桔梗同源四倍体诱导及其基因组DNA甲基化差异分析

1、桔梗同源四倍体诱导及其基因组DNA甲基化差异分析 桔梗同源四倍体诱导及其基因组DNA甲基化差异分析 摘要为探究桔梗同源四倍体与二倍体试管苗外观形态差异的表观遗传变化，先将桔梗二倍体不定芽用不同浓度的秋水仙素混合液浸泡后进行组织培养，并通过流式细胞仪和根尖染色体鉴定相结合的方法鉴定倍性。在获得桔梗同源四倍体的根底上，采用甲基化敏感扩增多态性技术探究二倍体与四倍体植株之间的DNA甲基化水平及其模式变化。结果说明0.2%的秋水仙素混合液处理桔梗不定芽12 h是诱导桔梗同源四倍体的最适条件，其诱导率到达32.0%；四倍体与二倍体植株在外观形态上存在明显差异，经过DNA甲基化差异分析，20对引物扩增的1

2、 586条带中二倍体有764条，四倍体有822条。二倍体总甲基化率、全甲基化率和半甲基化率分别为92.15%，61.52%，30.65%，而四倍体为86.13%，54.38%，31.75%，与二倍体相比，其同源四倍体总甲基化率降低6.02%，全甲基化率降低7.14%，而半甲基化率升高1.6%，说明染色体加倍后其DNA表观遗传模式发生了变化。 关键词桔梗；同源四倍体；DNA甲基化；MSAP AbstractIn order to investigate the epigenetic variations between diploid and autotetraploid of Platycod

3、on grandiflorushe diploid buds of P. grandiflorus were soaked in the mixture of different concentration colchicines and 0.002 gmL-1 dimethyl sulphoxide he identification of autotetraploid plants were based on morphological characteristics，chromosome number and flow cytometry. And then the level and

4、pattern of DNA methylation explored by using the technology of methylation sensitive amplified polymorphism he result demonstrated that the buds soaked in 0.2% colchicines and 0.002 gmL-1 DMSO solution for 12 h was ideal conditions to induce autotetraploid of P. grandiflorus，with induction rate of 3

5、2.0%he diploid and tetraploid plants existed distinctly differences in morphological indexesotally，1 586 bands were amplified by 20 pairs of selective primers，of which 764 and 822 bands were detected in diploid and autotetraploid respectivelyhe total methylation ratio，full methylation ratio and hemi

6、methylated ratio were 91.25%，61.25% and 30.65% in diploid of P. grandiflorus，respectively.However，the total methylation ratio，full methylation ratio and hemimethylated ratio of autotetraploid of P. grandiflorus were 86.13%，54.38% and 31.75%， respectively. Compared with diploid，the genomic DNA total

7、methylate ratio and full methylation ratio of autotetration plants decreased by 6.02% and 7.14%.But the hemimethylated ratio of autotetraploid was higher than that of diploid，which more than 1.6%.All this results indicated that DNA methylation patterns have adjusted during the polyploidy process. Ke

8、y wordsPlatycodon grandiflorus； autotetraploid； DNA methylation； MSAP 多倍体是指含有3套或3套以上完整染色体组的生物体【1】。由于多倍体将1个或多个整套染色体累加到基因组上，对生物体的基因组产生了一定冲击，这种“基因组冲击使生物体的新陈代谢和基因调控等发生改变，从而使植株的形态器官、生理指标、遗传特性等产生变异2-5，这些变异会增强植株的生态适应性和环境的抗逆性，降低蒸腾作用，提高光合效率等，对植株的生物量和某些次生代谢产物含量及品质有促进作用【6】。因此多倍体植物具有更大的生存潜能和更强的选择优势。研究说明，多倍化不仅能导

9、致植物的基因组结构改变、碱基序列消除、转座子激活等，还能影响表观遗传调控模式7-8。表观遗传变异是指不改变DNA碱基序的一种可遗传的基因表达变化，包括DNA甲基化修饰、组蛋白的各种修饰等【9】，其中DNA甲基化修饰是研究多倍体表观遗传变异的最正确途径之一10。DNA甲基化能在分子水平上对基因的表达进行调控，保护基因组结构的完整性，并控制冗余基因的表达，保持多倍体植物基因组的稳定性 11-12。多倍化能够诱导DNA甲基化的改变，而DNA甲基化又在基因组调控和基因表达上起到一个枢纽的作用，因而用甲基化敏感扩增多态性技术研究不同倍性植株基因组DNA甲基化的表达水平及模式变化，在一定程度上对解释多倍体

10、植株出现的新的表型具有重要的意义。 目前多倍体方面的研究主要集中于异源多倍体的物种13-16，而对同源多倍体化后所产生的一系列变化方面的相关文章较少，这是因为异源多倍体化后较同源多倍体化后引起的变化更为明显17-18。但是，异源多倍体带来的杂交效应将混淆于倍性引起的后果19，因此，仅依赖于倍性调控变化方面的研究应通过同源多倍体来表达，揭示仅由基因组加倍而不涉及杂交等其他因素所造成的基因组冲击以及随后多个基因组趋于稳定的内在机制也需通过同源多倍体的研究来说明。 桔梗为常用大宗药材，具有开宣肺气，祛痰排脓的成效20，在我国南北各地大面积栽培。但长期以来只种不选，导致品种退化，药材产量和品质下降21

11、。本研究在采用生物技术离体诱导并鉴定获得桔梗同源四倍体的根底上，采用甲基化敏感扩增多态性技术对二倍体和四倍体基因组DNA的甲基化变化情况进行分析，一方面为桔梗的品种选育提供材料，另一方面从表观遗传学的角度探讨桔梗四倍体表型变化的分子机制，为多倍体育种提供一定的理论依据。 1材料 挑选籽粒饱满的桔梗种子，经流水冲洗40 min后置于超净工作台，用75%乙醇消毒30 s后转入0.1%升汞中灭菌6 min，无菌水清洗35次，接入MS培养基，2530 d后获得桔梗无菌系。 2方法 2.1桔梗无菌快繁体系的建立和优化 以桔梗幼芽为材料，接种到增殖和生根培养基上，增殖培养基以MS为根本培养基，分别添加不同

12、浓度6-BA、NAA和2，4-D；生根培养基以1/2MS为根本培养基，并添加不同浓度NAA和IBA进行生根培养，试验设计见表1，2。每个处理15个幼芽，5瓶重复，培养30 d后分别统计增殖系数和生根率。 2.2桔梗同源四倍体的离体诱导及鉴定 2.2.1桔梗同源四倍体的离体诱导具体方法参照王红娟等22，并作适当调整。质量分数为0.05%，0.1%，0.2%的秋水仙素混合液经20 mL的注射器和0.22 m的水系滤头抽滤灭菌后将桔梗不定芽浸泡在其中，置于震动摇床内处理12，24，36，48，60 h，然后用无菌水冲洗3次后接种到MS培养基中进行培养。以清水浸泡作为对照，共15个处理，每个处理15个

13、幼芽，做5次重复。 2.2.2桔梗同源四倍体的鉴定采用形态鉴别、流式细胞仪分析和根尖染色体鉴定相结合的方法来确定倍性株系。先将形态变异明显的植株进行流式细胞仪分析，具体方法参照张俊娥等23，称取0.5 g组培苗叶片，用滤纸吸干水分后置于干净培养皿中，参加2 mL预冷的组织解离液，用刀片一次性快速切碎叶片，过滤后于4 环境下2 000 rmin-1离心5 min，漂洗23次，参加2 mL DAPI染液室温下反响1 h后即可上样测定。流式细胞仪鉴定的株系进一步采用根尖压片法确定植株染色体数目。具体方法参照张振超等24，早上9：0011：00点取幼苗根尖，在0.002 molL-1的八羟基喹啉预处理

14、23 h，于4 冰箱中卡诺固定液处理24 h，在60 的1 molL-1 HCL中解离8 min，卡宝品红染色10 min，然后制片、镜检。 2.3总DNA提取 称取0.5 g二倍体和四倍体桔梗试管苗幼叶，采用改进的CTAB法进行DNA提取，具体方法参照陈昆松等25，提取的DNA经紫外-可见分光光度计测定浓度和纯度后用并1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，总DNA 置于-20 冰箱待用。 2.4MSAP分析及聚丙烯酰胺凝胶电泳 2.4.1酶切、链接反响MSAP试验步骤参照Portis等26方法，用双切酶组合EcoR/Hpa和EcoR / Msp对基因组DNA进行酶切，在酶切片段的两端加上人工设计的与E

15、coR和Hpa /Msp 酶切位点互补的人工接头，然后用AFLP扩增体系进行扩增，接头和引物序列见表3。引物由北京博友顺生物科技合成。 2.4.2预扩增、选择性扩增和电脉预扩增反响体系为20 L，其中含有10 mmolL-1 dNTPs 0.4 L，10×Buffer 2 L，5 UL-1Taq酶0.2 L，10 molL-1 E00-primer 0.5 L，10 molL-1 M00-primer 0.5 L，其余用水补齐。反响条件为：94 30 s，56 1 min，72 1 min，26个循环，72 延伸10 min。预扩增产物稀释20倍，供选择扩增用。 选择扩增体系同预扩增

16、体系，条件为：94 30 s，65 至56 30 s，72 1 min，13个循环，每个循环降0.7 进行降式PCR 扩增；94 30 s，56 30 s，72 1 min，23个循环，72 延伸10 min。 选择性扩增完成后在扩增PCR产物中参加上样缓冲液，94 变性10 min 后然后立即转移到冰上冷却防止复性，取5 L变性产物于6%变性聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳分析，银染后观察。 2.5条带统计与数据处理 由于甲基敏感扩增多态性技术中分别用EcoR/Hpa和EcoR/Msp双切酶对基因组DNA进行酶切。因此每个样品同时拥有2条泳道：第1条泳带采用EcoR/Hpa进行酶切，记为H，第2条

17、泳带采用EcoR/ Msp进行酶切，记为M。同一位点有条带的记为“1，无带的记为“0。 3结果与分析 3.1增殖及生根培养基优化 将长1.52 cm的桔梗不定芽接到7种增殖培养基中，经30 d培养后均出现不定芽增殖的现象，具体结果见表4，在4号培养基中，分化的芽数最多，增殖系数平均达9.3±0.24，且出芽整齐，生长健壮，叶色浓绿。因此，桔梗无菌苗增殖的最适培养基为MS+6-BA 1.5 mgL-1+ NAA 0.3 mgL-1。 生根培养基优化结果见表5，不同浓度的NAA和IBA对桔梗试管苗生根率、根生长状况均有影响，随着NAA和IBA浓度的增大，生根率逐渐降低，且出根不整齐，根细

18、短。当培养基蔗糖含量为28 gL-1，NAA质量浓度为0.6 mgL-1时，平均生根率高达82.6±3.8，且根粗壮，整齐。由此可见，桔梗的最正确生根培养基为1/2MS+NAA 0.6 mgL-1。 3.2桔梗同源四倍体的诱导结果 将桔梗不定芽用抽滤灭菌的秋水仙素混合液浸泡处理后，成功得到了桔梗同源四倍体植株。诱导结果见表6，不同的质量浓度和处理时间对不定芽的诱导效果不同，低浓度和短时间处理下诱导率低，但成活率高，随着质量浓度和处理时间的增加，诱导率逐渐提高，但不定芽成活率降低。根据四倍体植株的诱导率和成活率，筛选出最正确处理浓度和时间，即用0.1%的秋水仙素溶液处理48 h或0.2

19、%的秋水仙素溶液处理12 h为桔梗同源四倍体诱导的最正确条件。 3.3桔梗同源四倍体的鉴定 一般而言，四倍体植株具有巨型化特征，将形态变异明显的植株先经流式细胞仪分析后，再用根尖压片法鉴定，见图1。结果说明，桔梗二倍体植株根尖染色体数为2n=2x=18，DNA相对含量在100处有1个单峰；同源四倍体植株染色体数为2n=4x=36，DNA相对含量在200处有1个单峰，见图2。 3.4桔梗二倍体和同源四倍体基因组DNA甲基化水平差异 MSAP技术中同裂酶Hpa和Msp都能识别并切割CCGG序列，但二者识别甲基化的位点不同，Hpa能切割无甲基化和单链甲基化位点而不能切割双链甲基化位点；Msp能切割无

20、甲基化和内甲基化位点而不能切割外甲基化位点，因此经Hpa和Msp切割后在聚丙烯酰胺凝胶电泳分析胶上能检测出4种条带类型，即：型，H，M都有带，说明CCGG位点无甲基化；型，H有带，M无带，说明CCGG位点发生单链外甲基化，即半甲基化；，H无带，M有带，说明CCGG位点发生双链内甲基化，即全甲基化；，H，M都无带，说明CCGG位点有双链内外侧甲基化、双链外甲基化或无CCGG序列16。桔梗二倍体和同源四倍体DNA经MSAP扩增的条带数及甲基化水平见表7，用20对引物组合共扩增后共有1 586条条带，其中二倍体764条，四倍体822条。二倍体总甲基化率、全甲基化率和半甲基化率分别为92.15%，61

21、.52%，30.65%，而四倍体的为86.13%，54.38%，31.75%，与桔梗二倍体相比，其同源四倍体总甲基化率降低6.02%，全甲基化率降低7.14%，而半甲基化率升高1.6%，这说明染色体加倍后其DNA甲基化水平发生了变化。 3.5桔梗二倍体和同源四倍体基因组DNA甲基化类型 二倍体和同源四倍体桔梗基因组DNA甲基化类型见表8，二倍体和四倍体共有15种条带，见图3。其中A型为单态性位点，包括3个亚类，表示二倍体与四倍体甲基化状态相同；B型为去甲基化位点，包括5个亚类，说明在该位点二倍体存在甲基化，而四倍体发生了去甲基化；C型为过或超甲基化类型，也有5个亚类，即与二倍体相比，四倍体甲基

22、化升高；D型为次甲基类型，有2个亚类，表示相比于二倍体来说，四倍体甲基化降低，但仍有甲基化现象17。与二倍体相比，桔梗试管苗染色体加倍后，其基因组DNA有23.54%发生了去甲基化现象，29.07%发生了过或超甲基化现象，2.97%发生了次甲基化现象，只有44.42%的基因组DNA未发生任何改变。 4讨论与结论 4.1桔梗同源四倍体的离体诱导及鉴定 本研究中采0.2%抽滤灭菌的秋水仙素溶液浸P11P20.其中的10对引物，每对引物下有4条泳道，从左往右依次为2H，2M，4H，4M；2H和4H分别表示二倍体和四倍体桔梗EcoR /Hpa 酶切的扩增结果；2M和4M表示二倍体和四倍体桔梗EcoR

23、/Msp 酶切的扩增结果。 泡桔梗顶芽12 h，获得了诱导率为32.0%的四倍体植株。高山林等27采用培养基中添加40 mgL-1秋水仙素的方法诱导桔梗四倍体，诱导率到达37.5%；王小华等28采用0.1%秋水仙素处理桔梗嫩茎40 h，诱导率到达50%。前人诱导率较高的原因可能是在鉴定过程中仅用形态学和细胞学的方法鉴定倍性，并没有排除嵌合体的干扰，从而将嵌合率也计算到诱导率中，出现诱导率较高的现象，本研究采用了形态鉴别、流式细胞仪分析和根尖染色体鉴定相结合的方法进行倍性鉴定，排除了嵌合体的干扰，提高了结果的可靠性，为进一步研究桔梗同源四倍体的遗传稳定性和农艺性状评价提供可靠的材料。 4.2桔梗

24、二倍体与四倍体基因组DNA甲基化水平差异及模式变化 多倍体植物具有器官巨大、活性成分含量高、抗逆性强等优点，这可能是多倍化后植物体内基因组结构和表观遗传修饰发生了广泛变化【3】，进而导致植物出现新的性状。但在对拟南芥【5】、水稻29、白菜18的同源多倍体及二倍体的比拟研究中发现这些植物同源多倍化后基因组结构并没有发生明显改变，且多倍化后多倍体的基因表达谱也与二倍体十分相似。说明同源多倍化后基因组并没有同异源多倍化一样发生大规模的基因组结构调整事件。本研究中，从图1可以明显看出桔梗同源四倍体比二倍体植株粗大，叶片增厚增大，叶柄叶脉粗大等现象，同源多倍体桔梗新出现的区别于亲本的性状那么可能与表观遗

25、传调控密切相关。 甲基化是一种常见的表观遗传修饰形式，在基因表达中起着重要的调节作用，同源多倍化过程中，DNA甲基化会参与多倍体的适应性调整，并发生特异性的变化以调控基因表达和转座子的活性等，所以不同倍性材料中DNA甲基化水平会发生一定程度的改变29。杨岚等30采用MSAP技术对甜叶菊同源四倍体与二倍体的表观遗传进行研究后发现四倍体基因组DNA的总甲基化率和全甲基化率略有所降低，甲基化模式主要以过和超甲基化为主；长春花31多倍化后基因组CCGG位点的 DNA的总甲基化率、全甲基化率和半甲基化率较二倍体植株均有所提高，甲基化类型以C型即过或超甲基化类型最多。本研究中，桔梗同源四倍化后基因组DNA

26、的总甲基化率和全甲基化率有所降低，其中总甲基化率降低6.02%，全甲基化率降低7.14%，且甲基化模式主要以过或超甲基化类型为主，占29.07%，其次是去甲基化，占23.54%，最少的是次甲基化，占2.97%。由此可推测同源四倍体出现新的表型与DNA甲基化模式的重新调整尤其是大量过或超甲基化变异有关，过或超甲基化就可能导致相应位点所在基因表达的关闭或抑制，进而维持四倍体植株这自身基因组的稳定性。有关染色体加倍后DNA甲基化模式调整的程度对多倍体性状和表型改变的机制还有待进一步的研究。 参考文献 【1】宋灿，刘少军，肖军，等.多倍体生物研究进展J.中国科学：生命科学，2021，42：173. 【

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