实时荧光定量pcr步骤

1、实时荧光定量PCR :实时荧光定量 PCR ( Quantitative Real-time PCR )是一种在 DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR ) 循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定 DNA序列进行定量分析的方法。Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR 进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该 模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。原理：所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光 基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲 线对未知模板进行定

2、量分析的方法。检测方法l.SYBRGreen I 法:在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料 特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR 染料分子不会发射田可荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR 产物的增加完全同步。SYBR定量PCR扩增荧光曲线图PCR产物熔解曲线图(单一峰图表明PCR扩增产物的单一性)2. TaqMan探针法:探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时，Taq酶的5'3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光 基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即 每扩增条DNA链，就有一个荧光

3、分子形成，实现了荧光信号的累 积与PCR产物的形成完全同步。服务流程1 客户认真写好订单，提供待检基因相关信息;2签订技术服务合同，支付预付款（30-50%）;3设计合成定量PCR引物（或客户提供文献引物委托本公司合 成）；4. DNA/RNA的抽提、定量、RNA反转录；5. PCR预实验，主要检测引物的特异性和扩增效率；6. 正式定量实验：对所有样品上机检测；7实验结果和数据分析，形成报告。收费标准优惠包干价:120元/样/基因（SYBRgreenl法，相对定量）（含RNA提取，反转录，引物合成费用，上机测试费用（3个 重复）；一个内参免费（内参3个重复）技术原理将标记有荧光素的Taqman

4、探针与模板DNA混合后完成高温 变性,低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与 模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系 中，在特定光激发下发出荧光,随着循环次数的增加,被扩增的目的 基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧 光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对 照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。Ct值Ct值(Cycle threshold ,循环阈值)的含义为：每个反应管内 的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。1. 荧光阈值(threshold )的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号

5、，荧光阈 值的缺省(默认)设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍，即：threshold = 10*SDcycle 3-152. Ct值与起始模板的关系每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系， 公式如下。Ct=-l/lg(l+Ex)*lgXO+lgN/lg(l+Ex)n为扩增反应的循环次数，X0为初始模板量，Ex为扩增效率， N为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。起始拷贝数越多，Ct值越小。禾I用已知起始拷贝数的标准品可 作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代Ct值。 因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品 的起始拷贝数。

6、荧光化学物质实时荧光定量PCR所使用的荧光物质可分为两种:荧光探针和 荧光染料。现将其原理简述如下：1. TaqMan荧光探针:PCR扩增时在加入一对弓I物的同时加入个特异性的荧光探针,该探针为一寡核莒酸z两端分别标记一个报 告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光 信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时Jaq酶的5*3外切酶活性将探 针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系 统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形 成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型 TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因

7、 突变（SNP有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。2. SYBR荧光染料:在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光 染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号, 而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧 光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR仅与双链DNA进 行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。3. 分子信标：是一种在5和3末端自身形成一个8个碱基左右 的发夹结构的茎环双标记寡核苜酸探针，两端的核酸序列互补配对， 导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，不会产生荧光。PCR产物生成 后，退火过程中，分子信标中间部分与特定

8、DNA序列配对，荧光基 因与淬灭基因分离产生荧光。传统定量PCR1 传统定量PCR方法简介1 ）内参照法 在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物， 内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。 在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶 模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分 别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源 竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同 时扩增（其中一个弓I物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产 物，竞争性模板的产物被酶解为两

9、个片段，而待测模板不被酶切，可 通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知 模板推测未知模板的起始拷贝数。3 ） PCR - ELISA法：利用地高辛或生物素等标记引物,扩增产 物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体 辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCREUSA 法只是定性实验,若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目 的。2内标在传统定量中的作用由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检 测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一 个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异， 因此无

10、法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分 消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此,传统的定量方法也 都只能算作半定量、粗略定量的方法。3内标对定量PCR的影响若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为 双重PCR ,双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其 当两种模板的起始拷贝数相差t匕较大时，这种竞争会表现得更为显 著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量 的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标, 但仍然只是一种半定量的方法。实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的 局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑 软件之中,通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结 果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：1) Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚 进入真正的指数扩增期(对数期)，此时微小误差尚未放大，因此 Ct值的重现性极好,即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内 扩增，得到的Ct值是恒定的。2 )Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存 在线性关系,可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时 荧光定量PCR是一种采用夕卜标准曲线定量的方