酶工程_07-非水相酶催化反应-2012

1、T人类认识的进步T长期以来，人们认为酶只能在水相中进行催化，而有关长期以来，人们认为酶只能在水相中进行催化，而有关酶的催化理论是基于酶在水溶液中催化反应建立起来的酶的催化理论是基于酶在水溶液中催化反应建立起来的T传统的酶学理论认为，有机溶剂是酶的变性剂、失活剂，传统的酶学理论认为，有机溶剂是酶的变性剂、失活剂，酶在非水相中不具有催化能力酶在非水相中不具有催化能力T20 世纪初，世纪初，Bourquelot 等人将乙醇、丙酮等有机溶剂加等人将乙醇、丙酮等有机溶剂加入到酶的水溶液中，发现当含水量很高时，酶仍具有一入到酶的水溶液中，发现当含水量很高时，酶仍具有一定催化活力，但比水相中低很多定催化活力

2、，但比水相中低很多T1936 年，波兰的年，波兰的 Sym 报道了酯酶在有机溶剂中的催化报道了酯酶在有机溶剂中的催化作用，但一直存在争议，未能引起科学界的重视作用，但一直存在争议，未能引起科学界的重视T人类认识的进步TSym E. A., Biochemical Journal, 1936, 30: 609-617T人类认识的进步T1966 年，年，Dostoli 和和 Siegel 分别报道胰凝乳蛋白酶和辣根过氧化物分别报道胰凝乳蛋白酶和辣根过氧化物酶在几种非极性有机溶剂中具有催化活力酶在几种非极性有机溶剂中具有催化活力T19751983 年间，年间，Buckland 和和 Martinek

3、 等对游离酶和固定化酶在等对游离酶和固定化酶在有机溶剂中合成类固醇及甾醇转化中的应用进行了大量的探索有机溶剂中合成类固醇及甾醇转化中的应用进行了大量的探索T1977 年，年，Klibanov 等人报道了在水等人报道了在水/氯仿两相体系中脂肪酶催化氯仿两相体系中脂肪酶催化 N-乙酰乙酰-L-色氨酸与乙醇的酯化反应，在水中收率极低，而在两相体系色氨酸与乙醇的酯化反应，在水中收率极低，而在两相体系中竟达到中竟达到 100%TKlibanov A. M., et al., Biotechnol. Bioeng., 1977, 19(9): 1351-1361T1984 年，年，Zaks 和和 Klib

4、anov 在在 Science 杂志上发表了一篇关于酶在杂志上发表了一篇关于酶在有机介质中催化条件和特点的文章，他们指出，只要条件适合，酶有机介质中催化条件和特点的文章，他们指出，只要条件适合，酶可以在非水体系中表现出活性，并催化天然或非天然的底物发生转可以在非水体系中表现出活性，并催化天然或非天然的底物发生转化，这一报道引起了全球科学界的关注化，这一报道引起了全球科学界的关注T引起全球关注的“非水相酶催化”的报道TPorcine pancreatic lipase catalyzes the trans-esterification reaction between tributyrin a

5、nd various primary and secondary alcohols in a 99 percent organic medium. Upon further dehydration, the enzyme becomes extremely thermo-stable. Not only can the dry lipase withstand heating at 100 degrees C for many hours, but it exhibits a high catalytic activity at that temperature. Reduction in w

6、ater content also alters the substrate specificity of the lipase: in contrast to its wet counterpart, the dryenzyme does not react with bulky tertiary alcohols.TZaks A., and Klibanov A. M., Enzymatic catalysis in organic media at 100 degrees C, Science, 1984, 224: 1249-1251 (DOI: 10.1126/science.672

7、9453)T人类认识的进步T1984 年之后，非水相中的酶催化研究开始活跃起来年之后，非水相中的酶催化研究开始活跃起来T近年来，人们对非水介质中的酶结构与功能、酶作用机近年来，人们对非水介质中的酶结构与功能、酶作用机制、酶作用动力学等进行了大量研究，建立起非水酶学制、酶作用动力学等进行了大量研究，建立起非水酶学（non-aqueous enzymology）T同时人们还对酶催化的介质进行了大量研究，开发出各同时人们还对酶催化的介质进行了大量研究，开发出各种非水介质和新的酶促反应体系，发展出了介质工程种非水介质和新的酶促反应体系，发展出了介质工程（medium engineering），拓宽了酶

8、催化反应的应用范），拓宽了酶催化反应的应用范围，使酶法合成逐步发展成为与化学法合成相互补充的围，使酶法合成逐步发展成为与化学法合成相互补充的合成方法合成方法T非水相酶催化概论T非水相酶催化的优势非水相酶催化的优势T增加某些底物的增加某些底物的溶解度溶解度T采用有机相，可以增大某些有机底物的溶解度，从而加速反应采用有机相，可以增大某些有机底物的溶解度，从而加速反应T改变反应改变反应平衡平衡T在有机介质中，由于水的含量极微，导致酶促水解反应逆向进行在有机介质中，由于水的含量极微，导致酶促水解反应逆向进行T例：蛋白酶在水相中催化肽链水解，在有机相中催化肽链合成例：蛋白酶在水相中催化肽链水解，在有机相

9、中催化肽链合成T改变或提高酶的改变或提高酶的选择性选择性T例如，无水吡啶中枯草杆菌蛋白酶选择性酰化例如，无水吡啶中枯草杆菌蛋白酶选择性酰化 castanospermineT非水相酶催化概论T生物催化的介质系统生物催化的介质系统T均相体系均相体系T单一的水相或水缓冲液单一的水相或水缓冲液T互溶的水互溶的水/有机溶剂系统有机溶剂系统T微水有机溶剂微水有机溶剂T超临界流体介质超临界流体介质T离子液体介质离子液体介质T非均相体系：两相或多相非均相体系：两相或多相T水水/有机溶剂（非互溶）两相系统有机溶剂（非互溶）两相系统T乳状液或微乳液系统乳状液或微乳液系统T无溶剂或寡溶剂系统无溶剂或寡溶剂系统T气相

10、合成气相合成T固相合成固相合成T本章主要内容T有机介质中的酶催化有机介质中的酶催化 T水对酶催化反应的影响水对酶催化反应的影响T有机溶剂对酶催化反应的影响有机溶剂对酶催化反应的影响T有机介质中酶催化反应的类型有机介质中酶催化反应的类型T酶在有机介质中的催化特性酶在有机介质中的催化特性T有机介质中酶催化反应的条件及其控制有机介质中酶催化反应的条件及其控制T其他介质中的酶催化简介（简单了解）其他介质中的酶催化简介（简单了解）T气相介质中的酶催化气相介质中的酶催化T超临界流体介质中的酶催化超临界流体介质中的酶催化T离子液体介质中的酶催化离子液体介质中的酶催化T酶非水相催化的应用酶非水相催化的应用T有

11、机介质中的酶催化T定义：酶在含有定义：酶在含有的有机溶剂中进行的催化反应的有机溶剂中进行的催化反应T适用范围适用范围T底物、产物或其一为疏水性物质的酶催化作用底物、产物或其一为疏水性物质的酶催化作用T特性特性T酶的底物特异性、立体选择性、区域选择性、键选择性、热稳定酶的底物特异性、立体选择性、区域选择性、键选择性、热稳定性等有所改变性等有所改变T应用应用T多肽、酯类、甾体转化、功能高分子合成、手性药物拆分的研究多肽、酯类、甾体转化、功能高分子合成、手性药物拆分的研究T有机介质中的酶催化T有机溶剂中酶分子存在形式有机溶剂中酶分子存在形式T固态酶：以固体形式存在于有机相中固态酶：以固体形式存在于有

12、机相中T冷冻干燥的酶粉冷冻干燥的酶粉T固定化酶固定化酶T结晶酶结晶酶 今后的热点今后的热点T可溶解酶可溶解酶T水溶性大分子共价修饰酶水溶性大分子共价修饰酶T非共价修饰的高分子非共价修饰的高分子/酶复合物酶复合物T表面活性剂表面活性剂/酶复合物酶复合物T微乳液中的酶微乳液中的酶T有机介质中的酶催化T酶分散在有机溶剂中的形态酶分散在有机溶剂中的形态T酶在有机溶剂中以悬浮状态起催化作用酶在有机溶剂中以悬浮状态起催化作用T有机介质中的酶催化T影响酶三维构象和活力的因素影响酶三维构象和活力的因素：(1) 酶分子结构变化酶分子结构变化T导致酶活力变化的主要原因不是酶分子活性中心的改变，而是酶导致酶活力变化

13、的主要原因不是酶分子活性中心的改变，而是酶分子结构的分子结构的T酶分子在水溶液中以其紧密的空间结构和一定的柔性发挥催化功能酶分子在水溶液中以其紧密的空间结构和一定的柔性发挥催化功能T有机溶剂中酶分子构象部分破坏的原因与溶剂的电性能有关有机溶剂中酶分子构象部分破坏的原因与溶剂的电性能有关T水化程度的提高和溶剂介电常数的增大，都能增加酶分子的柔性水化程度的提高和溶剂介电常数的增大，都能增加酶分子的柔性T固态固态 NMR 实验证实，实验证实，在在冷冻干燥过程中，冷冻干燥过程中， -胰凝乳蛋白酶的胰凝乳蛋白酶的酶活酶活性中心会被破坏；而由性中心会被破坏；而由 FTIR 的实验结果得知，冷冻干燥会诱导蛋

14、的实验结果得知，冷冻干燥会诱导蛋白质二级结构发生可逆改变，增加白质二级结构发生可逆改变，增加 -折叠结构的含量，而降低折叠结构的含量，而降低 -螺旋结构的含量螺旋结构的含量T有机介质中的酶催化T影响酶三维构象和活力的因素影响酶三维构象和活力的因素：(2) 有机溶剂有机溶剂T不同有机溶剂使酶发生不同有机溶剂使酶发生的程度不同的程度不同T碱性磷酸酯酶在亲水有机溶剂中的不可逆失活作用碱性磷酸酯酶在亲水有机溶剂中的不可逆失活作用 所选的四种有所选的四种有机溶剂均能与水混机溶剂均能与水混溶。经过较长时间溶。经过较长时间（36 h）的处理，）的处理，四种有机溶剂都使四种有机溶剂都使碱性磷酸酯酶发生碱性磷酸

15、酯酶发生不可逆失活，而在不可逆失活，而在丙酮和乙腈中，酶丙酮和乙腈中，酶活力损失得最多。活力损失得最多。T有机介质中的酶催化T为什么酶在有机介质中具有催化活力为什么酶在有机介质中具有催化活力T结构因素结构因素T通过酶在水相和有机相中的结构比较，证实了有机相中酶能够保持通过酶在水相和有机相中的结构比较，证实了有机相中酶能够保持其整体结构的其整体结构的 ，至少酶活性部位与水溶液中的结构是相同，至少酶活性部位与水溶液中的结构是相同的的T不同介质中酶活性中心的完整性相差不大，但酶活力却相差不同介质中酶活性中心的完整性相差不大，但酶活力却相差4个数个数量级，因此认为酶分子结构的量级，因此认为酶分子结构的

16、 很可能是主要因素很可能是主要因素?T有机介质中的酶催化T为什么酶在有机介质中具有催化活力为什么酶在有机介质中具有催化活力T作用力因素作用力因素 氢键效应氢键效应T酶分子的酶分子的“紧密紧密”状态主要取决于蛋白质分子内的氢键，而溶液中状态主要取决于蛋白质分子内的氢键，而溶液中水分子与蛋白质分子之间形成的氢键使蛋白质分子内氢键发生一定水分子与蛋白质分子之间形成的氢键使蛋白质分子内氢键发生一定程度的破坏，蛋白结构变得松散，呈一种程度的破坏，蛋白结构变得松散，呈一种“开启开启”状态状态T酶分子的酶分子的“”和和“”两种状态处于一种可交换的平衡，两种状态处于一种可交换的平衡，表现出一定的柔性表现出一定

17、的柔性?T有机介质中的酶催化T为什么酶在有机介质中具有催化活力为什么酶在有机介质中具有催化活力T酶分子的酶分子的“紧密（紧密（compact）”和和“开启（开启（unlocking）”两种两种状态处于一种可交换的平衡，表现出一定的柔性（状态处于一种可交换的平衡，表现出一定的柔性（flexibility）?T有机介质中的酶催化T常见的有机介质体系常见的有机介质体系T(a) 微水介质体系（微水介质体系（micro-aqueous media system）T由有机溶剂和由有机溶剂和组成的反应体系，即通常所说的有机介质体组成的反应体系，即通常所说的有机介质体系系T大部分的微量水以酶分子的大部分的微量

18、水以酶分子的形式存在，对维持酶分子的空形式存在，对维持酶分子的空间构象和催化活性至关重要；另一部分水分配在有机溶剂中间构象和催化活性至关重要；另一部分水分配在有机溶剂中T酶以固态的形式酶以固态的形式于有机介质中于有机介质中T有机介质中的酶催化T常见的有机介质体系常见的有机介质体系T(b) 与水溶性有机溶剂组成的均一体系与水溶性有机溶剂组成的均一体系T水水 / 极性有机溶剂混溶体系，水和有机相的比例都很大，酶和底物极性有机溶剂混溶体系，水和有机相的比例都很大，酶和底物以溶解的状态存在于此体系中以溶解的状态存在于此体系中T强极性有机溶剂对酶的结构和强极性有机溶剂对酶的结构和 ，适用的酶较少，适用的

19、酶较少T例：辣根过氧化物酶（例：辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）在此）在此类介质中能催化酚类或芳香胺的聚合类介质中能催化酚类或芳香胺的聚合T有机介质中的酶催化T常见的有机介质体系常见的有机介质体系T(c) 与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系T由水和疏水有机溶剂组成两相或多相体系由水和疏水有机溶剂组成两相或多相体系T游离酶、亲水性底物溶于水相，疏水性底物或产物溶于有机相，固游离酶、亲水性底物溶于水相，疏水性底物或产物溶于有机相，固定化酶则悬浮于两相的界面；催化反应在定化酶则悬浮于两相的界面；催化反应在 进行进行T有机

20、介质中的酶催化T常见的有机介质体系常见的有机介质体系T(d) 胶束体系胶束体系T正胶束体系（正胶束体系（normal micelles system）T水为主体，表面活性剂的极性端朝外，非极性端朝内，酶在液水为主体，表面活性剂的极性端朝外，非极性端朝内，酶在液相主体中，反应在胶束两相界面进行相主体中，反应在胶束两相界面进行T反胶束体系（反胶束体系（reverse micelles system）T有机溶剂为主体，表面活性剂的极性端朝内，非极性端朝外，有机溶剂为主体，表面活性剂的极性端朝内，非极性端朝外，酶在反胶束内部的水相中，反应在胶束两相界面进行酶在反胶束内部的水相中，反应在胶束两相界面进行

21、T有机介质中的酶催化T常见的有机介质体系常见的有机介质体系 胶束体系示意图胶束体系示意图T有机介质中的酶催化T常见的有机介质体系常见的有机介质体系T酶包埋在反胶束中，可以在模拟体内环境的情况下，研究酶的结酶包埋在反胶束中，可以在模拟体内环境的情况下，研究酶的结构和动力学性质构和动力学性质T不同类型的酶在反胶束中的排布模型不同类型的酶在反胶束中的排布模型T有机介质中的酶催化T有机介质中水对酶催化反应的影响有机介质中水对酶催化反应的影响T与酶粉水合的结合水、固定载体和其他杂质的结合水与酶粉水合的结合水、固定载体和其他杂质的结合水T溶于有机溶剂中溶于有机溶剂中T与酶结合的与酶结合的 ，以及水在酶分子

22、中的，以及水在酶分子中的 是影响酶的活力、是影响酶的活力、稳定性以及专一性的决定因素稳定性以及专一性的决定因素T水对于酶催化活性构象的获得与保持是必须的，但水也与许多酶水对于酶催化活性构象的获得与保持是必须的，但水也与许多酶的失活过程有关，即水对酶催化反应具有的失活过程有关，即水对酶催化反应具有 T有机介质中的酶催化T水在酶催化反应中的双重作用水在酶催化反应中的双重作用T一方面，水分子直接或间接地通过氢键、疏水键、范德华力等非一方面，水分子直接或间接地通过氢键、疏水键、范德华力等非共价相互作用来维持酶的催化活性所必需的构象共价相互作用来维持酶的催化活性所必需的构象T水分子与部分氨基酸残基之间形

23、成氢键，对稳定酶分子的构象起重水分子与部分氨基酸残基之间形成氢键，对稳定酶分子的构象起重要作用要作用T酶分子周围水的存在（水化层），能降低酶分子中极性氨基酸残基酶分子周围水的存在（水化层），能降低酶分子中极性氨基酸残基之间的相互作用，防止产生不正确的构象之间的相互作用，防止产生不正确的构象T有机介质中的酶催化T水在酶催化反应中的双重作用水在酶催化反应中的双重作用T另一方面，水是导致酶的热失活的重要因素，有水存在时随着温另一方面，水是导致酶的热失活的重要因素，有水存在时随着温度的升高酶分子会发生变化而失活度的升高酶分子会发生变化而失活T含水量过高，则酶分子柔性过大，酶的构象将向疏水环境下热力学含

24、水量过高，则酶分子柔性过大，酶的构象将向疏水环境下热力学稳定的状态变化，引起酶结构的改变和失活稳定的状态变化，引起酶结构的改变和失活T二硫键受到破坏，酶分子容易形成不规则结构二硫键受到破坏，酶分子容易形成不规则结构T部分残基（如部分残基（如Asn 和和 Gln）水解，甚至部分肽键也能发生水解）水解，甚至部分肽键也能发生水解T因此，酶蛋白结构的动力学刚性（因此，酶蛋白结构的动力学刚性（kinetic rigidity）和热力学稳定）和热力学稳定性（性（thermodynamic stability）之间存在平衡点，使酶分子的活性）之间存在平衡点，使酶分子的活性最大最大T有机介质中的酶催化T通常是

25、与酶分子通常是与酶分子 的一层左右的水分子，即的一层左右的水分子，即 T不同酶与必需水结合的紧密程度，以及所结合的必需水数量是不不同酶与必需水结合的紧密程度，以及所结合的必需水数量是不同的同的T必需水是维持酶分子间次级键所必需的，是维持酶构象的必需水是维持酶分子间次级键所必需的，是维持酶构象的“润滑润滑剂剂”T有机介质中的酶催化T水对蛋白质流动性（水对蛋白质流动性（protein mobility）及酶活力的影响）及酶活力的影响T有机溶剂中活性位点的流动性随水的加入有显著的增加，最可信有机溶剂中活性位点的流动性随水的加入有显著的增加，最可信的解释是水作为增塑剂，增加蛋白质结构的的解释是水作为增

26、塑剂，增加蛋白质结构的，也增加了酶的，也增加了酶的T乙醇脱氢酶和枯草杆菌蛋白酶活性位点自旋标记乙醇脱氢酶和枯草杆菌蛋白酶活性位点自旋标记 EPR 光谱实验光谱实验T利用利用 NH 互换互换 NMR 光谱研究光谱研究 THF 中中 Cyt C 的结构动力学的结构动力学T在有机溶剂中加到固态酶制剂上的水会通过增加酶活性位点的极在有机溶剂中加到固态酶制剂上的水会通过增加酶活性位点的极性和柔性而提高其活力性和柔性而提高其活力T干态下，酶分子带电基团和极性基团相互作用产生一个失活的锁住干态下，酶分子带电基团和极性基团相互作用产生一个失活的锁住的构象的构象T水的作用是与这些功能基团形成氢键，屏蔽离子化基团

27、之间的静电水的作用是与这些功能基团形成氢键，屏蔽离子化基团之间的静电作用，并中和肽链中肽单元和极性侧链基团之间的偶极相互作用作用，并中和肽链中肽单元和极性侧链基团之间的偶极相互作用T有机介质中的酶催化T水对蛋白质流动性（水对蛋白质流动性（protein mobility）及酶活力的影响）及酶活力的影响T次级键在控制有机相中酶的催化行为方面可能起主要作用次级键在控制有机相中酶的催化行为方面可能起主要作用T通过向溶剂中加入通过向溶剂中加入“氢键形成物氢键形成物”可以得到验证，例如，加入可以得到验证，例如，加入 3% 甲酰胺使辛醇（含水甲酰胺使辛醇（含水 1%）中的多酚氧化酶的活力提高）中的多酚氧化

28、酶的活力提高 35 倍倍T在有机介质中酶所表现的一些新性质可能与酶在非水环境中所具在有机介质中酶所表现的一些新性质可能与酶在非水环境中所具有的刚性构象有关，而这些性质将会因水增加了柔性而改变有的刚性构象有关，而这些性质将会因水增加了柔性而改变T例例1：有机介质中枯草杆菌蛋白酶的表观：有机介质中枯草杆菌蛋白酶的表观 pKa 值取决于所用的溶剂值取决于所用的溶剂及溶剂中的水含量，酶的水合可使表观及溶剂中的水含量，酶的水合可使表观 pKa 值降低值降低 1T例例2：枯草杆菌蛋白酶的干酶在庚醇：枯草杆菌蛋白酶的干酶在庚醇 / 三丁酸甘油酯中的热稳定性三丁酸甘油酯中的热稳定性很好（很好（100 oC 时

29、半衰期时半衰期 12 h），但仅加入），但仅加入 0.8% 的水时，其活力基的水时，其活力基本消失本消失T有机介质中的酶催化T水对酶催化反应速率的影响水对酶催化反应速率的影响（难点）（难点）T典型的非水酶体系中水含量通常只占典型的非水酶体系中水含量通常只占 0.01%，但其微小差距会导，但其微小差距会导致酶催化活力的较大改变致酶催化活力的较大改变T在最适含水量时，酶蛋白结构的动力学刚性（在最适含水量时，酶蛋白结构的动力学刚性（kinetic rigidity）和热）和热力学稳定性（力学稳定性（thermodynamic stability）之间达平衡点，酶活性最大）之间达平衡点，酶活性最大T酶

30、含水量酶含水量 最适含水量，酶构象过于最适含水量，酶构象过于“柔性柔性”，因变构而失活，因变构而失活T同一种酶，反应系统的最适含水量与有机溶剂的种类、酶的纯度、同一种酶，反应系统的最适含水量与有机溶剂的种类、酶的纯度、固定化酶的载体性质和修饰性质等因素有关固定化酶的载体性质和修饰性质等因素有关T有机介质中的酶催化T水对酶催化反应速率的影响水对酶催化反应速率的影响T溶菌酶酶粉在水合过程中酶活力与酶含水量之间的关系溶菌酶酶粉在水合过程中酶活力与酶含水量之间的关系结合水含量结合水含量(%)酶周围水分子个数酶周围水分子个数作用作用0 70 60有助于蛋白质侧链残基的离子化有助于蛋白质侧链残基的离子化7

31、 2560 2207% 水分子在其他极性部位形成簇，水分子在其他极性部位形成簇，25% 肽键的氨基被水合，蛋白质结构基本不变，肽键的氨基被水合，蛋白质结构基本不变，酶活不变酶活不变25 38220 300肽键羧基为主的极性部位完全水合，酶活肽键羧基为主的极性部位完全水合，酶活力随含水量增加而增加力随含水量增加而增加 38 300整个酶分子被水层包围，水分子在活性位整个酶分子被水层包围，水分子在活性位点之间形成水束，掩盖活性位点的极性，点之间形成水束，掩盖活性位点的极性，酶活力只有水溶液中的酶活力只有水溶液中的 1/10T有机介质中的酶催化T水对酶催化反应速率的影响水对酶催化反应速率的影响T三种

32、酶在不同溶剂中水含量对酶活的影响三种酶在不同溶剂中水含量对酶活的影响T有机介质中的酶催化T水活度（水活度（water activity）T为了排除溶剂对最适含水量的影响，为了排除溶剂对最适含水量的影响，Halling 建议用建议用“水活度水活度”描述有机介质中酶催化活力与水的关系描述有机介质中酶催化活力与水的关系T体系中水的逸度（体系中水的逸度（fugacity）与纯水逸度之比，）与纯水逸度之比，Tf 一定条件下体系中水的逸度一定条件下体系中水的逸度Tf0 相同条件下纯水的逸度相同条件下纯水的逸度Tp 一定条件下体系中水的蒸气压一定条件下体系中水的蒸气压Tp0 相同条件下纯水的蒸气压相同条件下

33、纯水的蒸气压(7-1)w00fpAfpT有机介质中的酶催化T水活度（水活度（water activity）T不同类型介质的水活度不同类型介质的水活度T对于非极性或弱极性溶剂：对于非极性或弱极性溶剂：T w 水的活度系数水的活度系数Txw 水的摩尔比水的摩尔比T对于极性大的溶剂：对于极性大的溶剂：TYw 气相中水的摩尔比例气相中水的摩尔比例TpT 气相总压力气相总压力Tp0 相同条件下水的饱和蒸气压（纯水蒸气压）相同条件下水的饱和蒸气压（纯水蒸气压）wwwAx (7-2)Tww0pAYp(7-3)T有机介质中的酶催化T水活度（水活度（water activity）T最适含水量与溶剂极性成正比，而

34、最适含水量与溶剂极性成正比，而，故采用水活度作参数更确切，故采用水活度作参数更确切T各种酶因结构不同，维持酶活性构象的必需水也不同，大部分酶各种酶因结构不同，维持酶活性构象的必需水也不同，大部分酶需较高的水活度才表现较好的活力需较高的水活度才表现较好的活力T非水介质中酶要表现出最大活力，不仅需要有适当的水活度，而非水介质中酶要表现出最大活力，不仅需要有适当的水活度，而且水的位置也要正确且水的位置也要正确T对枯草杆菌蛋白酶进行超声波处理，可使酶活显著提高，这可能是对枯草杆菌蛋白酶进行超声波处理，可使酶活显著提高，这可能是结合在酶蛋白中的水分子在超声场中重新排布造成的结合在酶蛋白中的水分子在超声场

35、中重新排布造成的T有机介质中的酶催化T水活度（水活度（water activity）T在不同溶剂中研究酶动力学时为了避免水的影响，最好保持恒定在不同溶剂中研究酶动力学时为了避免水的影响，最好保持恒定的水活度的水活度T获取恒定水活度的方式获取恒定水活度的方式T用一饱和盐水溶液分别预平衡底物溶液和酶制剂用一饱和盐水溶液分别预平衡底物溶液和酶制剂T向反应体系中直接加入一种水合盐向反应体系中直接加入一种水合盐T向每一溶剂中加入不同量的水向每一溶剂中加入不同量的水T有机介质中的酶催化T有机溶剂对酶催化反应的影响有机溶剂对酶催化反应的影响T有机溶剂通过与水、酶、底物和产物的相互作用，直接或间接影有机溶剂通

36、过与水、酶、底物和产物的相互作用，直接或间接影响酶的活性和稳定性响酶的活性和稳定性T有机溶剂主要通过以下有机溶剂主要通过以下发生作用发生作用T(1) 有机溶剂与有机溶剂与直接发生作用，通过干扰氢键和疏水键等改变酶直接发生作用，通过干扰氢键和疏水键等改变酶的构象，从而导致酶的活性被抑制或酶的失活的构象，从而导致酶的活性被抑制或酶的失活T(2) 有机溶剂和能扩散的有机溶剂和能扩散的相互作用，影响正常反应相互作用，影响正常反应的进行的进行T(3) 有机溶剂直接和酶分子周围的有机溶剂直接和酶分子周围的相互作用相互作用T有机介质中的酶催化T有机溶剂对酶活性的影响有机溶剂对酶活性的影响（难点）（难点）T对

37、酶分子对酶分子的影响的影响T酶分子与溶剂的直接接触，其表面结构发生不可忽视的变化酶分子与溶剂的直接接触，其表面结构发生不可忽视的变化T例：枯草杆菌蛋白酶在乙腈中，有例：枯草杆菌蛋白酶在乙腈中，有 12 个乙腈分子结合到酶分子中，个乙腈分子结合到酶分子中，其中有其中有 4 个是原来水分子结合的位点个是原来水分子结合的位点T对酶活性中心对酶活性中心的影响的影响T有机溶剂可减少整个活性中心的数量；活性中心数目丧失的多少取有机溶剂可减少整个活性中心的数量；活性中心数目丧失的多少取决于溶剂的疏水性强弱决于溶剂的疏水性强弱T溶剂分子能渗透入酶的活性中心，与底物竞争酶活性中心的结合位溶剂分子能渗透入酶的活性

38、中心，与底物竞争酶活性中心的结合位点，降低活性中心的极性，增加酶与底物的静电斥力点，降低活性中心的极性，增加酶与底物的静电斥力T例：甲醇可进入辣根过氧化物酶的活性中心，与铁卟啉配位结合例：甲醇可进入辣根过氧化物酶的活性中心，与铁卟啉配位结合T有机介质中的酶催化T有机溶剂对酶活性的影响有机溶剂对酶活性的影响（难点）（难点）T对对的影响的影响T亲水有机溶剂能夺取酶分子表面的必需水而使酶失水亲水有机溶剂能夺取酶分子表面的必需水而使酶失水T由于酶与溶剂竞争水分子，体系的最适含水量与酶的用量及由于酶与溶剂竞争水分子，体系的最适含水量与酶的用量及底物浓度有关底物浓度有关T增加酶表面的亲水性可以限制酶在有机

39、溶剂中的脱水作用增加酶表面的亲水性可以限制酶在有机溶剂中的脱水作用T例如：例如： -胰凝乳蛋白酶用胰凝乳蛋白酶用 1,2,4,5-苯均四甲酸二酐共价修饰后，苯均四甲酸二酐共价修饰后，酶分子表面亲水性提高，在有机溶剂中的稳定性提高酶分子表面亲水性提高，在有机溶剂中的稳定性提高T有机介质中的酶催化（重点）（重点）TP 表示溶剂在表示溶剂在 两相体系中分配系数，通常用其对数形式两相体系中分配系数，通常用其对数形式表示，即表示，即 lgPT酶活力与酶活力与 lgP 值之间的定量关系值之间的定量关系 Laane 实验实验TlgP 4，酶具有较高活力，此类溶剂较理想，酶具有较高活力，此类溶剂较理想T2 l

40、gP 4，酶活力中等，酶活力中等T结论：如何选择合适的反应溶剂结论：如何选择合适的反应溶剂 ？T有机介质中的酶催化TlgP 值与结合水夺取能力的分析值与结合水夺取能力的分析（重点）（重点）T现象现象 1：很多酶在甲醇中的活力很低：很多酶在甲醇中的活力很低T现象现象 2：正己烷经常被用于酶的有机相催化反应介质：正己烷经常被用于酶的有机相催化反应介质T从从 和和 lgP 值分析原因值分析原因T甲醇的极性很强，亲水性亦很强，实验表明甲醇能夺取酶分子中甲醇的极性很强，亲水性亦很强，实验表明甲醇能夺取酶分子中 60% 的结合水的结合水T正己烷的极性很弱，亲水性也很弱，实验表明正己烷只能夺取酶分正己烷的极

41、性很弱，亲水性也很弱，实验表明正己烷只能夺取酶分子中子中 0.5% 的结合水的结合水溶剂溶剂介电常数介电常数 溶剂极性参数溶剂极性参数 lgP甲醇（甲醇（methanol）32.35 0.76正己烷（正己烷（n-hexane）1.893.5T有机介质中的酶催化T有机溶剂对酶活性的影响有机溶剂对酶活性的影响 溶剂极性与酶活力的关系溶剂极性与酶活力的关系T某些酶不完全符合某些酶不完全符合 Laane 提出的酶活力与提出的酶活力与 lgP 的关系，说明酶的关系，说明酶活力也与溶剂的其它性质有关活力也与溶剂的其它性质有关TlgSw/o (Sw/o：水在此溶剂中的溶解度：水在此溶剂中的溶解度)：醇脱氢酶

42、的酶活力与：醇脱氢酶的酶活力与 lgSw/o存在线性关系存在线性关系T溶剂的几何形状（手性）：部分酶在溶剂的几何形状（手性）：部分酶在 S-、R-构型溶剂中活力不同，构型溶剂中活力不同，例如多酚氧化酶在例如多酚氧化酶在 S-构型溶剂中的活力高于在构型溶剂中的活力高于在 R-构型溶剂中活力构型溶剂中活力T相毒性：独立存在的有机相是使酶失活的重要因素相毒性：独立存在的有机相是使酶失活的重要因素 水相水相 / 有有机相的界面效应，与接触面积有关机相的界面效应，与接触面积有关T有机介质中的酶催化T溶剂对底物和产物分配的影响溶剂对底物和产物分配的影响T酶的酶的“必需水必需水”层是底物、产物分布的中介层是

43、底物、产物分布的中介T有机溶剂能改变酶分子有机溶剂能改变酶分子“必需水必需水”层中底物或产物的浓度层中底物或产物的浓度T有机溶剂极性小，疏水性强，疏水性底物难于进入有机溶剂极性小，疏水性强，疏水性底物难于进入“必需水必需水”层层T有机溶剂极性强，亲水性强，疏水性底物在有机溶剂中溶解度太低有机溶剂极性强，亲水性强，疏水性底物在有机溶剂中溶解度太低T如何选择如何选择 ？T选择选择 2 lgP 5 的有机溶剂作为反应介质最适宜的有机溶剂作为反应介质最适宜T有机介质中的酶催化T小结小结T水的影响水的影响T“必需水必需水”T最适含水量最适含水量T水活度水活度T有机溶剂的影响有机溶剂的影响T溶剂的介电常数

44、溶剂的介电常数 和极性参数和极性参数 lgPT溶剂对结合水、底物、产物的影响：结合溶剂对结合水、底物、产物的影响：结合 和和 lgP 值讨论值讨论T溶剂的选择：溶剂的选择： 、lgP 值、其他因素值、其他因素T有机介质中的酶催化T有机介质中酶催化反应的类型有机介质中酶催化反应的类型T合成反应合成反应T转移反应转移反应T醇解反应醇解反应T氨解反应氨解反应T异构化反应异构化反应T氧化还原反应氧化还原反应T裂合反应裂合反应 / 加成反应加成反应T有机介质中的酶催化T有机介质中酶催化反应的类型有机介质中酶催化反应的类型 合成反应合成反应T水解酶在有机介质中能催化水解的逆反应，即合成反应水解酶在有机介质

45、中能催化水解的逆反应，即合成反应 (Why ?)T酯的合成：脂肪酶酯的合成：脂肪酶/酯酶的有机相催化酯酶的有机相催化T例如，假单孢菌脂肪酶催化的反应：例如，假单孢菌脂肪酶催化的反应：T有机介质中的酶催化T有机介质中酶催化反应的类型有机介质中酶催化反应的类型 合成反应合成反应T蛋白酶在有机相中催化多肽合成蛋白酶在有机相中催化多肽合成T有机介质中的酶催化T有机介质中酶催化反应的类型有机介质中酶催化反应的类型 转移反应转移反应T酯交换反应（转酯反应）酯交换反应（转酯反应）T例如，猪胰脂肪酶对外消旋体的拆分：例如，猪胰脂肪酶对外消旋体的拆分：T有机介质中的酶催化T有机介质中酶催化反应的类型有机介质中酶

46、催化反应的类型 醇解反应醇解反应T假单胞脂肪酶催化酸酐醇解生成二酸单酯化合物假单胞脂肪酶催化酸酐醇解生成二酸单酯化合物T思考：醇解反应能在水相中进行吗？思考：醇解反应能在水相中进行吗？T有机介质中的酶催化T有机介质中酶催化反应的类型有机介质中酶催化反应的类型 氨解反应氨解反应T脂肪酶催化酯类进行不对称氨解反应脂肪酶催化酯类进行不对称氨解反应T环氧化合物的氨解环氧化合物的氨解T有机介质中的酶催化T有机介质中酶催化反应的类型有机介质中酶催化反应的类型 异构化反应异构化反应TD-ACL（D-3-amino-2- -caprolactam）的异构化）的异构化T木糖异构酶催化的异构化反应木糖异构酶催化的

47、异构化反应T有机介质中的酶催化T有机介质中酶催化反应的类型有机介质中酶催化反应的类型 氧化还原反应氧化还原反应T单加氧反应单加氧反应T双加氧反应双加氧反应T有机介质中的酶催化T有机介质中酶催化反应的类型有机介质中酶催化反应的类型 氧化还原反应氧化还原反应T脱氢酶催化的还原反应：羰基的还原脱氢酶催化的还原反应：羰基的还原T有机介质中的酶催化T有机介质中酶催化反应的类型有机介质中酶催化反应的类型 氧化还原反应氧化还原反应T脂肪烃脂肪烃 CH 键、键、C = C 键氧化键氧化T有机介质中的酶催化T有机介质中酶催化反应的类型有机介质中酶催化反应的类型 裂合反应裂合反应 / 加成反应加成反应T羰基的加成

48、与缩合反应羰基的加成与缩合反应T有机介质中的酶催化T酶在有机介质中的催化特性酶在有机介质中的催化特性（重点、难点）（重点、难点）T有机相中酶催化特性改变（什么原因？）有机相中酶催化特性改变（什么原因？）T有机溶剂的存在，改变了疏水相互作用的精细平衡，从而影响到酶有机溶剂的存在，改变了疏水相互作用的精细平衡，从而影响到酶的结合部位的结合部位T有机溶剂改变了底物的存在状态（亲水有机溶剂改变了底物的存在状态（亲水 / 疏水）疏水）T影响影响T底物特异性底物特异性T立体选择性立体选择性T区域选择性区域选择性T化学键选择性化学键选择性T其他其他 热稳定性、热稳定性、pH 特性特性有机相中酶能够催化新的反

49、应，生成新产物有机相中酶能够催化新的反应，生成新产物T有机介质中的酶催化T酶在有机介质中的催化特性酶在有机介质中的催化特性 底物专一性底物专一性T有机介质中酶活性中心结合部位与底物的结合状态发生改变，致有机介质中酶活性中心结合部位与底物的结合状态发生改变，致使酶的底物特异性发生改变使酶的底物特异性发生改变T解释：疏水性的相对强弱；底物在酶表面和溶剂中的分配变化解释：疏水性的相对强弱；底物在酶表面和溶剂中的分配变化T有机介质中的酶催化T酶在有机介质中的催化特性酶在有机介质中的催化特性 底物专一性底物专一性T不同的有机介质，酶的底物专一性也不一样不同的有机介质，酶的底物专一性也不一样T极性较强的有

50、机溶剂中，疏水性较强的底物易反应极性较强的有机溶剂中，疏水性较强的底物易反应T极性较弱的有机溶剂中，疏水性较弱的底物易反应极性较弱的有机溶剂中，疏水性较弱的底物易反应T有机介质中的酶催化T酶在有机介质中的催化特性酶在有机介质中的催化特性 对映体选择性对映体选择性T对映体选择性（对映体选择性（enantioselectivity）是酶在对称的外消旋化合物）是酶在对称的外消旋化合物中识别一种异构体的能力大小的指标中识别一种异构体的能力大小的指标T立体选择系数（立体选择系数（KLD）TKm 米氏常数米氏常数TKcat 酶的转换数酶的转换数/catmLLDcatmDKKKKK(7-4)T有机介质中的酶

51、催化T酶在有机介质中的催化特性酶在有机介质中的催化特性 对映体选择性对映体选择性T酶在水溶液中催化的对映体选择性较强，而在疏水性强的有机介酶在水溶液中催化的对映体选择性较强，而在疏水性强的有机介质中对映体选择性较差（为什么？）质中对映体选择性较差（为什么？）T可能的原因：底物的两种对映体与酶分子的结合方式不同，因此把可能的原因：底物的两种对映体与酶分子的结合方式不同，因此把水分子从酶分子疏水结合位点置换出来的能力不同水分子从酶分子疏水结合位点置换出来的能力不同T有机介质中的酶催化T酶在有机介质中的催化特性酶在有机介质中的催化特性 对映体选择性对映体选择性T溶剂几何形状的影响溶剂几何形状的影响T

52、Ottolina 报道一些脂肪酶、蛋白酶在报道一些脂肪酶、蛋白酶在 (R)-香芹酮及香芹酮及 (S)-香芹酮中对香芹酮中对底物的立体选择性不同底物的立体选择性不同T对映体选择性意义对映体选择性意义T某些酶在水相和有机相中的对映体选择性有明显的不同，例如，某某些酶在水相和有机相中的对映体选择性有明显的不同，例如，某些蛋白酶在水溶液中对些蛋白酶在水溶液中对 L-氨基酸起作用，而在有机介质中可用氨基酸起作用，而在有机介质中可用 D-氨基酸为底物合成手性药物，这在医药行业中有重要应用氨基酸为底物合成手性药物，这在医药行业中有重要应用T有机介质中的酶催化T酶在有机介质中的催化特性酶在有机介质中的催化特性

53、 区域选择性区域选择性T区域选择性（区域选择性（regioselectivity） ，即酶能够选择性地催化底物，即酶能够选择性地催化底物分子中某个区域的基团优先发生反应分子中某个区域的基团优先发生反应T区域选择系数（区域选择系数（K1,2）/catm11,2catm2KKKKK(7-5)T有机介质中的酶催化T酶在有机介质中的催化特性酶在有机介质中的催化特性 化学键选择性化学键选择性T键选择性（键选择性（chemoselectivity），即同一个底物分子中有两种以），即同一个底物分子中有两种以上化学键可与酶反应，酶对其中一种优先反应上化学键可与酶反应，酶对其中一种优先反应T例如：例如：6-氨基

54、氨基-1-己醇的选择性酰化己醇的选择性酰化T键选择性的意义：可在不需要基团保护的情况下对特定部位的基键选择性的意义：可在不需要基团保护的情况下对特定部位的基团进行衍生化团进行衍生化T有机介质中的酶催化T酶在有机介质中的催化特性酶在有机介质中的催化特性 热稳定性热稳定性T表：部分酶在有机介质与水溶液中半衰期比较表：部分酶在有机介质与水溶液中半衰期比较酶酶介质介质热稳定性（半衰期）热稳定性（半衰期）脂蛋白脂肪酶脂蛋白脂肪酶甲苯，甲苯，90 oC，400 h活力剩余活力剩余 40%限制性内切酶限制性内切酶 Hind III正庚烷，正庚烷，55 oC，30 d活力不变活力不变 -葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶异

55、丙醇，异丙醇，50 oC，30 h活力剩余活力剩余80%核糖核酸酶核糖核酸酶壬烷，壬烷，110 oC，6 h活力剩余活力剩余95%水，水，pH 8.0，90 oCt1/2 50 d胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶正辛烷，正辛烷，100 oCt1/2 = 80 min水，水，pH 8.0，55 oCt1/2 = 15 minT有机介质中的酶催化T酶在有机介质中的催化特性酶在有机介质中的催化特性 热稳定性热稳定性T表：部分酶在有机介质与水溶液中半衰期比较表：部分酶在有机介质与水溶液中半衰期比较酶酶介质介质热稳定性（半衰期）热稳定性（半衰期）猪胰脂肪酶猪胰脂肪酶三丁酸甘油酯三丁酸甘油酯t1/2 26 h水，

56、水，pH 7.0t1/2 24 h水，水，60 oCt1/2 10 min酪氨酸酶酪氨酸酶氯仿，氯仿，50 oCt1/2 = 90 min水，水，50 oCt1/2 = 10 min细胞色素氧化酶细胞色素氧化酶甲苯，甲苯，0.3%水水t1/2 = 4.0 h甲苯，甲苯，1.3%水水t1/2 = 1.7 minT有机介质中的酶催化T酶在有机介质中的催化特性酶在有机介质中的催化特性 热稳定性热稳定性T许多酶在有机介质中的热稳定性比在水溶液中的好许多酶在有机介质中的热稳定性比在水溶液中的好T部分酶在有机介质中能耐受高热部分酶在有机介质中能耐受高热T有机溶剂中酶的热稳定性还有机溶剂中酶的热稳定性还T解

57、释解释 Klibanov 和和 Volkin 认为，由于有机溶剂中缺少使酶认为，由于有机溶剂中缺少使酶热失活的水分子（或含量极低），由水引起的蛋白质热失活的全热失活的水分子（或含量极低），由水引起的蛋白质热失活的全过程难以进行过程难以进行T有机介质中的酶催化T酶在有机介质中的催化特性酶在有机介质中的催化特性 pH 特性特性T在有机介质中，酶所处的在有机介质中，酶所处的 pH 环境与酶在冻干、溶剂沉淀或吸附到环境与酶在冻干、溶剂沉淀或吸附到载体上之前所使用的载体上之前所使用的 相同，也称相同，也称“pH 印迹印迹”T现象：现象：Zaks 等人研究脂肪酶催化三丁酸甘油酯与正庚醇的转酯反等人研究脂肪

58、酶催化三丁酸甘油酯与正庚醇的转酯反应时发现，酶的反应速度与其冷冻干燥前水溶液的应时发现，酶的反应速度与其冷冻干燥前水溶液的 pH 值密切相关，值密切相关，反应的最适反应的最适 pH 值接近于水溶液中的最适值接近于水溶液中的最适 pH 值值T原因原因 “必需水必需水”T在有机溶剂中酶分子表面的在有机溶剂中酶分子表面的“必需水必需水”只有在特定的只有在特定的 pH 和离子强和离子强度下，酶分子活性中心周围的基团才能处于最佳的离子化状态度下，酶分子活性中心周围的基团才能处于最佳的离子化状态T有机介质中的酶催化T酶在有机介质中的催化特性酶在有机介质中的催化特性 pH 特性特性T用用控制酶的解离状态，消

59、除酶控制酶的解离状态，消除酶 pH 印记特性的影响，印记特性的影响，称为称为“pH 遗忘遗忘”T有机相缓冲液（有机相缓冲液（organic phase buffer）T疏水性酸疏水性酸 + 盐盐 缓冲对缓冲对T疏水性碱疏水性碱 + 盐盐 缓冲对缓冲对T有机介质中的酶催化T有机介质中酶催化反应的条件及其控制有机介质中酶催化反应的条件及其控制T(1) 酶的选择依据酶的选择依据T酶活力高低酶活力高低 反应速率和反应时间反应速率和反应时间T酶的稳定性酶的稳定性 可重复使用的次数可重复使用的次数T酶催化的选择性酶催化的选择性 产物中某种异构体的产率和纯度产物中某种异构体的产率和纯度T(2) 底物的选择和

60、浓度控制底物的选择和浓度控制T底物的极性与溶解度底物的极性与溶解度T底物专一性的变化底物专一性的变化T底物的可接近程度底物的可接近程度 底物在溶剂与底物在溶剂与“必需水必需水”中的分配情况中的分配情况T底物的抑制情况底物的抑制情况T有机介质中的酶催化T有机介质中酶催化反应的条件及其控制有机介质中酶催化反应的条件及其控制T(3) 有机溶剂的选择有机溶剂的选择T溶剂极性判据溶剂极性判据 介电常数（介电常数（ ）疏水性参数（疏水性参数（lgP）T溶剂极性应适中溶剂极性应适中 2 lgP 5T与水混溶的有机介质含量与水混溶的有机介质含量 例：在二氧六环例：在二氧六环 / 水体系中，辣水体系中，辣根过氧