2015版微生物限度检查方法验证方案

1、扬子江药业集团四川海蓉药业有限公司YangtzRiverPIarmaceuticGrouSichuaHaironpiarmaceuticCo.,Ltd2015版微生物限度检查方法验 证方案验证文件文件名称：阿戈美拉汀片（25mg）微生物限度检查方法验证方案文件编号：部 门签名日 期制定人QCQC验证管理员QA质量管理部部长批准人质量负责人扬子江药业集团四川海蓉药业有限公司YangtzReiverPIarmaceuticaGlrouSpichuanHaironPgIarmaceuticaClo.,Ltd扬子江药业集团川海蓉药业有限公司扬子江药业集团四川海馨药业有限公司Mgtze 拓金用an的cm

2、tkal (axxf> SidiJfhurrjgHsnsiCfutical Cd, Ltd目录一、验证概述31 .验证对象32 .验证原因33 .验证目的.34验证要求.4二、验证组织机构和职责51 .职责52 .组织机构6三、验证风险评估及范围1 .严重性（S） 82 .可能，性（O） 83 .可检测性（D）94 .风险优先数量等级判定（RPN） 9四、验证实施计划30五、验证准备31L 验证依据312.验证条件31六、验证内容34七、验证异常情况处理44八、验证结论46九、再验证周期47十、附 件48一、验证概述1 .验证对象本次验证的对象为阿戈美拉汀片（25mg）微生物限度检查法。

3、2 .验证原因对阿戈美拉汀片（25mg）微生物限度检查法进行适用性验证,3 .验证目的确认阿戈美拉汀片（25m助微生物限度检查法的可靠性.阿戈美拉汀片煨5吨）微生物限度方法聆证方案Page 3 of 31Page 3 of 31扬子江药业集团四川海蓉药业有限公司YangtzReiverPharmaceuticGarloupSichuanHairongPharmaceuticCalo.,Ltd4 .验证要求验证过程需严格按方案中规定的步骤进行。对于验证过程中出现的所有偏差，应查明原因并得到有效处理后，验证方可进入下一步骤。阿戈美拉汀片（25m©微生物限度方法验证方案Page 5 of

4、31二、验证组织机构和职责1 .职责1.1. 质量受权人 验证文件的批准。 组织验证工作的实施及各部门的协调，保证验证工作有序的进行。1.2. 质量管理部 现场监督保证整个操作过程按照验证计划进行。 负责验证方案的审核，及操作过程中对验证文件修订的审核工作。 验证文件的归档工作。 按照验证方案要求对操作过程中的样品抽样检测。 涉及到的仪器仪表的校验，以及一些相关的化验工作。1.3. 质量控制实验室 负责验证文件的起草工作。 负责验证文件的审核工作。 验证方案起草人员现场对操作过程进行指导。 对验证实施过程中资料和数据进行汇总并完成验证报告。 需要时与相关部门的协调工作。1.4. 供应部按照验证

5、物资采购计划进行物资采购。扬子江药业集团四川海蓉药业有限公司YangtzRiverPharmaceuti(QrouSichuaHaironpharmaceuticCO.,Ltd2 .组织机构2.1验证领导小组姓名职务验证职务验证工作职责质量负责人验证总负责人验证文件审核、批准质量管理部部长领导小组组员验证文件审核QA主管验证文件审核QC主管验证文件审核供应部部长保证验证物料的提供验证管理员验证文件审核、归档2.2.验证实施小组姓名职务确认职务确认工作职责生物组组组长实施小组组长验证文件审核、现场指导化验员实施小组组员文件起草、操作培训、现场指导按要求进行操作及数据整理，填 写相关数据，及检查相

6、关项按要求进行操作及数据整理，填 写相关数据，及检查相关项仪器管理员确保所有仪器设备正常运行阿戈美拉汀片（25mg）微生物限度方法验证方案Page 9 of 31三、验证风险评估及范围根据SOP6-00001验证管理规程对验证的相关要求，对检测过程中可能影响检测结果的 因素进行风险分析。风险定性标准如下:1.严重性（S）： 危害可能产生后果的程度。严重程度分为十个等级，如下:权重严重性等级在产品质量或法规方面上能导致的后果对产品造成的后果10极高可能会导致药监部门吊销药品生产许可证或撤销GMP证书可能会导致检测结果不准确或不可靠，直接影响产品质量9非常高8很高可能会产生不符合GMP的关键缺陷，

7、或者导致上巾药品召回7高6中等可能会产生不符合GMP、SOP的重要缺陷可能导致检测结果产生重大偏差，对产品质量肩较大影响5低可能会产生不符合GMP、SOP的一般缺陷可能导致检测结果产生偏差，对产品质量有一定影响4很低可能会产生不符合GMP、SOP的一般缺陷可能导致检测结果产生偏差，但在可接受范围3轻微2很轻微不违反GMP、SOP的轻微缺陷对产品检测无影响或影响可以忽略1无2.可能性（O）：影响检测结果的事件发生的可能性频率或概率，建立以下等级:权重发生的可能性等级确认标准可能的失效率109很高几乎是不可避免的。>1/21/38一般与以前异常情况时有发生，且为主要因素。1/871/20扬子

8、江药业集团四川海蓉药业有限公司YangtzRiverPharmaceuti(QrouSichuaHaironpharmaceuticCO.,Ltd6中等一般与以前异常情况时有发生，但不是主要因素。1/8051/400权重发生的可能性等级确认标准可能的失效率4中等一般与以前异常情况时有发生，但不是主要素。1/20003低很少几次与相似的情况发生。1/150002很低很少几次与几乎完全相同的情况发生。1/1500001极低异常情况不大可能发生，几乎完全相同的异常情 况也未发生过。< 1/15000003.可检测性（D）:检测到异常情况存在的能力的程度，定义如下:权重可检测性等级确认标准10几

9、乎/、可能没有已知的控制方法能找出异常情况。9很微小现行控制方法找出异常情况的可能性很微小。8微小现行控制方法找出异常情况的可能性微小。7很小现行控制方法找出异常情况的可能性很小。6小现行控制方法找出异常情况的可能性小。5中等现行控制方法找出异常情况的可能性中等。4中上现行控制方法找出异常情况的可能性中等偏上。3高现行控制方法找出异常情况的可能性高。2很高现行控制方法找出异常情况的可能性很高。1几乎肯定现行控制方法几乎肯定能找出异常情况，已知相似过程的可靠 的检测控制方法。4.风险优先数量等级判定（RPN）4.1风险等级判定标准的确定等级低风险上限（不包括）高风险下限（包括）严重性轻微：对产品

10、质量的影响：可能导致检测结果产低：对产品质量对影响：可能会导致检测结生偏差，但在可接受范围。（分值：3分）果不准确或/、口靠，直接影晌产品质量。（分值：5分）等级低风险上限（不包括）高风险下限（包括）可能性低：很少几次与相似的情况发生。（分值：3分）偶尔发生的失败。（分值：5分）可检测性高：现行控制方法找出异常情况的可能性高。（分值：3分）中等：现行控制方法找出异常情况的可能性 中等。（分值：5分）RPN3 >3 >3=275 >5 >5=1254.2风险等级判定标准判定公式（测量范围1-10）RPN风险等级是否可接受是否须采取措施RPN=S< OXDKRPN：

11、27低是否27<RPN：125中否提高可检测性及或降低 风险产生的可能性来降 低最终风险水平1250RPNC 1000高否注：当1WRP* 27,但严重性SX发生可能性。为10 >2或9 >2时，仍需按中等以 上风险进行后续控制。阿戈美拉汀片（25mg）微生物限度方法验证方案Page11 of 31扬子江药业集团四川海蓉药业有限公司Yangtze River Pharmaceutical Group Sichuan Hairong Pharmaceutical Co.,Ltd与相关人员沟通并记录接受该风险的依据降低严重性、发生可能性、提高%百测性'g6<13 o

12、f 31组长将评估 结果进行汇 总，提出风 险控制措施扬子江药业集团四川海蓉药业有限公司Yangtze River Pharmaceutical Group Sichuan Hairong Pharmaceutical Co.,Ltd阿戈美拉汀片（25mg）微生物限度方法验证方案Page# of 31风险管理委员会及 决策人审核批准组长提出采取中止、暂停项目或风险自留、风险回避或后备措施重新完善风评报告扬子江药业集团四川海蓉药业有限公司Yangtze River Pharmaceutical Group Sichuan Hairong Pharmaceutical Co.,Ltd4.4.风险评

13、估过程4.4.1风险识别采用5M1E分析法从人、机、料、法、环等方面进行分析:31扬子江药业集团四川海蓉药业有限公司Yangtze River Pharmaceutical Group Sichuan Hairong Pharmaceutical Co.,Ltd阿戈美拉汀片（25mg）微生物限度方法验证方案Page29 of 31培养环境及观察环境验证所依据洁净区环境（供试品溶液检查环境）的检验操作规培养基、缓冲液、无菌- 丁41-1V-4.5. 阿戈美拉汀片（25mg）微生物限度检查方法验证风险分析:序项目潜在的失效模式潜在的失效后果严潜在失效造成发生现有控制措施可检RP责任及目标措施结果号

14、重性S原因可能性O测性DN完成日期采取措施SODRPN01验证方案编 写人员编写人员未按照 “6-00014-01微生物限度检查方 法验证操作管理 规程规定编写验 证方案。验证方法错误， 导致实验结果不 可靠。8人员培训考评 不到位。2严格按照“6-00014-01微生物限度检查方 法验证操作管理 规程规定编写验证方案1162015.10.20对验证方案编写 人员进行培训和 考评，合格后方 可进行验证方案 的编写工作。811802试验人员试验人员未按照 编写验证方案进 行操作。操作不正确，导 致实验结果不可 靠。8试验人员培训 不到位。2对实验人员进行 验证方案培训116方案批准后 一个工作日

15、 完成验证方 案培训检测前培训验证 方案，试验严格 按验证方案实 施。811803培养箱，净 化工作台仪器没有经过计 量、确认，或不在 计量、确认效期 内。导致检测环境和 培养环境不符合 要求，最终导致 验证试验失败。6使用人员使用 前未对使用的 设备进行校准 日期进行检 查。2编写验证方案前 检查所使用仪器 的校准日期1122015.11.04设备使用人员使 用前对设备的计 量效期、确认效 期进行确认，在 效期内方可使 用。6116设备使用人员使04电子天平，pH计， 干热灭菌烘 箱，灭菌器仪器没有经过计 量、确认，或不在 计量、确认效期 内。导致实验结果出 现异常。8使用人员使用 前未对使

16、用的 设备进行检查 确认。2编写验证方案前 检查所使用仪器 的校准日期1162015.11.04用前对设备的计 量效期、确认效 期进行确认。在 效期内方可使 用。8118序项目潜在的失效模式潜在的失严潜在失效造成原因发现有控制措施可检RP责任及目标措施结果号效后果重 性S生 可 能 性O测性DN完成日期采取措施SODRPN05对照培养 基、检查用 培养基、检 定菌、干热/ 湿热灭菌指 示条对照培养基、检查 用培养基、检定 菌、干热质热灭菌 指本条，失效。导致验证 失败。6未对照培养基、检查 用培养基、检定菌、 干热/湿热灭菌指示条 进行期间核查。使用 前未对效期进行检查 确认。2对照培养基、检

17、查用 培养基、检定菌、干 热/湿热灭菌指示条 进行期间核查。使用 前未对效期进行检 查确认。1122015.11.04对耗材管理人员 进行培训，严格 执行 “2-01012-11培养基的制备 和保管管理规 程”和“2-01013-0 7检 定菌管理规程” 规定的核查周 期。试验人员使 用前对有效期进 行检查确认，合 格后方可投入使 用。811806缓冲液、消 毒剂、纯化水缓冲液、消毒剂、 纯化水配制不正 确或过有效期或 性状明显异常。导致验证 失败。61未严格按照标准要 求制备缓冲液和消毒 剂。2使用前未对缓冲液、 消毒剂、纯化水进行 效期和性状确认。2对实验人员进行验 证方案培训112201

18、5.11.04对缓冲液、消毒 齐心纯化水的管 理人员进行培 训，抽查期间核 查效果。8118严发生可检测性D措施结果序 号项目潜在的失效模式潜在的失 效后果重性S潜在失效造成原因可 能 性 O现有控制措施RPN责任及目标 完成日期采取措施SODRPN1.严格按照“2-01022-05（质07无菌器具、无菌手套/衣服无菌器具、无菌手 套/衣服，过有效期 或被污染。导致验证 失败。61未.严格按照“2-01022-05质量控 制实验室消毒剂、无 菌器具管理规程”制 备无菌器具和“2-01000-07质量控 制实验室管理规程” 制备无菌衣服。2使用前未确认无菌 器具、无菌手套/衣服 进行效期、包装确

19、认。2使用前对无菌器具、 无菌手套/衣服的制 备方法、有效期及包 装的完整性进行检 查。1122015.11.04量控制实验室消 毒剂、无菌器具 管理规程”制备 无菌器具和“2-01000-07（质 量控制实验室管 理规程"制备无 菌衣服。2.使用前对无菌 器具、无菌手套/ 衣服的有效期及 包装的完整性进 行确认。无误后 方可投入使用611608验证依据所 用检验操作 规程验证方案依据的 检验操作规程不 正确。导致验证 失败。8验证依据所用检验操 作规程未经批准。1检验操作规程审核 批准后进行验证方 案编写182015.10.30所用检验操作规 程在验证编写前 对其与现行版药 典进行

20、比对。8118序 号项目潜在的失效模式潜在的失 效后果严重潜在失效造成原因发生现有控制措施可检RPN责任及目标 完成日期措施结果采取措施SODRPN09培养基、缓 冲液、无菌 器具、无菌 衣服序套、 消毒剂的制 备方法试验人员未按“2-01022-05质 量控制实验室消 毒剂、无菌器具管 理规程”、“2-01000-07质 量控制实验室管 理规程”和“2-01012-11培 养基的制备和保 管管理规程”制 备相关检验用物 料。导致验证 失败。7人员培训考评不到 位。2对 “2-01022-05质 量控制实验室消毒 齐心无菌器具管理规程，“2-01000-07质量控制实验室 管理规程”和“2-0

21、1012-11培养基的制备和保管管 理规程进行培训1142015.11.04对其人员进行“2-01022-05质 量控制实验室消 毒剂、无菌器具管 理规程”、“2-01000-07质 量控制实验室管 理规程”和“2-01012-11培 养基的制备和保 管管理规程培 训，考评合格后上 岗。711710验证方法不 正确1 .验证方案编写不 正确。2 .未严格按照验证 方案开展验证工 作。导致验证 失败。8检测方案未经批准。1对验证方案进行审 核182015.11.061 .验证方案审核批 准后方可开展确 验证工作。2 .验证方案培训后 方可实施。8118序 号项目潜在的失效模式潜在的失 效后果严

22、重 性S潜在失效造成原因发 生 可 能 性 O现有控制措施可检测性DRPN责任及目标 完成日期措施结果采取措施SODRPN11控制菌检验 结果不符合实验组无菌落生 长，供试品可能有抑菌性。导致验证 失败。101供试品可能对试验 菌存在抑制作用。2.试验人员判断错误。2采用薄膜过滤法或 者培养基稀释法消 除产品抑菌性120方案批准后15个工作 日1 .可考虑采用薄 膜过滤法或者培 养基稀释法消除 产品抑菌性。2 .对实验室人员 进行培训，结果 观察时实施复核 制度。1011101.可考虑采用薄 膜过滤法或者培12实验组菌种 回收率不达 标各实验组菌落回 收率高于或低于 标准范围。导致验证 失败。

23、101供试品可能对试验 菌存在抑制作用。2试验人员计数错误。2采用薄膜过滤法或 者培养基稀释法消 除产品抑菌性120方案批准后15个工作 日养基稀释法消除 产品抑菌性。2.对实验室人员 进行培训，结果 观察时实施复核101110制度。序 号项目潜在的失效模式潜在的失 效后果严 重 性S潜在失效造成原因发 生 可 能 性 O现有控制措施可检测性DRPN责任 及目 标完 成日期措施结果采取措施SODRPN13样品储存环 境样品储存环境温 度、湿度异常。不 符合样品规定的 存放环境。导致样品 被污染或 失效。7样品存放环境温湿度 控制不当。2严格控制样品存放环境温湿度114每天 定期 观察每天定期观

24、察样品存放 室的温湿度，若异常， 及时采取措施调整。711714培养环境及 观察环境培养箱培养环境 温湿度和观察环 境异常。培养计数 结果不准 确，导致 验证失 败。7培养箱温湿度控制不 准确及观察方法不正 确。2每日定期观察培养 箱温湿度114每天 定期 观察1每天定期观察培养箱 的温度，若异常，及时 采取措施。2对观察方法进行培 训。7117序项目潜在的失效模式潜在的失严潜在失效造成原因发现有控制措施可检RP责任及目措施结果号效后果重 性S生 可 能 性O测性DN标完成日 期采取措施SODRPN15洁净区环境（供试品溶 液检查环 境）1 .洁净区温湿度、 压差异常。2 .洁净区环境被污 染

25、。影响验证 结果。71检测环境温湿度、压 差控制不当。2未定期对洁净区进 行清洁和消毒。3未定期监测洁净区 的环境。2每天定期观察洁净 区温湿度、压差114每天定期 观察1每天定期观察洁 净区温湿度、压 差，若异常，及时 采取措施调整。2按照SOP规定 定期对洁净区环 境进行清洁和消 毒；3.按照 “2-01000-07 质量控制实验室管理规程”规 定定期对洁净区 环境进行监测并 出具报告。7117扬子江药业集团四川海蓉药业有限公司YangtzRiverPharmaceuticGFouSichuaHaironp harmaceuticCb.,Ltd4.6. 阿戈美拉汀片（25mg）微生物限度检

26、查方法验证的不可接受风险汇总:编号项目/功能RPN(S XOX D)风险等级01控制菌检验结果不符合20(10 >2X1)中02实验组菌种回收率不达标20(10 >2X1)中注：当1&RPN<27,但严重性SX发生可能性。为10X2或9X2时，仍需按中 等以上风险进行后续控制。四、验证实施计划1 .确认前培训方案批准后1个工作日完成验证方案培训2 .组织实施确认方案批准后15个工作日完成验证方案的实施工作。3 .出具报告验证方案实施完成后5个工作日出具报告。阿戈美拉汀片（25mg）微生物限度方法验证方案Page33 of 31五、验证准备1 .验证依据1.1. 中国药

27、典(2015年版)四部：(1105)非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法；(1106)非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法。1.2. 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法(SOP2-02567);非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法(SOP2-02568)2 .验证条件2.1. 试验环境检测日期房间名称房间编号洁净级 别试验温度相对温度环境测试报告 书编号及结论环境监测 报告复印 件微生物限度 检查室1207-5C+A阳性室1212-5C+A2.2.使用的主要仪器及设备:仪器及设备名称型号设备管理编号校验肩效期至生产厂家校准报告 复印件电子天平pH计仪器及设备名称型号设备管理编号校验肩

28、效期至生产厂家校准报告 复印件立式压力烝汽灭菌 器（制备无菌器具）恒温干燥箱自动漩涡混合仪生化培养箱 （忐氧菌）生化培养箱（霉SffuX 菌）生化培养箱 （控制菌）立式压力烝汽灭菌 器（灭活）生物安全柜净化工作台2.3.菌种菌种名称检定菌编号配制菌液编号困液后效期 至菌种来源金黄色葡箱球菌CMCC （B）26003大肠埃希菌CMCC （B） 44102舸绿假单胞菌CMCC （B） 10104枯草芽抱杆菌CMCC （B） 63501白色念珠菌CMCC （F） 98001黑曲霉CMCC (F) 980032.4.培养基培养基名称配制批号干粉批号干粉来源培养基适用性 检查报告复印 件扬子江药业集团四

29、川海蓉药业有限公司YangtzRiverPharmaceuticGFouSichuaHaironp harmaceuticCb.,Ltd胰酪大豆月东琼脂培养基沙氏葡荷糖琼脂培养基胰酪大豆月东液体培养基沙氏葡荷糖液体培养基麦糠凯液体培养基麦糠凯琼脂培养基2.5.稀释液及溶液、消毒剂稀释液及溶液（消毒剂）名称配制批号有效期至 pH7.0无菌氯化钠-蛋白冻缓冲液 pH6.8无菌磷酸盐缓冲液0.9%无菌氯化钠溶液含0.05% （ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液口 0.2%新洁尔火溶液口 75%乙醇溶液2.6.实验方法中国药典（2015年版）四部：（1105）非无菌产品微生物限度检查：微

30、生物计数法;（1106）非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法。2.7.人员资质验证操作人员应具备微生物限度检查上岗资质，且在验证实施前应对其批准的验证 方案进行培训，应能证明验证人员能依照验证方案正确实施。培训时间培训人参加培训人员溯源资料确认人：确认日期：复核人： 复核日期： 阿戈美拉汀片（25mg）微生物限度方法验证方案Page35 of 31扬子江药业集团四川海蓉药业有限公司YangtzRiverPharmaceuticGFouSichuaHaironp harmaceuticCb.,Ltd六、验证内容1 .供试液的制备1.1. 取供试品10g,加pH7.0无菌氯化钠蛋白陈缓冲液至10

31、0ml,充分振摇使 混匀，作为1:10的供试液。1.2. 取1:10供试品10ml,加pH7.0无菌氯化钠蛋白冻缓冲液至 100ml,充分 振摇使混匀，作为1:100的供试液。1.3. 取1:100供试品10ml,加pH7.0无菌氯化钠蛋白冻缓冲液至 100ml,充 分振摇使混匀，作为1:1000的供试液。备注：供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不超过45Co供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。2 .菌液制备2.1. 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽抱杆菌的新鲜 培养物至胰酪大豆豚液体培养基中，30? 35c培养1824小时；分别取上述培 养物用0.9%无

32、菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白冻缓冲液，依次稀释 至、制成每1ml含菌数为小于100cfu的菌悬液。2.2. 接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，20? 25c培养23天；取此培养物用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白陈 缓冲液，依次稀释至 ,制成每1ml含菌数为小于100cfu的菌悬液。2.3. 将黑曲霉菌斜面的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20?25c培养5 ? 7天，使大量的抱子成熟。加入 3-5ml含0.05% (ml/ml )聚 山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白冻缓冲液，将 抱子洗脱。然后，采用适宜

33、方法吸出抱子悬液至无菌试管内，用含 0.05%（ml/ml ）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白 陈缓冲液依次稀释至 ,制成每1ml含抱子数小于100cfu的抱子悬 液。2.4. 上述菌悬液制备后若在室温下放置，应在2小时之内使用；若保存在28C , 可在24小时内使用。黑曲霉抱子悬液可保存在28C,在验证过的贮存有效期内使用。3 .计数方法的验证3.1. 需氧菌、霉菌及酵母菌计数（平皿法）所加菌液的体积不得超过供试液体积的1%。为确认供试品中的微生物能被充分检出，首先应选择最低稀释级的供试液进行计数方法适用性检查。3.1.1. 试验组取上述制备好的供试液，加入试

34、验菌液、混匀，使每 1ml供试液或每张滤膜 过滤的供试液中含菌量不大于100cfu。一取 的供t液9.9ml和小于10000cfu的铜绿假单胞菌菌悬液 0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆陈琼脂培养基1520ml,混匀，凝固，于3035c倒置培养3大点计菌落数。平行制备2个平皿。取 的供t夜9.9ml和小于10000cfu的金黄色葡萄球菌菌悬液 0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆陈琼脂培养基1520ml,混匀，凝固，于3035c倒置培养3大点计菌落数。平行制备2个平皿。一取 的供t液9.9ml和小于10000cfu的枯草芽抱杆菌菌悬液 0.1ml混匀后

35、，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆陈琼脂培养基1520ml,混匀，凝固，于3035c倒置培养3大点计菌落数。平行制备2个平皿取 的供13c液9.9ml和小于10000cfu的白色念珠菌菌悬液0.1ml混匀后,吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆陈琼脂培养基1520ml,混匀，凝固，于3035c倒置培养3大点计菌落数。平行制备2个平皿。一取 的供13c液9.9ml和小于10000cfu的黑曲霉菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆陈琼脂培养基1520ml,混匀，凝周，于3035c倒置培养3大点计菌落数。平行制备2个平皿。取 的供13c液9.9ml和小于10000c

36、fu的白色念珠菌菌悬液0.1ml混匀后,吸取1ml注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基1520ml,混匀，凝固，于2025c倒置培养5大点计菌落数。平行制备2个平皿。一取 的供13c液9.9ml和小于10000cfu的黑曲霉菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基1520ml,混匀，凝周，于2025c倒置培养5大点计菌落数。平行制备2个平皿。3.1.2. 菌液组一取小于100cfu的铜绿假单胞菌菌悬液、金黄色葡萄球菌菌悬液、枯草芽抱杆菌菌悬液、白色念珠菌菌悬液、黑曲霉菌悬液各1ml,注入平皿中，立即倾注胰酪大豆陈琼脂培养基约1520ml,混匀，凝固，于30

37、35c倒置培养3 大点计菌落数。各平行制备2个平皿。一取小于100cfu的白色念珠菌菌悬液、黑曲霉菌悬液各1ml,立即倾注沙氏葡 萄糖琼脂培养基各1520ml,混匀，凝固，于2025c倒置培养5大点计 菌落数。各平行制备2个平皿。3.1.3. 供试品对照组一取 的供试液1ml,注入平皿中，分别立即倾注 1520 ml温度不超过45c胰酪大豆陈琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，胰酪大豆陈琼脂培养基3035c倒置培养3大点计菌落数，沙氏葡萄糖琼脂培养基2025c倒置培养5大点计菌落数。各组平行制备 2个平皿。3.1.4. 结果判断3.1.4.1 计算公式：稀释剂对照组的平均菌落数-供试

38、品对照组的平均菌落数稀释剂对照组菌数的回收率:组的平均菌落数试验组的平均菌落数供试品对照组的平均菌落数试验组菌数的回收率: 组的平均菌落数3.1.4.2 判定标准：实验组、稀释剂对照组（如有）的菌数回收率应在0.52之间。若各试验菌的回收率均符合规定，照所用的供试液制备方法及计数方法进行该供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。3.1.5. 验结果供试品批号、。菌种类型试验 次数菌液组试验组供试品 对照组回收率铜绿假单胞菌1平均21平均3平均金黄色葡锢球 菌1平均:2平均3 1平均枯草芽抱杆菌1平均2平均3平均白色念珠菌（需 氧菌验证）1平均2平均3平均黑曲霉（需氧菌 验证）1平均2平均3平

39、均白色念珠菌（霉 菌、酵母菌验 证）1平均2平均菌种类型试验 次数菌液组试验组供试品 对照组回收率3平均黑曲霉（毒菌、 酵母菌验证）1平均2平均3平均结果判定：验证人：日期：复核人：日期：4 .控制菌检查4.1. （大肠埃希菌）的验证4.1.1. 试验组取 的供试液 ml （取相当于1g或1ml供试品的供试液），小于100cfu的大肠埃希菌菌悬液1ml,加至约100ml的胰酪大豆豚液体培养基，于3035c 培养1824小时。4.1.2. 阴性对照组取pH7.0无菌氯化钠蛋白冻缓冲液10ml,加至约100ml的胰酪大豆陈液体培养基，于3035c培养1824小时。4.1.3. 阳性对照组取小于10

40、0cfu的大肠埃希菌菌悬液1ml,加至约100ml的胰酪大豆豚液体培养 基，于3035c培养1824小时。4.1.4. 检查取上述培养物1ml,接种至含100ml麦康凯液体培养基内培养，4244c培养2448小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂平板上3035c培养1872小时。检查结果如下:第一次试验结果:供试品批号在舁 厅P步骤实验组阳性对照组阴性对照组1我酪大豆豚液体培养基，3035 c培养1824小讨2麦康凯液体培养基，4244c培养2448小时3取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂平板上，3035 C培养1872小时。若麦康凯琼脂培养基平板上后菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂培养基平板上没启菌落生长， 或虽由菌落生长