蛋白质/多肽的数量和信号强度均远远大于未变性的血清样品。血清未变性时,平均可检测出小分子量蛋白质/多肽个:而变性后总计平均可检测出个小分子量蛋白质/多肽。结果还表明,血清变性后质谱峰的数目的增加主要来源于图中的号馏分,而号馏分中组分基本保持不变,这说明新增加的蛋白分子量较大。因此说,用 .脲使血清变性,可以消除血清中蛋白质一蛋白质/肽之间的相互作用力,再用对变性后血清中的蛋白按其分子量的大小进行分离,可以消除了高丰度大蛋白质对小分子量蛋白/肽的影响。表.血清变性前后.检测小分子量蛋白质,多肽数目的比较/

41、平均号样品组 号样品组号样品组变性前变性后由于对同一组样品是在相同的条件下做的对照试验,因此通过比较血清样品交性前后组分之间的差异,如果在变性后的血清样品中出现新的组分或某些组分的信号强度或丰度增加,则证明该组分就是与白蛋白等大分子量蛋白结合的小分子量蛋白质/多肽。从表中比较可看出,检测出了近种新组分,表明这种组分是与大分子量蛋白结合的小分子量蛋白质,多肽。因此,本方法还可用于研究血清中蛋白质/多肽蛋白质之间的相互作用。此外,另有一些蛋白在变性后质谱峰减弱或消失,这可能是由于这些蛋白在变性时分解或者结构被破坏所致。.应用肿瘤是危害人类生命建康最大的杀手之一,其中胃癌的发病率在所有恶性肿瘤中位于

42、第四,它的死亡率仅次于肺癌,位于第二。肿瘤的早期发现对治疗肿瘤有一个好的预后结果至关重要。目前对胃癌的确诊主要依靠病理、胃镜和射线等技术,方法复杂且具有侵入性。近年人们试图通过血清蛋白组的研究筛选一些肿瘤标志物,通过对血清的检测来筛查胃癌高危人群,发现早期病人。因此筛选准确率高的肿瘤标志物意义重大。心。【 止. . 图.变性及未变性的胃癌患者血清质谱图的比较 : :检测小分子量蛋白质数目的比较表.肿瘤患者血清变性前后. /我们采用上述方法对胃癌患者血清变性前后.检测结果进行了比较,质谱对比图见图.。将胃癌患者血清变性前后检测到的小分子量蛋白质侈肽数目列于表?。结果表明,肿瘤患者血清变性后质谱峰

43、数目要比未变性的多多个,为肿瘤检测标记物的筛选提供了更多的信息。表明这种方法可以用于肿瘤蛋白组学及其肿瘤标志物的筛选。.小结间的相互作用力,然后用体积排阻色谱对变性后血清中的蛋白按其分子量的大小进行分离并富集,得到了分子量较小但种类较多的低丰度蛋白,从而消除了高丰度大分子量蛋白质对小分子量蛋白/多肽的影响。经过反相色谱进一步分离后,并用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱. 在未酶解的情况下直接分析检测这些蛋白。在人血清中共检出余种低分子量蛋白,多肽以下,同时通过比较变性前后这些蛋/多肽种类及丰度的变化,得到了余种与白蛋白相结合的小分子量蛋白。将本方法应用于胃癌血清比较蛋白组学,亦取得较好的结

44、果。建立了研究肿瘤血清蛋白质组学一种有效的技术平台。第四章离子交换色谱和反相色谱联用对血清的分离.前言血清中的蛋白种类非常多,据估计有几万种,血清凝自的憔质具有很大的动态范围。薹先,不露敷瀵蛋受瓣表运事度据嫠缀大,鄹一耱虫浆蛋鑫在不同生理和病理条件下浓度变化也很犬;其次,不同清蛋白的分子凝范围很大,从几百到几百万;羧看,纛涛孛蛋巍的等嘏点差异疆太。褒第三章我裁讨论了壶予斑清孛豹蛋白耱类非常多,无法用一种方法或一次性检测血清中的所有骚自,因此我们设想先根据血清中的蛋白鹃性旗差异将其分为不蕊的缀,再用不同酶方法来分析检铡不同组韵血清蛋白。上一章研究了用排阻色谱将血清中的蛋白按分子量大小分为了不霹的

45、组,黧点研究了血清中的小分子量蛋白。本章利用血滴中的蛋白等电点差异火的性质用离子交换色谱将盘渣巾憋蛋自分组,霉媛反攘色谱进一步分离,最蘑用质遘寒检测。高散离子交换色谱已被广泛地应用于活性缴物大分子的分离纯化中。与反稠色谱榴进,枣子交换色谱静瀛动程使麓蕴拳豁系,霆掰洗瓣条传毙较澈帮,蛋爨震与潮定程之间的作用力比较弱,使骚白质在分离时大多数都可以保持其生物活性。目前利用血清中的蛋自簿电赢麓异大静性质来对矗清中的蛋自遴行分离稳方法童要有等黾聚焦玎巳、难细管电泳和寓予交换识谱法妇阮。等电聚焦广泛用于二维凝胶电泳的第一维,它使用阐相傩梯度胶条 , 。毛细替电泳特点是非常褒的分辨率,以理论塔投数计霹达上百

46、万”,它的缺点怒样品处理量豢小,无法制备。离子交换色谱法的分辨率在色谱法中仪次于反相色谱,而且由予固定相和流动相的选择缀灵溪,适于复杂襻品熬分离。铡鳃援据蠢定糖基鏊苓同霹分必弱鬻簧予交换、弱骥离子交换、强阳离子交换和强阴离子交换。流动棚可用多种盐类,常用有、等,还帮丽甲酸铵等。在洗蔑方式上由簸梯度浚驻和梯度洗脱两种。离子交换色谱在蛋白组学研究中非常广泛,常被作为多维色谱的第一维。邋常的做法是将组织酶解,将酶解液依次用离子交换和发相色谱分离,邋过串联质谱测褥肽段信息,通过数据露可检索瞧具有该肽段的蛋皇。例如,”】等提出款多维蛋巍质鉴定技术就是将强阳离予交换和反相色谱结合在一起。 等删用不同值豹弱

47、酸缓净溶浚捧为洗黢滚,分疹洗出等电点不同懿蛋鑫,再震反程色港递一步分离,最后用二级质谱鉴定,经过个循环,在老鼠肝脏组织酶解液中共检出个肽段,个肽段序列被确认。本章对离子交换色谱法分离血清作了探讨。分别用弱阳离子交换色谱、弱阴离子交换色谱对血清作了分离。并用反相色谱对离子交换馏分的酶解液进行了分离,通过质谱共测得了多个肽段。通过比较健康人和肿瘤患者血清中所检出肽段的差异就可以确定健康人和肿瘤患者血清中蛋白的差异。.结果与讨论.弱阳离子交换对血清的分离蛋白质带有羧基和氨基,在不同值的溶液会带不同电荷。弱阳离子交换色谱是依据蛋白等电点的不同将蛋白分离开。离子交换色谱的洗脱方式有盐梯度洗脱和梯度洗脱两种,本实验用盐梯度洗脱。对于流动相,本文选择了甲酸铵,这是因为甲酸铵易挥发,在样品冻干时很容易除去,便于用冷冻干燥的方法来对蛋白进行浓缩。而用甲酸铵和氯化钠作流动相,分离能力没有明显的差别。以?.为洗脱流动相,用弱阳离子交换色谱对血清进行分离,色谱图见图。/图弱阳离子交换色谱对血清的分离 .;流动相;.流动相?.?流速:/;梯度: %.%从图可以看出,血清中蛋白多为一些酸性蛋白,因此在弱阳离子交换柱上保留很弱,分离效果也不好。.弱阴离子交换对血清的分离由于血清在弱阳离子交换柱的保留很弱,我用同样的条件用弱阴离子交换色谱对血清进行了分离,色谱图如图.。