昆明医学院第二附属医院检验科课件

1、 酶免疫技术酶免疫技术放射免疫技术放射免疫技术发光免疫技术发光免疫技术酶免疫技术酶免疫技术三大经典标记技术酶免疫技术酶免疫技术-三大经典标记技术之一三大经典标记技术之一三大经典标记技术：三大经典标记技术：抗原抗体反应的特异性抗原抗体反应的特异性+酶高效催化反应的专一性酶高效催化反应的专一性酶免疫技术的酶免疫技术的原理及特点原理及特点邻苯二胺邻苯二胺 OPDOPD四甲基联苯胺四甲基联苯胺 TMBTMB5-5-氨基水杨酸氨基水杨酸5-ASA 5-ASA 2,2-2,2-氨基氨基- -二二(3-(3-乙基乙基- -苯并噻苯并噻唑啉磺酸唑啉磺酸-6)-6)铵盐铵盐 ABTSABTS常用底物常用底物酶免

2、疫技术的核心组成部分酶免疫技术的核心组成部分 酶结合物酶结合物（conjugateconjugate）酶标记物酶标记物 通过化学反应或免通过化学反应或免疫学反应，让酶与疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的抗体或抗原形成的结合物结合物 酶标记抗体或抗原酶标记抗体或抗原抗原要求纯度高，抗原性完整抗原要求纯度高，抗原性完整 抗体需要特异性好、效价高、亲抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。产，易纯化。 制备方法要求制备方法要求酶标记抗体或抗原酶标记抗体或抗原制备方法要求制备方法要求技术方法简单、产率高，重复性技术方法简单、产率高，重复性好好标

3、记反应不影响酶和抗原或抗体标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性的活性酶标记物稳定酶标记物稳定 ，不形成聚合物，不形成聚合物酶标记抗体或抗原酶标记抗体或抗原制备方法制备方法戊二醛交联法戊二醛交联法酶标记抗体或抗原酶标记抗体或抗原 改良过碘酸钠法改良过碘酸钠法纯化及鉴定纯化及鉴定标记完成后应除去反应液中的游离酶、标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，避免游离酶增加非特或抗原聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度作用而降低特异性染色强度 常用的纯化方法：

4、常用的纯化方法：葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶G-200/G-150G-200/G-150过柱层析纯化过柱层析纯化50%50%饱和硫酸铵沉淀提纯饱和硫酸铵沉淀提纯酶标记抗体或抗原酶标记抗体或抗原固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法用方法 固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面到固相载体的表面 固相载体固相载体要求要求 结合抗体或抗原的容量大结合抗体或抗原的容量大 抗体或抗原牢固地固定在其表面抗体或抗原牢固地固定在其表面 不影响免疫反应性不影响免疫反应性

5、利于反应充分进行利于反应充分进行 固相方法简便易行，快速经济固相方法简便易行，快速经济种类种类塑料制品塑料制品 微颗粒微颗粒膜载体膜载体 固相载体固相载体将抗原或抗体结合于固相载体将抗原或抗体结合于固相载体用用1%1%5%5%的牛血清白蛋白或的牛血清白蛋白或5%5%20%20%小牛血小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附特异性吸附包被包被coatingcoating封闭封闭blockingblocking包被与封闭包被与封闭酶酶免免疫疫技技术术酶免疫组化酶免疫组化酶免疫测定酶免疫测定均均 相相非均相非均相固相酶免疫测定固相酶免疫测定液相酶免

6、疫测定液相酶免疫测定组织切片或其它标本中抗原的定位组织切片或其它标本中抗原的定位 液体标本中抗原或液体标本中抗原或抗体的定性和定量抗体的定性和定量用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定 酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变，不用分离结合标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。的改变，而确定抗原或抗体的含量。原理原理均相酶免疫测定均相酶免疫测定最具代表性的两种技术最具代表性的两种技术酶放大免疫测定技术酶放大

7、免疫测定技术EMITEMITenzyme-mutiplied immunoassay technique克隆酶供体免疫分析克隆酶供体免疫分析 CEDIACEDIAcloned enzyme donor immunoassay 均相酶免疫测定均相酶免疫测定与均相不同与均相不同之处之处需分离游离与结合的酶标记物需分离游离与结合的酶标记物非均相酶免疫测定非均相酶免疫测定底物显色底物显色定性或定量的分析定性或定量的分析原理原理包被包被反应反应加入待测抗体或加入待测抗体或抗原和酶标抗原抗原和酶标抗原或抗体或抗体洗涤洗涤使结合在固相上使结合在固相上的抗原抗体复合物的抗原抗体复合物与未结合的分离与未结合的分

8、离1234一、基本原理一、基本原理固相的抗原或抗体固相的抗原或抗体 酶标记物（酶结合物酶标记物（酶结合物） 酶反应的底物酶反应的底物 三个必要试剂三个必要试剂 二、方法类型及反应原理二、方法类型及反应原理双抗体夹心法双抗体夹心法方法：方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色标抗体，加底物显色应用：应用： 二价或二价以上的较大分子抗原测定二价或二价以上的较大分子抗原测定 常用于检测乙型肝炎表面抗原和常用于检测乙型肝炎表面抗原和e e抗原等抗原等ELISAELISA检测抗原的方法检测抗原的方法双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原+ +- -E

9、 EE EE EE EE EE EE EE EE EELISAELISA检测抗原的方法检测抗原的方法竞争法测抗原竞争法测抗原+ +- -E EE EE EE EE EE EE E2 2、加待检物、加待检物抗原与酶标抗抗原与酶标抗原竞争与抗体原竞争与抗体结合结合3 3、加酶作用、加酶作用的底物不显色的底物不显色或显色弱或显色弱3 3、加酶作用、加酶作用的底物显色的底物显色1 1、已知抗体包、已知抗体包被于载体表面被于载体表面1 1、已知抗体包、已知抗体包被于载体表面被于载体表面2 2、加待测物、加待测物和酶标抗原，和酶标抗原，酶标抗原与抗酶标抗原与抗体结合体结合E E1 1、间接法、间接法方法方

10、法 用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgGIgG（抗（抗抗体或二抗）加底物显色。抗体或二抗）加底物显色。优点优点 一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体应用应用 常用于常用于HCVHCV抗体、抗体、HIVHIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定ELISAELISA检测抗体的方法检测抗体的方法间接法测抗体间接法测抗体- -E EE EE EE EE EE EE EE EE E2 2、双抗原夹心法、双抗原夹心法原理：原理：类似双抗体夹心法类似双抗体夹心法操作步骤操作步骤：类似类似 应

11、用：应用：乙型肝炎表面抗体乙型肝炎表面抗体ELISAELISA检测抗体的方法检测抗体的方法ELISAELISA检测抗体的方法检测抗体的方法4 4、捕获法、捕获法 应用：应用： 病原体急性感染诊断中的病原体急性感染诊断中的IgMIgM型抗体型抗体 甲型肝炎甲型肝炎HAV-IgMHAV-IgM抗体抗体 乙型肝炎病毒核心乙型肝炎病毒核心HBc-IgMHBc-IgM抗体抗体ELISAELISA检测抗体的方法检测抗体的方法原理：原理：抗人抗人IgMIgM链抗体包被链抗体包被捕获待测标本中捕获待测标本中IgMIgM类抗体类抗体加入特异性抗原和酶标记特加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体异性抗原的抗体 底物显色底物显色 捕获法原理捕获法原理+ +- -E EE EE EE EE E 1 1、固相化抗人、固相化抗人IgMIgM1 1、固相化抗人、固相化抗人IgMIgM2 2、加待测物、加待测物特异性特异性IgMIgM与与非特异性非特异性IgMIgM和抗人和抗人IgMIgM结合结合3 3、加特异性、加特异性抗原，与特异抗原，与特异性抗体结合性抗体结合4