鸡大肠杆菌的分离与鉴定

1、鸡大肠杆菌的分离与鉴定摘要：* 市某鸡场5600 只 240 日龄罗曼蛋鸡陆续发病，产蛋率迅速下降，病死率约为6%。病鸡多呈精神沉郁、食欲减退，腹部膨大，粪便呈灰绿色或黄色，多经 23 周死亡， 初步诊断为大肠杆菌病。采集 2 只病鸡的肝和卵巢，通过细菌的分离培养，获得2 株革兰氏阴性杆菌。糖发酵试验、三糖铁琼脂试验、尿素分解试验、硫化氢产生试验、药敏试验、IMVIC试验确定其为大肠杆菌。玻板凝集 试验鉴定其。抗原型为O;选用10种临床常用的抗菌药进行药敏试验，结果表 明分离菌株对先锋 V多粘菌素、味喃妥因敏感，而对四环素、林可霉素耐药。关键词： 鸡，大肠杆菌病，分离，鉴定论文试验鸡大肠杆菌病

2、是由某些血清型的致病性大肠埃希氏菌引起的鸡的非肠道传染性疾病的总称。尽管近几年养鸡业发展迅速，但随着规模养殖的不断增加和产品流通的日益频繁，鸡大肠杆菌病越来越普遍，已经成为影响养鸡业快速发展的主要疫病之一。通过对大肠杆菌的分离、鉴定，对该病有着非常重要的意义。通过药敏试验测定大肠杆菌对药物的敏感，可为合理用药提供指导。本论文通过微生物学方法，对* 市某鸡场罗曼蛋鸡的疑似大肠杆菌病进行了确诊。1 材料1.1 病料来源2008年 3月 17日，*市某鸡场5600只 240日龄罗曼蛋鸡陆续发病，产蛋率迅速下降，病死率约为6%。病鸡多呈精神沉郁、食欲减退，腹部膨大，粪便呈灰绿色或黄色，多经23 周死亡

3、。采集2 只病鸡的肝和卵巢作为病料。1.2 培养基1.2.1 麦康凯琼脂（Mackonkey agar,蛋白陈20g,乳糖10g,氯化钠5g,牛胆 盐5g,中性红0.025g,琼脂粉20g,加蒸储水1000mL pH7.3）。1.2.2 三糖铁琼脂（蛋白陈20g,牛肉浸膏5g,乳糖10g,蔗糖10g,葡萄糖1g, 氯化钠 5g， 硫代硫酸钠0.2g， 硫酸亚铁0.2g， 琼脂粉20g， 0.4%酚红水溶液6.3mL，蒸储水1000mL除酚红指示剂外，各成分加热溶解，调至 pH7.4,然后加入酚红 指示剂，分装于试管；115高压蒸气灭菌15min 后，制成底层较深的斜面）。1.2.3 胰蛋白陈水

4、溶液（蛋白陈2.5g,氯化钠1.25g,蒸储水250mL溶解后调 pH为7.6,分装于试管，每管45mL 121c高压蒸气灭菌15min）。1.2.4 葡萄糖蛋白胨水溶液（每100 mL pH7.6 的邓亨氏蛋白胨水中加入葡萄糖1g,溶解后分装于试管，每管1mL 121c高压蒸气灭菌15min）。1.3 试剂1.3.1 M-R试剂（先将甲基红0.02g用95%酉精60mL溶解后，再加入蒸储水至 100mL）。1.3.2 V-P试剂（甲液为5% a蔡酚酒精溶液，乙液为40%勺氢氧化钾水溶液，将甲液和乙液分装棕色瓶中，于410保存）。1.3.3 革兰氏染色液（1）草酸钱结晶紫染液（A液：结晶紫2g

5、, 95*醇20mL B液：草酸钱1g, 蒸储水100mL将结晶紫研细后，加入95%酉精，使之?§解，配成A液；将草酸 铵溶于蒸馏水，配成B 液。两液混合即成）；（2）革兰氏碘液（碘片1g,碘化钾2g,蒸储水300mL先将碘化钾溶解于少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全部溶解后，加足水份即成）；（ 3） 95%的乙醇溶液（4）复红染液（将2.5g复红溶解于100mL酒精；取配好的复红酒精溶液10mL 与80mL蒸储水混合均匀即成）。1.4 药敏试纸庆大霉素、多粘菌素、四环素、先锋 V、味喃妥因、环丙沙星、林可霉素、新霉 素、罗红霉素等购自北京天坛生物制品公司。1.5 生化发酵

6、管包括：葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、乳糖、蔗糖、尿素、硫化氢、枸橼酸盐等微量生化发酵管，为杭州天和微生物试剂有限公司生产。1.6 实验仪器（ 1）天平：HAnGPINGJA2003（ 2）压力蒸汽灭菌器：上海华线医用核子仪器有限公司（ 3）无菌超净台：苏州金燕净化设备厂（4）离心机：TGL-16G上海安亭科学仪器厂（ 5）细菌微量生化反应器：杭州天和微生物技术开发公司（ 6）其他实验室常用仪器（接种环、移液器等）：* 区动物疫病预防控制中心2 方法2.1 病料的采集取发病鸡2 只，按照无菌操作技术打开腹腔，采集肝脏和卵巢作为病料。2.2 细菌的分离取采集的肝和卵巢病料，划线接种于麦康凯平板；所有接

7、种工作均采用严格无菌操作，在无菌超净台内完成。2.3 细菌的纯培养挑取可疑细菌的典型菌落接种在麦康凯平板上，37需氧培养24h 后， 再挑取粉红色单个菌落再在麦康凯培养基上再进行分区划线，37c培养24h。连续纯培养3 代，得到细菌的纯培养物，同时进行革兰氏染色镜检。2.4 革兰氏染色镜检2.4.1 用接种环挑取一环生理盐水蘸于洁净玻片上，再用接种环挑取少量纯培养的细菌与玻片上的生理盐水混合，并均匀涂布于玻片上，自然干燥。2.4.2 在玻片上滴加草酸钱结晶紫染色液，作用 13min,水洗。2.4.3 加革兰氏碘液于玻片上媒染，作用 1min,水洗。2.4.4 再加95%酉精脱色，作用1530s

8、,水洗；加番红复染液复染1min,水洗,自然干燥后镜检，观察细菌染色与形态。2.5 生化试验2.5.1 三糖铁琼脂琼脂斜面接种（ 1）左手打开培养有细菌的麦康凯平板，右手持接种针，火焰灭菌后伸入平板内挑取单个菌落。（ 2）左手握住三糖铁琼脂斜面底部，用右手小指与手掌或小指与无名指拔出斜面培养管棉塞，将管口通过火焰灭菌。（ 3）接种针伸入斜面培养管内，先从斜面底部到顶端拖一条接种线，再自下而上地蜿蜒S型划线，或直接自下而上地蜿蜒 S型划线；冉将接种针垂直插入半周体培养基的中央，穿刺至培养基底部，然后沿原穿刺线退出接种针。（4）接种后，以火焰灭菌管口，塞上棉塞，置于37c温箱内培养24h,观察结果

9、。2.5.2 糖（苷、醇）类发酵试验用接种针取纯培养的待检菌接种于各糖类微量发酵管中，倒置后于37温箱内培养 2448h 观察结果。若细菌能分解此种糖类产酸，则指示剂呈酸性变化，发酵管中颜色发生改变；不分解此种糖类，则无颜色变化；产气可使倒置的小管内出现气泡。2.5.3 吲哚（ indole ）试验取待检菌纯培养物接种至蛋白陈水培养基中，37c培养35d。先加少量乙醴，摇动试管以萃取和浓缩吲哚，待其浮于培养液表面后，再沿管壁徐徐加入欧-波二氏试剂数滴，在接触面呈红色者即为阳性反应。2.5.4 甲基红（M-FR试验取待检菌纯培养物接种至葡萄糖蛋白陈水培养基中，37c培养35d,加入甲基红试剂两滴

10、，立即观察结果，红色者为阳性，黄色者为阴性。2.5.5 V-P 试验取待检菌纯培养物接种至葡萄糖蛋白陈水培养基中，37c培养35d,加入等量的 V-P 试剂（先加V-P 甲液，再加V-P 乙液），混匀后观察结果，呈红色者为阳性，不呈红色者为阴性。2.5.6 枸橼酸盐利用试验无菌操作，用接种针取纯培养的待检菌接种于各糖类微量发酵管中，倒置后于37温箱内培养2448h 观察结果。若细菌能利用枸橼酸盐，则发酵管中颜色发生改变；反之，则无颜色变化。2.5.7 尿素分解试验将纯培养菌接种在尿素培养基中，经37培养过夜。如培养基呈酚红指示剂碱性反应深红色为阳性。如为浅红色或因培养基中葡萄糖发酵产酸而呈酸性

11、反应黄色为阴性。2.5.8 硫化氢产生试验将细菌纯培养穿刺接种于硫化氢生化培养管中，在37培养过夜。如果培养基呈黑色则为阳性反应。2.6 菌体。抗原鉴定（玻板凝集试验）2.6.1 以适量的灭菌生理盐水将平板中的细菌洗下，转移入1.5mL离心管中，10000r/min ,5min；去上清，沉淀用0.5mL生理盐水振荡混匀，10000r/min ,5min； 重复洗涤3次后去上清，沉淀用0.5mL生理盐水振荡混匀，制成悬液；121c高压蒸汽灭菌1h。2.6.2 先分别取O抗血清1滴于洁净玻板上，然后取供试菌株悬液50仙L与血清 分别混匀，上下摇动玻板数次，在1-3min 内观察并判定结果。同时用灭

12、菌生理盐水设立对照用以检查细菌自凝现象。2.7 药敏试验挑取纯培养后的2 株大肠杆菌单个菌落，接种到营养肉汤中，37振摇培养24h。用灭菌的棉球蘸取细菌的肉汤培养物均匀涂布到琼脂平板的表面，然后将庆大霉素、多粘霉素、四环素等10 种常用抗生素的药敏试纸分别贴到琼脂平板表面，先一块平板中央放药敏试纸一张，外周均匀分布6 张， 另外四种放在另一个平板上，37培养24h 后测量抑菌圈大小，根据标准进行判定。（高敏：抑菌圈直径大于15mm中敏：抑菌圈直径为1015mm低敏：抑菌圈直径小于 10mm。2.8 临床治疗2.8.1 选用药敏试验测定的敏感药物拌料，通过饲喂给药，连续3d。2.8.2 喂给全价

13、饲料，并添加维生素 Co每天饮用氯化钙水溶液（将 200g的氯化钙溶于10kg 水中，供1000 羽鸡饮用），连用710d。3 结果3.1 细菌的分离与镜检在麦康凯培养基上培养后，可见有表面光滑、边缘整齐、圆形、 隆起的红色菌落，共分离到2 株疑似大肠杆菌。分离纯化后的细菌经革兰氏染色镜检后观察，视野中可见有大量散在排列，形态均一的中等大小红色杆菌。3.2 . 生化实验鉴定结果3.2.1 不能产生硫化氢和分解尿素，符合大肠杆菌的特性。3.2.2 TSI 反应模式为：斜面产酸变黄，管底产气，不产生硫化氢。3.2.3 呷咪试验阳性，M-R试验阳性，V-P试验阴性，不利用枸檬酸盐，符合大 肠杆菌IM

14、VIC反应特性+-。3.2.4 糖发酵试验产酸产气（葡 乳 麦 甘 ）， 发酵管变黄，有气泡； 不利用蔗糖。3.2.5 通过以上结果，可确定所分离的细菌为大肠杆菌。3.3 O 抗原测定结果通过玻板凝集试验，测得2个菌株的。抗原的类型都为Q。3.4 药敏试验结果药敏试验结果（表1）表明，所分离的大肠杆菌对环丙沙星、先锋 V、多粘菌素、 链霉素、吠喃妥因高敏；对庆大霉素、罗红霉素中敏；对新霉素低敏；对林可霉 素、四环素耐药。从而表明菌株对先锋 V、多粘菌素、吠喃妥因等八种抗生素敏 感；对四环素、林可霉素明显耐药。表1药敏试验结果（mm菌株庆大霉素环丙沙星先锋V吠喃妥因林可霉素四环素多粘新霉素罗红霉

15、素链霉素11322231700189_1216212.52121.516.50018.58.51116.5注：抑菌圈直径大于15mmfc高敏，直径为1015mncfc中敏，直径小于10mmM氐 敏、不敏感。3.5 治疗情况通过选用敏感药物环内沙星饲喂给药，3天后死亡率明显减低；在治疗1个月后， 回访资料表明，该鸡群已经临床恢复健康。4讨论致病性大肠杆菌危害养殖业的重要病原菌； 健康禽类具有完整的防御系统，足以 抵挡致病性大肠杆菌的自然感染。 但当鸡体粘膜的防御屏障破坏时，就很容易被 感染。另外，凡能引起机体抵抗力降低的各种因素，如环境恶劣、通风不良及其 他疾病的存在，特别是各种病毒的感染，都可以诱发大肠杆菌病。该病的防制原则是加强管理，搞好预防为主，采用自家（或优势菌株）多价油佐剂 苗