TUNEL原理和方法

1、TUNELM检测细胞凋亡实验原理和方法细胞凋亡中染色体 DN厢勺断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA 首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约 30 %的染色体 DNM Ca 2+和Mg2侬赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成 180200bp核小体 DNA多聚体。DN戚链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA 勺 3 -OH末端可在脱氧核糖核昔酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核昔酸和荧光素、过氧化物酶、碱 性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA 的 3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核昔酸末

2、端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA 勺断裂，因而没有 3 -OH 形成，很少能够被染色。低分子量的 DN离后，也可使用 DN麻合酶进行缺口翻译（nicktranslation）,使低分子量 的 DN 职记或染色，然后分析凋亡细胞。TUNE 或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高，因而

3、在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。一、过氧化物酶标记测定法原理：脱氧核糖核昔酸衍生物地高辛（digoxigenin ） -11-dUTP在 TdT 酶的作用下，可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA 的 3-OH末端，与 dATP 形成异多聚体，并可与连接了报告酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）的抗地高辛抗体结合。在适合底物存在下，过氧化物酶可产生很强的颜色反应， 特异准确的定位出正在凋亡的细胞，因而可在普通光学显微镜下进行观察。毛地黄植物是地高辛的唯一来源。在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结 合的配体，因而非特异性反应很低。抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物笛体激素的交叉反应 不到 1%,若此抗体

4、的Fc部分通过蛋白酶水解的方法除去后，则可完全排除细胞Fc受体非特异性的吸附作用。本方法可以用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片、冰冻切片和培养的或从组织中 分离的细胞凋亡测定。检测晚期凋亡。 基本原理： 对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让 rTDT 和 bio标记的dTUTP 进入细胞内，在 rTDT 的辅助下 dTUTP 与核断裂的 DNA3 -OH 结合，再用 HRP记的链霉亲和素与 dTUTP 上biotin 结合（每个链霉亲和素至少可以再结合3 个 biotin 分子），最后用 DAB过氧化氢与 SP上的辣根过氧化物酶 HR 既生氧化、环化反应，形成苯乙腓聚合物而呈现棕 褐色，

5、最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL.K 性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。罗氏试剂盒一、 试剂 1、酶浓缩溶液 5X 50 l末端脱氧核糖核酸转移酶（10X）试剂2、 标记溶液 5X 5 50 l 含有核昔酸混合液的反应液（1 X ）试剂3、 转化剂-POD 3.5ml 酶标记抗荧光素抗体（即用型，融后 4C保存）二、 所需的溶液和仪器10mM Tris/HCl （pH7.47.8 ）、PK配制、DAB 饭盒、吹风机、 3%H2O却醇溶液、PBS 盖 玻片、中性树胶、苏木素、二甲苯和无水乙醇（用量多）、双蒸水（用以配梯度酒精）1,充分脱蜡和水化。脱蜡可以先60度 20min,石蜡切片

6、于染色缸中，二甲苯浸洗 2 次共5min,100%、95% 90% 80% 70%醇浸洗 3minX 5;23 咐氧化氢甲醇中浸洗 10-15min ,抑制内源性过氧化氢酶。3用蛋白酶 K （20 g/ml 溶于 Tris/HCl 中，pH7.48.0 ）室温孵育 1530 分钟。4PBS洗约 5min*2次，擦干样品周围的水。此阶段配制TUNE 成应混合物一一从试剂 2 中取出 100 l 标记溶液作为两个阴性对照；将试剂 1 中取 5 l+试剂 2 中 45 l 标记液中， 配成 50 l TUNEL反应混合物混匀（即配即用，4C避光！）5标记反应：滴加 50 l 的 TUNE 成应混合液

7、，在湿盒中 37C孵育 60分钟（为防蒸发和保证 TUNEL 反应混合物均匀分布，可以在孵育过程中加盖盖玻片）。PBS洗 5min*3次，至此样品可在荧光镜下（绿色）分析结果。6信号转化和分析：擦干样品周围的水分，加入 50ul转化剂-POD,湿盒中 37C孵育 2030分钟（可以在孵育过程中加盖盖玻片）。PBS洗 5min*35 次7加入 50100 l DAB 底物溶液，室温（1025C）孵育 510 min, PBS 洗 5min*3次。（苏 木素染 1-3秒，以免视野全染，需要摸索条件）8中性树胶 或者甘油封片（在封片前可以复染），光镜下分析结果。？稳定性：TUNE 成应混合物需在使用

8、前立即制备，不能储存，配好的此液体必须将放入冰浴中。2、转化剂-POD （即用型）：一旦融化此液体，需在 4C保存（最多保存 6 个月），并且不 能反复冻存。蛋白酶 K 一般工作液浓度为 20ug/ml,但浓缩液可配制 110mg/ml，可用 PBS 配制，也可用蛋 白酶 K 缓冲液（100mM Tris HCl PH8.0+50mM EDTA ）;注意：1）蛋白酶 K可以帮助渗透组织，但延长孵育时间可能导致切片脱落（ come off the slide ）,所以要最优化孵育时间长短。时间一般为1030 min, 4um左右的片子可以用 10 min,但 30um左右的可用 30 min ,

9、最终通过摸索最佳时间。过长易脱片、过短起不到通透效果。2）对于比较困难的组织，可以选用 0.1MpH6.0的枸椽酸盐缓冲液进行修复（石蜡切片无必要用），200ml 需 350W#复 5min3）对照：阴性对照： 经过固定和通透的细胞样品加入50 l试剂 2 以代替 TUNE 成应混合物，从标记步骤以下同上。阳性对照：经过固定和通透的细胞样品用细球菌的核酸酶或DNase I 使之产生 DNA1 缺口，从标记步骤以下同上。4）操作流程：常规脱蜡、脱水处理一一冲洗样品一一滴加TUNE 成应混合物，37C 孵育 60分钟一一冲洗样品一一选择： 荧光镜下观察分析一一滴加转化剂 -POD, 37C 孵育

10、30 分钟一一 洗样品一一滴加 DAB 底物溶液，室温孵育 5-20分钟一一光镜下分析结果5）假阳性多的原因有很多：POD寸闭不全、DAB 显色时间过长等原因假阳性严重，可能原因应该是 DA 解育时间过长，建议首先排除之，同时加强PBSf洗6）DAB 显色时间：（1）DAB 显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可 冲洗；（2）DAB 显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体 浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；（3）此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要 延长封闭时间；（4）DAB 显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4度过夜）；另一方面就是封闭时间过长。7）脱片产生的原因和如何防止脱片 ：（1）多聚赖氨酸玻片质量的问题。我原先是买的，迈新按说也是不错的，可是都脱成什么样子了。后面补做第二批时用的病理科老师自己做的片子，要好一点。(2)组织切