凝聚胺法交叉配血试验

1、word整理版凝聚胺法交叉配血试验操作规程目的保证交叉配血试验准确,保证临床输血平安.适用范围XXX医院输血科责任具有专业技术的工作人员主要负责 XXX医院输血标本的交叉配血试验,但只对 该单份标本负责.相关文件试剂采购、保存和使用治理程序设备采购、使用治理程序消毒与清洁治理程序标本采集、运输、保存和报废治理程序紧急用血治理程序相关记录仪器设备的采购、使用和维护记录仪器的温度记录恒温水温箱的换水和消毒记录消毒液的配置记录清洁消毒记录试剂采购、使用记录标本交接和报废记录交叉配血记录紧急用血记录实验原理红细胞外表带有大量的负电荷,以预防产生自发性聚集,当红细胞悬浮在电解 质中时,阳离子会被红细胞的

2、负电荷所吸引,此时红细胞那么被扩散的双层离子云所 围绕而形成Zeta电位,Zeta电位决定红细胞之间的排斥作用.凝聚胺技术首先利用低离子溶液(LIM)降低介质的离子强度,减少红细胞周围 的阳离子云,以促进红细胞与血清(血浆)中的抗体结合.其次参加的凝聚胺(Polybrene )溶液是一种高价阳离子多聚物、肝素中和剂,溶解后能产生很多正电 荷,可以中和红细胞外表带有的负电荷,使红细胞的Zeta电位降低,缩短红细胞之间的距离,使红细胞产生非特异性的凝集.最后参加的悬浮液(Resuspe ndi ng )具有中和凝聚胺(Polybrene )阳离子的作用,使正常的红细胞非特异性凝集散开,试 验结果为

3、阴性；但如果红细胞被相应的抗体致敏,那么会被凝聚胺凝集而不会散开, 试验结果为阳性.仪器器械玻璃试管、玻片、记号笔、一次性塑料滴管、显微镜、交叉配血专用离心机、 试管架、恒温水温箱、试剂保存冰箱、标本保存冰箱.试剂生理盐水、凝聚胺试剂、Anti-human IgG血清,均为有合格证件的正品.试剂保存和稳定性1 凝聚胺试剂须保存在2-25 C 其中阴、阳对照血清应储存在28C.在适当 储存条件下有效期24个月.2. 抗人IgG血清低温冰箱保存.复溶后放 2 4°C冰箱保存.3 凝聚胺试剂 低离子介质溶液LIM:含葡萄糖,乙二胺四醋酸-2钠及稳定剂. 凝聚胺溶液Polybrene ：含凝

4、聚胺,氯化钠及稳定剂. 复悬液Resuspending：含柠檬酸钠,葡萄糖及稳定剂. 阳性对照血清：含抗D血清、氯化钠及稳定剂. 阴性对照血清：含AB血浆、氯化钠及稳定剂,不含红细胞血型抗体.标本收集与处理1、受检者血清：采集受检者静脉血23ml,经1000r/min离心1分钟或室温静置 1小时后取上清.2、25%勺受检者红细胞：采集受检者静脉血或末梢血,先用生理盐水洗涤红细 胞3次,再根据下表进行红细胞悬液的配制.悬液浓度%压积红细胞滴盐水滴2140(2ml)5116 (0.8ml)3、以上标本有效期为三天；假设受血者抽取标本后,输用过血液或血液制品,且 输用时间超过12小时的,必须重新米集

5、标本.4、标本出现中度以上溶血者,为不合格标本,不能用于检测.实验方法与步骤1 、分别制备受血者和献血者 35%勺红细胞悬液取2支使管分别标注为受血 者管和献血者管,再分别参加 2ml生理盐水,在受血者管参加1滴受血者红细胞,在 献血者管参加1滴献血者红细胞,混匀后备用.2、取4支使管,分别标注主侧、次侧、阴性对照和阳性对照：主侧管：先参加2滴受血者血清血浆,再参加1滴献血者25%T细胞悬液；次侧管：先参加2滴献血者血清血浆,再参加1滴受血者25%T细胞悬液； 阴性对照管：先参加2滴阴性对照血清,再参加1滴献血者25%T细胞悬液；阳性对 照管：先参加2滴阳性对照血清,再参加1滴献血者25%1细

6、胞悬液.3、 混匀后各参加LIM溶液0.65ml,轻轻混匀,于室温下静置1分钟.4、 再各参加2滴Polybrene溶液,轻轻混匀,于室温下静置 15秒.5、 用交叉配血专用离心机 3400 r/min 相当于1000g离心力离心10秒,然 后倒掉上清液不要沥干,让管底残留约0.1 ml液体.6、轻轻摇动试管,目测红细胞有无凝集,如无凝集,那么必须重做.重做后仍然 没有凝集现象出现,可能试剂失效.7、最后各参加2滴Resuspending溶液,轻轻摇动试管并同时目测凝集是否散开,再进一步倒在玻片上用显微镜观察凝集是否散开.如果在60秒内凝集散开,表明是由Polybrene引起的非特异性凝集,配

7、血结果相合；如果凝集不散开,那么为红细 胞抗原抗体结合的特异性反响,配血结果不相合.如果想进一步检测 Anti-K抗体,那么必须继续做辅助性的抗球蛋白试验,步骤如下：8、再滴入1滴Resuspending溶液.9、用生理盐水洗红细胞35次,并把最后一次上清液完全倒干.10、滴入2滴Anti-human IgG 血清,并混匀.11、用交叉配血专用离心机 3400rpm离心15s.12、 观察有无凝集反响,如果有凝集反响,表示有 Anti-K抗体,那么必须进一步 做抗体冲出试验,供血者的血液不适合病人使用.如果没有凝集反响,为了保证输血 的平安性,须再各添加1滴致敏性红细胞至所有没有凝集的试管中,

8、 混匀,3400rpm 离心1分钟.正常应有2+反响.如果没有凝集反响,可能是假阴性,辅助性抗球蛋白 试验必须重做.结果判断1、ABC同型配血,主侧和次侧均无溶血及凝集表示无输血禁忌,可以输血.2、 如急需输血但一时无同型血液,作异型配血时指 C型血输给A,B或AB型, 或A,B型血输给AB型时,主侧无溶血及凝集,但次侧必然有凝集或溶血.质量限制与考前须知1、在进行交叉配血试验时,一定要严格按操作规程进行,每进行一步操作,必 须进行一次核对,预防操作错误,尤其预防主侧和次侧加样加错.操作方法应按规定 先加血清,然后再加红细胞悬液,以便核实是否漏加血清.同时,注意区别凝聚胺所 引起的凝集反响.2

9、、受血者标本有效期为三天；假设受血者抽取标本后,输用过血液或血液制品,且输用时间超过12小时的,必须重新采集标本.25渝细胞悬液要求准确,必要时 用生理盐水洗涤红细胞后重新配制.3、如果主侧发生凝集反响,说明配血不合,不管次侧配血如何都不能输血.如 果仅次侧配血发生凝集反响,只有在紧急情况下才有可能考虑是否输血.4、可以用EDTA抗凝血浆代替血清使用,不能使用溶血标本及含有枸橼酸钠、肝 素的抗凝血浆标本.5、加Polybrene溶液离心去上清后不凝集,可能是标本中含有肝素或其它干扰因子.假设病人血清血浆含有肝素或其它干扰因子,如洗肾患者,需多加46滴Polybrene溶液以中和肝素或其它干扰因

10、子.&红细胞悬液以35%为宜,过浓或过淡可使抗原抗体比例不适当,反响不明显而易误判.7、 未开封的试剂应储存于温度在 225C、相对湿度不大于80%无腐蚀性气体 的环境中；已开封的试剂应储存于相对湿度不大于 80%无腐蚀性气体和通风良好的 室温环境中；试剂用后应及时拧紧瓶盖保存；未开封试剂的有效期为两年,在有效期内已开封的试剂应在开封后的6个月内使用完.8、试管,滴管吸头和玻片必须清洁枯燥,预防溶血.9、离心时间不宜过长或过短,速度不宜过快或过慢,以防假阳性或假阴性结果.10、各种原因引起的红细胞溶解,易误判为不凝集,局部溶血时,可溶性血型物 质中和了相应的抗体.11、中国人极少有An

11、ti-K抗体,但其他人种比例较高,尤其是白种人,所以,当 病人是其他人种时,为求平安起见,应加做辅助性抗球蛋白试验.加做辅助性抗球蛋 白试验是为了增加检测 Anti-K抗体的敏感度,对检测其他的抗体无帮助.所以,除 非想进一步检测Anti-K抗体,否那么不须做到辅助性抗球蛋白试验.12、进行交叉配血前逐项核对输血申请单、受血者和供血者血样,复查受血者和 供血者ABC血型正、反定型,并常规检查患者RhD血型,正确无误时可进行交 叉配血.13、结果判断必须先肉眼观察,再进行显微镜观察.注意观察弱凝集和排除非特 异性凝集.14、 交叉配血试验中发现有不配合时,首先应考虑受血者和供血者的ABO血型和

12、RhD血型定型是否错误,必要时进行抗体筛检.其次,应注意有无特异性同种抗体,特异性未知的同种抗体存在,或者患者的血清在室温37C或抗球蛋白血清中凝集所有 的其他红细胞,造成交叉配血的困难,应进一步作有关试验进行鉴定.15、两人值班时,交叉配血试验由两人互相核对；一人值班时,操作完毕后自己 复核,并填写配血试验结果.按“交叉配血核对制度进行.16、 各供血者间需进行交叉配血；已经输注的血液缺乏24小时的,供血者间也 需进行交叉配血.17、凝聚胺试剂还可用于辅助抗体筛检试验、辅助性抗人球蛋白试验和辅助性血 型鉴定.具体操作方法详见凝聚胺试剂盒使用说明书.18、判断结果后应仔细核对、记录,预防笔误.

13、交叉配血的影响因素及解决方法准确的交叉配血是临床平安有效输血的最后一条重要保证.输血配合是选择适合受血者输注的血液,使输血的成分能在受血者体内有效存活,并且无不良反响,即输 入的红细胞在受者体内必须不凝集和不溶血,输入的血浆成分不导致受者自身红细胞显著破坏,使受血者恢复健康.影响交叉配血的因素很多,主要如下：1 、标本 血标本的采集错误、稀释和溶血.另从受检者采集 I份新鲜血液标本,这样可 以纠正因污染或搞错样本造成的不合. 标本一般要求离体后尽快实验, 最长不能超过 3天,每次输血后受血者和供血者的血标本应在 28C保存7天. 患者的药物使用有时也对实验有一定影响,当受血者使用肝素治疗时,应

14、使用 硫酸鱼精蛋白对抗使标本凝集；如果受血者使用右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮 PVp 等治疗,应注意将红细胞洗涤. 受检者红细胞上抗原位点过少 如亚型或抗原性减弱见于白血病或恶性肿 瘤,以及类B或cisAB等.如疑为A抗原或B抗原减弱,那么可将受检红细胞与抗 A或抗一B血清做吸收及放散试验,以及用受检者唾液作 A、B、H血型物质测定只 对80% HAB分泌型的人有用.如受检者为A型血而疑为有类B抗原时,可用以下 方法进行鉴别：1观察细胞与抗一A及抗一B的凝集强度,与抗一A的反响要比与抗 B的反响强,这种区别用玻片法作试验更为明显；2用受检者红细胞与自身血清 作试验,血清中的抗一B不凝集自身红细胞上

15、的类B抗原；3检查唾液中是否有A、 B物质,如果是分泌型,可检出 A物质而无B物质；4核对患者的诊断,类B抗原 的形成与结肠癌、直肠癌、革兰阴性杆菌感染有关. 受检者血清中蛋白紊乱高球蛋白血症,或实验时温度过高,常引起红胞呈缗 钱状排列.如试验结果红细胞呈缗钱状排列,加等渗盐水 I滴.混和,往往可使缗钱 现象消失.注意不应先加盐水I滴于受检者血清中而后和红细胞做试验, 以免使血清 中抗体被稀释. 细菌污染或遗传因素引起多凝集或全凝集往往是正反定型不符的原因.如发现多凝集现象,应考虑由遗传产生的 Cad抗原活性；被细菌酶激活的T或TK受体；或 产生机制不太明了的Tn受体所引起.多凝集红细胞具有以

16、下特点：1能被人和许多 家兔的血清凝集；2能与大多数成年人的血清凝集,不管有无相应的同种抗体. 3 不被脐带血清凝集.4通常不与自身的血清凝集.5如有条件可用外源凝集素加以 鉴别. 检者血清中缺乏应有的抗-A及或抗一B抗体,如丙种球蛋白缺乏症,老年人血 清中抗体水平大幅度下降等.如果试验结果未见凝集,应将细胞及血清试验至少在室 温和4C放置30min,用显微镜检查核实. 血清中有意外抗体,如自身抗一I,常引起干扰.用A1、A2、B、0红细胞及自 身红细胞检查受检者血清.如果疑心是抗一I,用0型或ABO相合的脐血红细胞检 查. 各种原因引起的红细胞溶解,误判为不凝集.局部溶血时,可溶性血型物质中

17、 和了相应的抗体.将红细胞洗涤数次,配成25尬理盐水细胞悬液,用抗一A、抗一B、 抗一Al,抗一A十B及抗H做试验可以得到其它有用的信息.对受检红细胞作直接抗 球蛋白试验,如结果呈阳性,表示红细胞已被抗体致敏.2、试剂运输、贮存等条件不适可导致试剂变质失效,造成配血错误.实验前进行试剂 外观、效价等工程质量限制.不同抗凝剂制备的标准红细胞质量也不同；另外,红 细胞悬液过浓或过淡,抗原抗体比例不适当,使反响不明显,易误判为阴性反响.应 依据要求正确配制红细胞浓度.启用生理盐水时,应及时贴上启用时间；超期的试 剂要及时更换.使用过程中,疑心试剂污染时或配血结果可疑时,必须更换试剂.3 、冷凝集素在

18、ABC血型鉴定和交叉配血的过程中,冷凝集素是影响 ABC血型正反不符和交叉 配血不合的常见原因,尤其是在冬天气温较低时,某些病人血清中含有冷凝集素而导 致出现假阳性.正常人血清中冷凝集素效价一般不高,且在4C以下时才有活性.但由于人免疫系统的差异,在恶性肿瘤或病原体感染后有时冷反响性自身抗体可异常增 高,造成溶血性贫血.这种冷凝集素效价在4C可高于1000,用37C生理盐水洗涤红 细胞,操作时再置于37T水浴中轻轻摇动可以排除冷凝集素的干扰.4 、自身免疫性溶血性贫血红细胞被自身抗体强烈致敏后将干扰 ABO定型,且自身抗体的存在会导致交叉配 血不合,选择适宜的试验方法对红细胞上结合的抗体做放散

19、处理,确定抗体的特异性.如果抗体属于同种抗体,那么交叉配血时应选取该抗原阴性的献血者的血液.如果该抗 体无法确定特异性,那么交叉配血时要根据患者自身红细胞与自身血清的对照反响选取 较弱反响的献血者血液,由于自身抗体的干扰而发生ABO正反定型不相符时,可用37 C45 C生理盐水洗涤红细胞三次,或者用放散后的红细胞放散方法需不破坏红 细胞结构,血清定型那么可用洗涤或放散后的红细胞将血清中的自身抗体吸收后再进 行.5 、弱凝集血型试验是抗原抗体反响,当患者红细胞上抗原异常或血清中存在 ABO血型以外 的不规那么抗体时,可能会导致减弱的或缺少的凝集反响.抗原异常包括：亚型,这 种亚型红细胞抗原性较弱

20、,可以通过亚型定型试剂来具体定型. 红细胞抗原形成不 足或敏感性降低,如新生儿、老年人及少数恶病质患者.鉴定血型时要注意正反定型 的结合,加用抗H和抗A, B型标准血清、A2红细胞等检查唾液中的血型物质,必要 时作吸收放散试验以确定.假设血清中存在不规那么抗体可在反定型用O细胞加以鉴定,有些亚型由于抗原的某些位点缺失, 也会产生相对于缺失抗原位点的抗体,这些抗体的产生有助于亚型的判定.6 、细菌性凝集常见有类B凝集,A型或0型病人因大肠杆菌086感染,从而使红细胞上获得类 B抗原,能与抗B抗体发生凝集,表现为B或AB型.其不受温度影响,病情好转类B 凝集即消失.另外红细胞被细菌或细菌酶污染,红细胞上的T抗原被激活,与供血者中抗T抗体发生凝集.此种凝集在4°C和37°C之间随着温度的升高凝集程度逐渐减弱, 在37C时最弱或消失.7 、混合外观凝集现象出现混合外观凝集的情况时一般要核对标