鼠尾胶原制备

1、鼠尾胶原是一种天然培养基，它具有促进体外培养细胞（特别是上皮细胞）贴壁的作用，同时它也是一种天然的黏附剂， 当我们需要在培养瓶或培养皿内放置小玻片， 制备细胞爬片时， 可在瓶底涂一层胶原， 再放上小玻片，自然干燥后小玻片就固定于培养瓶之中。通过本实验可掌握鼠尾胶原的制备方法，以及如何切割小玻片，并利用鼠尾胶原将其固定于培养瓶内。实验设备及材料：大鼠尾巴、剪刀、镣子、止血钳、弯头吸管、平皿、三角烧瓶、烧杯、量筒、天平、生理盐 水、75%酒精、0.1%醋酸溶液、盖玻片、培养瓶、钻石笔、鼠尾胶原。实验内容：1、制备鼠尾胶原。2、切割小玻片。3、利用鼠尾胶原将小玻片固定于培养瓶内。实验步骤：制备鼠尾胶

2、原：1、取大鼠尾巴洗净，75%酒精浸泡5分钟；2.将尾巴剪开、去掉皮毛，并剪成小段，抽出银色的尾键3、将尾腱剪断置于平皿中，生理盐水浸泡；4、重复步骤2、3,直至尾腱量够用；5、吸去生理盐水，将尾腱称重（0.5-1克）；6、将尾腱置于平皿内剪碎，转移至三角烧瓶中；7、按每克尾腱50ml的比例，加入0.1%醋酸溶液；8、摇晃，使尾腱分散于醋酸溶液中，4 c放置一星期；9、离心，4000转/分，10-15分钟；10、吸取上清，分装成小瓶，4 c保存。醋酸的配置：36 %的醋酸如何配制成0.1mol/L的醋酸溶液先计算36%的醋酸的摩尔浓度（mol/L）,稀释相应的倍数到0.1mol/L。一般来说，

3、常温下溶质是固体的，其溶液的百分比浓度（）是质量比体积；而常温下溶质为液体时，其溶液百分比浓度是体积比体积。醋酸常温下为液态，故36 %是体积比体积，100毫升溶液中含36毫升的醋酸。醋酸的相对密度为1.05 ,故36毫升醋酸的质量为36 X1.05=37.8克；醋酸的分子式 CH3COOH ,分子量为60,故36毫升醋酸的摩尔数为 37.8与0=0.63（mol）,故36 %的醋酸溶 液的摩尔浓度为0.63至.1=6.3（mol/L）。取1份36 %的醋酸溶液，再加 62份的水，即成0.1mol/L。依次类推、鼠尾胶原-鼠尾I型胶原蛋白鼠尾胶原蛋白SDS-PAGE电泳对比简介鼠尾I型胶原蛋白

4、（Collagenfromrattail,TypeI ）系采用Birkedal-Hansen方法在无菌下制备，纯度达到95%以上，可溶于 0.006mol/L乙酸。本品可用于细胞培养皿的包被，特别适合普 通细胞培养器皿不易贴壁细胞的培养；也可用于制备三维胶原凝胶，使细胞在模拟的三维环境中生长。质量标准1、SDS-PAGE分析纯度大于 95%。2、无菌检验结果为阴性。3、本品2g/cm血被细胞培养皿后培养PC-12细胞，贴壁及生长正常。4、本品浓度1mg/mL, pH7.0时形成具有一定强度的三维胶原凝胶，NIH-3T3细胞在三维凝胶内生长正常、PC-12细胞在三维凝胶表面生长正常。使用方法1、

5、细胞培养器皿的表面包被以包被浓度为2g/cm2为例，用无菌0.006mol/L乙酸将胶原蛋白稀释到 0.012mg/mL。加到 相应的培养器皿中，确保胶原蛋白溶液铺满器皿的表面。开盖在超净台上过夜晾干， 也可以在室温放置1小时后，用PBS洗34次后直接使用。包被好的器皿在 425c至少可保存三 个月以上的时间。2、三维胶原凝胶的制备A、无细胞三维胶原凝胶的制备（以配制1mg/mL三维胶1mL为例）将200 dL本品加到置于冰浴的离心管中，加入690dL双蒸水，然后加到 12dL0.1mol/LNaOH中（如果反过来把12 dL0.1mol/LNaOH加到胶原溶液中，会由于NaOH不能迅速混匀而

6、产生局部的胶原凝结），立即混匀。再加入100wL10X PB械10><养液，混匀后立即加到培养器皿中（混匀后pH为7左右，如果PBS或培养液中没有加酚红，初次使用时需要测定pH值）。将培养器皿在室温放置20min待胶凝固后，转移到培养箱内。如果配制中使用的是10XPBS,使用前需要加入适当体积的细胞培养液预平衡。B、含细胞三维胶原凝胶的制备（以配制1mg/mL三维胶1mL为例）准备好悬浮于培养液的细胞，并放置于冰浴中。将 200本品加到 12dL0.1mol/LNaOH中（如果反过来把 12科L0.1molLNaOH加到胶原溶液中，会由于NaOH不能迅速混匀而产生局部的胶原凝结），

7、立即混匀。再加入 23L10XPB碱10维养液，混匀后立即加到培养器皿中（混匀后 pH为 7左右，如果PBS或培养液中没有加酚红，初次使用时需要测定 pH值）。加入760 dL的细 胞悬浮液，混匀后立即加到培养器皿中。将培养器皿在室温放置20min待胶凝固后，加入适当体积的细胞培养液，转移到培养箱中培养。本品在室温下pH中性时可迅速成胶，在操作过程中要尽量保持低温。保存条件4c保存，切勿冻存，有效期一年。鼠尾胶原-实验应用涂布鼠尾胶原探讨应用鼠尾胶原在豚鼠前庭毛细胞膜片钳实验中的促进毛细胞贴壁效果。法制作鼠尾胶原，观察全细胞膜片钳实验中，自制的鼠尾胶原对前庭毛细胞的贴壁黏附作用。 结果无鼠尾胶

8、原时， 前庭毛细胞悬浮于外液，不宜封接；有鼠尾胶原时，前庭毛细胞贴附于培养皿底壁，易于封接和长时间（约8h）的观察和记录。鼠尾胶原对前庭毛细胞具有良好的贴壁黏附促进作用。结论鼠尾胶原能促进毛细胞贴壁，涂布鼠尾胶原有利于膜片钳实验的长时程记录；并且制作简便，成本低廉。鼠尾胶原在原代培养耳蜗血管纹边缘细胞中的应用。目的：建立利用自制的鼠尾胶原培养大鼠耳蜗边缘细胞的方法。方法：制作鼠尾胶原，并观察利用自制的鼠尾胶原所培养出大鼠耳蜗 边缘细胞的效果。结果：自制的鼠尾胶原能正常地培养出大鼠耳蜗边缘细胞，细胞角蛋白 18表达阳性，免疫组织化学结果和扫描电镜证实所培养的细胞具有典型的分泌上皮细胞特 征。结论

9、：成功建立了利用自制鼠尾胶原培养大鼠耳蜗边缘细胞的方法，并且制作简便，成本低廉。鼠尾胶原为底物的人鼻腔纤毛上皮细胞培养模式的建立目的建立以鼠尾胶原为贴附底物的 人鼻腔纤毛上皮细胞的体外培养模式，为人鼻腔黏液纤毛运输系统的研究提供科学有效的方法.方法制备鼠尾胶原并铺片，以鼠尾胶原为贴附底物组织块培养法培养人鼻腔纤毛上皮细 胞，培养7天时进行HE染色及扫描电镜和透射电镜观察细胞形态和结构，应用高速摄像技术测量纤毛摆动频率.结果鼠尾胶原要平坦均匀，平均厚度约为1mm； HE染色可见上皮细胞呈单层向周围爬开；扫描电镜下见纤毛上皮细胞呈不规则多角形，纤毛周围可见微绒毛；透射电镜下可见纤毛上皮细胞间为紧密

10、连接；同一细胞任意两点纤毛摆动频率是相同的；同一来源体外培养的钩突和下鼻甲的纤毛摆动频率是相同的.结论以鼠尾胶原为贴附底物人鼻腔纤毛上皮细胞的体外培养模式的成功建立，为今后研究鼻内用药对纤毛清除功能的影响提供了良好的方法和途径。鼠尾胶原-醋酸溶解无菌室1.将鼠尾胶原加入到 0.1M的醋酸中，制备成浓度为0.1%的溶液。在室温中搅拌1-3 小时直到完全溶解。2 .建议将溶液转移到拧口的玻璃瓶中，并小心的在瓶底铺上一层氯仿。氯仿的量约为胶原 溶液的10%。不要晃动或搅拌。在 2-8度中放置过夜。在无菌条件下转移上层的胶原溶液。我们不建议用过滤的方法无菌化。已经发现该方法会导致丢失蛋白。3 .稀释一定数量的胶原溶液。4 .按照6-10ug/cm2的浓度包被培养瓶。在室温或37度结合数小时或者 2-8度过夜。5 .从包被表面除去多余的液体。过夜干燥。如果胶原溶液不是无菌的，这时候可以在无菌细胞操作室中暴光在紫外线下过夜消毒。在接种细胞前用无菌的水漂洗。鼠尾胶原-真皮类似物的建立生友鼠尾胶原蛋白I型目的：探寻建立真皮类似物的培养方法。方法：原代培养人皮肤成纤维细胞，制备鼠尾胶原，将鼠尾胶原溶液、浓缩培养基、NaOH溶液和以血清重悬的成纤维细胞