第8章_PCR技术及其应用-张静2014

1、第八章第八章 PCR技术及其应用技术及其应用前言前言 PCR技术简史技术简史第一节第一节 PCR技术原理和工作方式技术原理和工作方式第二节第二节 PCR产物的克隆产物的克隆第三节第三节 PCR扩增未知扩增未知DNA片段片段第四节第四节 与反转录相关的与反转录相关的PCR（自学）（自学）第五节第五节 PCR产生产生DNA指纹（自学）指纹（自学）第六节第六节 实时定量实时定量PCR前言前言 PCR技术简史技术简史链式反应：链式反应：chain reaction核链式反应核链式反应：指能：指能自持进行自持进行的原子核反应。的原子核反应。 DNA的复制的复制聚合酶链反应的发明聚合酶链反应的发明PCR：

2、polymerase chain reaction，聚合酶链式，聚合酶链式反应反应。1971年，年，Khorana(霍拉纳霍拉纳)提出：经过提出：经过DNA变变性，与合适引物杂交，用性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。基因。但由于但由于测序测序和和引物合成引物合成的困难，以及的困难，以及70年代年代基基因工程因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所技术的发明使克隆基因成为可能，所以，以，Khorana的设想被人们遗忘了的设想被人们遗忘了ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTAT

3、CGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解旋酶 解链酶解链酶DNA解旋解链解旋解链合成引物合成引物子链延长子链延长设想设想ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链解旋解链合成引物合成引物子链延长子链延长GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶引物酶引物酶ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链解旋解链合成引物合成引物子链延长子链延长GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAG

4、CGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶1985年年，美国，美国PE-Cetus公司的公司的Mullis(穆利斯穆利斯)等人等人发明了聚合酶链反应（发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理基本原理是在试管中模拟细胞内的是在试管中模拟细胞内的DNA复制复制最初采用最初采用E. coli DNA聚合酶聚合酶进行进行PCR，由于，由于该酶该酶不耐热不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热耐热DNA聚合酶聚合酶1989年美国年美国Science杂志列杂志列PCR 为十余为十余项重大科学发明之首，比喻项重大科学发明之首，比喻1989年为年为P

5、CR爆炸年，爆炸年，Mullis荣获荣获1993年度诺贝尔化学奖。年度诺贝尔化学奖。引物引物引物引物()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20一、一、PCR的基本原理的基本原理第一节第一节 PCR技术原理和工作方式技术原理和工作方式Target AmplificationNo. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cyc

6、le = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 Amplicon二、二、PCR反应体系反应体系u缓冲液缓冲液u脱氧三磷酸核苷脱氧三磷酸核苷(dNTPs)u引物引物u模板模板u耐热性的耐热性的DNA聚合酶聚合酶131 缓冲液缓冲液10 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L KCl，pH=8.3-9.0，厂商提供。，厂商提供。Mg2+是是DNA聚合酶的激活剂，厂商提供，使用浓度为聚合酶的激活剂，厂商提供，使用浓度为0.5 -2.5 mmol/L反应体系。反应体系。Mg2+可与负离子结合，所

7、以反应体系中可与负离子结合，所以反应体系中dNTPs、EDTA等的浓度影响反应中游离的等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度浓度2、脱氧三磷酸核苷、脱氧三磷酸核苷(dNTPs) dATP、dGTP、dCTP、dTTP四种的等量混合物四种的等量混合物。dNTPs浓度取决于扩增片段的长度。浓度取决于扩增片段的长度。浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量。产量。PCR引物的设计一般原则引物的设计一般原则1.引物长度一般以引物长度一般以1830bp为宜。为宜。2.解链温度解链温度(Tm值值) 直接决定了退火温度直接决定了退火温度(Ta值值)的

8、高低。的高低。两条两条引物间的引物间的Tm值越接近越好值越接近越好。3.避免引物内部出现避免引物内部出现二级结构二级结构。3、引物、引物使用浓度为使用浓度为0.1-0.5 mol/L。浓度过低则产量低，过高则易导致错配，浓度过低则产量低，过高则易导致错配，PCR特异性下降。特异性下降。4.要避免引物自身或引物间特别是要避免引物自身或引物间特别是3末端碱基序列互补末端碱基序列互补。5.G/C和和A/T碱基均匀分布碱基均匀分布，G+C含量在含量在4060%之间，引物之间，引物碱基序列尽可能选择碱基碱基序列尽可能选择碱基随机分布随机分布。6.引物引物3末端碱基一般应与模板末端碱基一般应与模板DNA严

9、格配对，并且严格配对，并且3末端末端为为G、C或或T时引发效率较高时引发效率较高。7.引物引物5末端碱基可不与模板末端碱基可不与模板DNA匹配匹配，可添加与模板无关，可添加与模板无关的序列，便于克隆和表达，但其的序列，便于克隆和表达，但其保护碱基有一定的要求保护碱基有一定的要求。8.引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。4、模板、模板 单、双链单、双链DNA均可。均可。模板纯度模板纯度不高（混有蛋白酶、核酸酶、不高（混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制聚合酶抑制剂、剂、DNA结合蛋白类）往往是限制结合蛋白类）往往是限制PCR扩增的重要因素。扩增的重要因素。一

10、个一个PCR反应中反应中104至至107个个模板分子可获得较理想的效模板分子可获得较理想的效果。果。不同属性的模板所加的理想的量不同不同属性的模板所加的理想的量不同。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。5、耐热性的、耐热性的DNA聚合酶聚合酶 均从耐热性的细菌中分离出来，普遍具有均从耐热性的细菌中分离出来，普遍具有53聚合酶和聚合酶和53外切酶活性，但在外切酶活性，但在35外切酶活性外切酶活性、耐热性耐热性和附加功和附加功能上有差异。常用的有：能上有差异。常用的有： 1）Taq DNA聚合酶：最常用，聚合酶：最常用，95时的半衰期为时的半衰期为40分钟

11、分钟，75时活性最强，时活性最强，没有校正功能没有校正功能。 2）Tth DNA聚合酶：聚合酶：95时的半衰期为时的半衰期为20分钟分钟，74时进时进行扩增，在行扩增，在MnCl2催化下的催化下的高温反转录功能高温反转录功能。 3）Vent DNA聚合酶：聚合酶：100时的半衰期为时的半衰期为1.8小时小时，具校正功具校正功能能，保真度比保真度比Taq高高5-15倍倍。 4）Pwo DNA聚合酶：聚合酶：100时的半衰期时的半衰期大于大于2小时小时，有校正有校正功能，保真度高功能，保真度高。 5）Pfu DNA聚合酶：聚合酶：具有极高的热稳定性，目前公认是最具有极高的热稳定性，目前公认是最保真

12、的保真的。 6）混合）混合DNA聚合酶：将具有校正功能的酶与聚合酶：将具有校正功能的酶与Taq酶按一定比酶按一定比例混合，具有类似例混合，具有类似Taq的强启动合成能力，同时又有一定的保的强启动合成能力，同时又有一定的保真度，而且具有一定的扩增长片段的能力真度，而且具有一定的扩增长片段的能力。 Taq酶的延伸速度为酶的延伸速度为1-2kb/min，但具有校正功能的酶的延伸，但具有校正功能的酶的延伸速度要小些，一般只能按照速度要小些，一般只能按照600-700bp/min来预计。来预计。 1、常规程序：、常规程序： 94左右预变性几十秒至几分钟；左右预变性几十秒至几分钟； 94左右变性左右变性5

13、秒至秒至1分钟；分钟； 50-65左右退火左右退火30秒至秒至1分钟；分钟； 72左右延伸左右延伸30秒至几分钟；秒至几分钟； 72左右最后延伸和加尾左右最后延伸和加尾3-10分钟；分钟； 4-25保持保持3分钟或更长。分钟或更长。20-35个循环个循环222、退火和延伸温度：、退火和延伸温度： 退火温度退火温度Ta值由值由Tm值决定值决定，多数情况下，多数情况下Ta采用采用Tm减去减去3-5。 当退火温度高到与延伸温度接近时，可以将退火和延伸当退火温度高到与延伸温度接近时，可以将退火和延伸温度合为一个，这时温度合为一个，这时PCR就由三步法变成了就由三步法变成了两步法两步法。3、反应时间：、

14、反应时间：变性步骤一般为变性步骤一般为5秒至秒至1分钟。分钟。退火时间一般为退火时间一般为30秒至秒至1分钟即可。分钟即可。延伸时间延伸时间从半分钟到从半分钟到10分钟以上不等，由扩增片段的长分钟以上不等，由扩增片段的长度和度和DNA聚合酶的延伸速度共同决定。聚合酶的延伸速度共同决定。Taq扩增时按扩增时按1kb/min计算，具校正活性的酶则按计算，具校正活性的酶则按0.6-0.7kb/min计算计算。4、循环次数：、循环次数： 多数为多数为25-35，主要取决于模板属性、模板丰度、引物，主要取决于模板属性、模板丰度、引物退火效率、退火效率、DNA聚合酶的扩增能力。聚合酶的扩增能力。5、PCR

15、反应液的配制：反应液的配制： 加试剂顺序：加试剂顺序：双蒸水、缓冲液、双蒸水、缓冲液、MgCl2、dNTPs、正向引物、正向引物、反向引物、模板、反向引物、模板、DNA聚合酶。聚合酶。 酶要用冰盒取放，禁止因手的接触或暴露于空气中而使酶升酶要用冰盒取放，禁止因手的接触或暴露于空气中而使酶升温。温。 第一次使用各试剂时要第一次使用各试剂时要轻柔充分混匀轻柔充分混匀。 正确保存各种试剂，尤其是要避免核酸因反复冻融而降解，正确保存各种试剂，尤其是要避免核酸因反复冻融而降解，各试剂宜各试剂宜分装分装成适量的小管。成适量的小管。PCR仪1 12 23 34 45 52222555572729494时间（

16、时间（minmin）温度温度（）适温延伸适温延伸3 3高温变性高温变性1 1低温退火低温退火2 2重复重复1313步步25302530轮轮目的目的DNADNA片段片段扩增扩增100100万倍以上万倍以上DNADNA双螺旋双螺旋DNADNA单链单链与引物复性与引物复性DNADNA变性变性形成形成2 2条单链条单链子链延伸子链延伸DNADNA加倍加倍模板DNA95PCRPCR的基本原理的基本原理PCRPCR反应条件反应条件PCRPCR过程过程PCRPCR的特点的特点50引物1引物2DNA引物PCRPCR的基本原理的基本原理PCRPCR反应条件反应条件PCRPCR过程过程PCRPCR的特点的特点引物

17、1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCRPCR的基本原理的基本原理PCRPCR反应条件反应条件PCRPCR过程过程PCRPCR的特点的特点72第1轮结束第2轮开始PCRPCR的基本原理的基本原理PCRPCR反应条件反应条件PCRPCR过程过程PCRPCR的特点的特点955072TaqTaqTaqTaqPCRPCR的基本原理的基本原理PCRPCR反应条件反应条件PCRPCR过程过程PCRPCR的特点的特点72第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增 第5轮扩增第6轮扩增理想拷

18、贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数 PCR的特点的特点灵敏度高灵敏度高皮克皮克(pg=10-12)量级扩增到微克量级扩增到微克(ug=10-6)水平水平能从能从100万个细胞中检出一个靶细胞万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达病毒检测的灵敏度可达3个个RFU细菌检测的最小检出率为细菌检测的最小检出率为3个细菌个细菌简便、快速简便、快速一次性加好反应液，一次性加好反应液，24 小时完成扩增小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等血液、体腔液

19、、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提组织的粗提DNAPCR中其它注意的事项中其它注意的事项1.防止污染防止污染试剂小量分装试剂小量分装吸头及吸头及EP管一次性使用管一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作器皿及工作区域要分开，无菌操作2.设立对照：设立对照：阳性对照：阳性对照： 阳性模板阳性模板阴性对照：阴性对照： 阴性模板、无模板阴性模板、无模板第二节第二节 PCR产物的克隆产物的克隆一、在一、在PCR产物两端添加限制性酶切位点产物两端添加限制性酶切位点在在PCR引物的引物的5加上根据需要而设计的加上根据需要而设计的酶切位点（保护碱酶切位点（保护碱基），基），PCR产物内部没有该切点。产

20、物内部没有该切点。PCR产物经电泳回收后，产物经电泳回收后，直接用限制酶进行切割直接用限制酶进行切割，纯化后与，纯化后与目标载体连接重组。目标载体连接重组。该法适用于直接将该法适用于直接将PCR产物产物克隆到表达载体进行功能研究克隆到表达载体进行功能研究，但构建好的表达载体但构建好的表达载体必须测序必须测序才能证明才能证明PCR产物的身份正产物的身份正确且没有突变。确且没有突变。二、二、A/T克隆克隆这是目前这是目前最通行最通行的的PCR产物克隆方法，基本思路是先将产物克隆方法，基本思路是先将PCR产产物与特制的物与特制的T载体载体进行连接重组，测序证明正确无误后，再从进行连接重组，测序证明正

21、确无误后，再从T载体上载体上亚克隆亚克隆到表达载体上进行功能研究。到表达载体上进行功能研究。Taq酶酶PCR产物的特点：该酶具有产物的特点：该酶具有末端转移酶活性末端转移酶活性，通常在其产，通常在其产物物DNA分子每条链的分子每条链的3末端末端加上一个突出的加上一个突出的A。T载体载体：通过特定制作技术：通过特定制作技术制作的在多克隆位点中间已开制作的在多克隆位点中间已开环的质粒载体，其环的质粒载体，其每条链的每条链的3末末端具有一个突出的端具有一个突出的T。A/T克隆克隆：将：将3末端具一个突出的末端具一个突出的A的的PCR产物与产物与T载载体连接重组，转化大肠杆菌，对鉴定为阳性的重组克隆子

22、体连接重组，转化大肠杆菌，对鉴定为阳性的重组克隆子的多克隆位点区的插入片段进行测序，然后再亚克隆到其的多克隆位点区的插入片段进行测序，然后再亚克隆到其它载体进行功能研究等。它载体进行功能研究等。PCR-TOPO技术技术：T载体上已经偶连有拓扑异构酶，载体上已经偶连有拓扑异构酶，因此因此PCR产物产物无需无需DNA连接酶连接酶而可直接与该而可直接与该T载体进行快载体进行快速连接重组。速连接重组。三、平末端三、平末端DNA片段的克隆片段的克隆所有具有所有具有校正功能校正功能的的DNA聚合酶扩增出来的聚合酶扩增出来的PCR产物均为产物均为平平末端末端，有两种克隆思路：，有两种克隆思路：一是在一是在P

23、CR完成后加入适量的完成后加入适量的Taq酶酶并在并在72保温保温20-30分钟，分钟，A/T克隆克隆。二是将平末端二是将平末端PCR产物与产物与平末端载体平末端载体进行连接克隆：进行连接克隆：1、pPCR-Script Amp SK(+)克隆载体：连接体系中除加有克隆载体：连接体系中除加有T4 DNA连接酶外，还加有限制酶连接酶外，还加有限制酶Srf，连接过程中，连接过程中载体自载体自连的产物总是被连的产物总是被Srf切切开开，而重组载体确不能被切开，转，而重组载体确不能被切开，转化子中重组子的比例就较高。化子中重组子的比例就较高。41422、pCR-Blunt克隆载体：载体的克隆载体：载体

24、的lacZ基因下游融合了基因下游融合了一个致死基因一个致死基因ccdB，载体自连转化的大肠杆菌不能存活，重，载体自连转化的大肠杆菌不能存活，重组载体的转化子则能长成菌落，因为致死基因已被插入失活。组载体的转化子则能长成菌落，因为致死基因已被插入失活。四、长片段四、长片段DNA的的PCR扩增扩增通常所用的通常所用的PCR方法都在两个方面有局限，即目标产物方法都在两个方面有局限，即目标产物精确程度和合成片段的大小。在常规的精确程度和合成片段的大小。在常规的 PCR 反应中，其产物反应中，其产物一般一般在在 2kb 以下以下。策略有：策略有：一是改进一是改进PCR缓冲液体系、优化缓冲液体系、优化PC

25、R条件。条件。二是采用混合酶，尤其是二是采用混合酶，尤其是Taq与与Pwo的混合酶可扩增的混合酶可扩增40kb左右的片段。左右的片段。一、反向一、反向PCR (reverse PCR)是用是用反向的互补引物反向的互补引物来扩增两引物以外的来扩增两引物以外的DNA片段对片段对某个已知某个已知DNA片段两侧的片段两侧的未知序列未知序列进行扩增。进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析，如探索邻接已知可对未知序列扩增后进行分析，如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆，扩增的克隆，扩增基因文库的插入基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。

26、；建立基因组步移文库。第三节第三节 PCR扩增未知扩增未知DNA片段片段已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列限制酶限制酶限制酶限制酶连接酶连接酶二、利用接头的二、利用接头的PCR/锚定锚定PCR (anchored PCR)将基因组总将基因组总DNA用限制酶切割，然后将用限制酶切割，然后将序列已知的接头序列已知的接头连接到酶切片段的两端，以提供连接到酶切片段的两端，以提供PCR的锚定引物，该锚定引的锚定引物，该锚定引物与已知序列中的基因特异引物物与已知序列中的基因特异引物(gene-specific primer, GSP)组组合后，用于目标基因侧翼序列的扩增。合后，用于目标基因侧

27、翼序列的扩增。锚定锚定PCR 技术进行技术进行染色体步染色体步行的操作行的操作流程流程48三、热不对称交错三、热不对称交错PCR (thermal asymmetric interlaced PCR, TAIL-PCR)原理原理：利用目标序列旁的已知序列设计：利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的个嵌套的特异性引物特异性引物(special prime, 简称简称sp1, sp2, sp3 ) ，用它们，用它们分别和分别和1个具有低个具有低Tm值的短的随机简并引物值的短的随机简并引物(Arbitrary degenerate prime 简称简称AD)相组合，以基因组相组合，以基因组DNA作为

28、作为模板，通过模板，通过3轮具热不对称的温度循环的分级反应来进轮具热不对称的温度循环的分级反应来进行行PCR扩增，从而获得已知序列旁的侧翼序列。扩增，从而获得已知序列旁的侧翼序列。49第一轮产物第一轮产物第二轮产物第二轮产物第三轮产物第三轮产物第一轮模板为基因组第一轮模板为基因组DNADNA，引物，引物SP1+ADSP1+AD第二轮将第一轮产物稀释第二轮将第一轮产物稀释1-10001-1000倍作为模板，倍作为模板，SP2+ADSP2+AD第三轮将第二轮产物稀释第三轮将第二轮产物稀释1-10001-1000倍作为模板，倍作为模板，SP3+ADSP3+AD已知序列已知序列(T-DNA)(T-DN

29、A)未知序列未知序列SP1SP1 SP2SP2 SP3SP3 AD AD TAIL-PCR 的操作流程：的操作流程：1 . 基因组基因组DNA 的获取的获取2 .已知序列的验证已知序列的验证3 .引物的设计：引物的设计：3 个个嵌套的特异性引物嵌套的特异性引物长度一般在长度一般在2030 bp 之间；之间；Tm 值一般值一般设设5868；SP1、 SP2 和和 SP3 之间最好相距之间最好相距100 bp以上以以上以便在电泳时更容易区分便在电泳时更容易区分 3轮轮PCR产物；产物；随机引物是按照物种普遍存在蛋白质的随机引物是按照物种普遍存在蛋白质的保守氨基酸序列保守氨基酸序列设计设计的，长度一

30、般是的，长度一般是 14 bp左右，左右， Tm值介于值介于3048之间。之间。4 .三次三次TAILPCR反应：反应：第第 1 次次PCR反应由反应由 5 次高特异性反应、次高特异性反应、 1 次低特异性反次低特异性反应、应、 10 次较低特异性反应和次较低特异性反应和 12 次热不对称的超级循环构成次热不对称的超级循环构成。通过通过 5 次高特异性的反应次高特异性的反应 ，使，使 sp1 与已知的序列退火与已知的序列退火并延伸并延伸 ；1 次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列上上 ； 接下来接下来 10 次较低特异性的反应使两种引物均

31、能与模板次较低特异性的反应使两种引物均能与模板退火退火 ，从而使原来由高严谨性循环所产生的单链靶，从而使原来由高严谨性循环所产生的单链靶DNA复复制成双链制成双链DNA。最后是进行最后是进行12次热不对称的次热不对称的TAIL循环（超级循环即循环（超级循环即2次次高特异性和高特异性和1次低特异性循环交替），目的片段得以指数性次低特异性循环交替），目的片段得以指数性地扩增。地扩增。53经过第一轮的经过第一轮的PCR反应得到了不同浓度的反应得到了不同浓度的3种类型产种类型产物：物：类型类型1是特异引物和随机引物之间扩增的产物（即目是特异引物和随机引物之间扩增的产物（即目标产物；标产物；类型类型2是

32、单独由特异引物扩增的产物；是单独由特异引物扩增的产物；类型类型3是单独由任意引物引发的产物。是单独由任意引物引发的产物。 增加目标产物浓度特异性增加目标产物浓度在第三阶段结束后，基本上只有类型在第三阶段结束后，基本上只有类型1产物，即目的产物。产物，即目的产物。5. 取第一，第二，第三轮取第一，第二，第三轮PCR产物各产物各3ul，用，用1%琼脂糖琼脂糖凝胶进行电泳检测。凝胶进行电泳检测。6. 切胶回收清晰的电泳条带，以切胶回收清晰的电泳条带，以SP3为引物对为引物对PCR产物产物进行测序验证。进行测序验证。第四节第四节 与反转录相关的与反转录相关的PCRPCR逆转录酶聚合酶mRNAmRNAc

33、DNAcDNA杂化双链杂化双链PCR扩增一、一、cDNA末端快速扩增末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)用于克隆全长用于克隆全长cDNA的的5和和3末端序列。末端序列。1、5 RACE原理示意原理示意图图2、3 RACE原理示意图原理示意图二、差异显示二、差异显示PCR (differential display PCR,DD-PCR)PCR (differential display PCR,DD-PCR)检测相似材料表达谱差异的经典方法，此后已衍生出许多新方法。检测相似材料表达谱差异的经典方法，此后已衍生出许多新方法。 DD-PCR是

34、在是在AP-PCR(任意引物任意引物PCR)基础上发明的一种基础上发明的一种RT-PCR方法，主要用于方法，主要用于2种或多种类似生物个体在基因表达种或多种类似生物个体在基因表达上的差异分析。上的差异分析。 基本原理基本原理：所有真核生物的成熟：所有真核生物的成熟mRNA都含有不同长度都含有不同长度的的poly+(A)尾部序列，根据尾部序列，根据poly+(A)内部的内部的2个核苷酸排列的个核苷酸排列的不同不同，可以将所有的，可以将所有的mRNA分子分为分子分为12类。类。 根据这根据这12种种mRNA序列可合成序列可合成12种相应的反转录引物，种相应的反转录引物，即即MNTTTTTTTT，用

35、其分别进行反转录，即可将所有，用其分别进行反转录，即可将所有mRNA分类合成分类合成12种种cDNA（于（于12个试管内），然后再用个试管内），然后再用锚锚定引物和随机引物定引物和随机引物，以这，以这12种种cDNA分别做模板进行分别做模板进行PCR扩扩增，那么与表型相关的增，那么与表型相关的mRNA就很容易被发现并克隆出来。就很容易被发现并克隆出来。 真核生物真核生物12种种mRNA的序列特点的序列特点 DD-PCR示意图示意图箭头所示为特异扩增产物箭头所示为特异扩增产物 一、多重一、多重PCR (multiplex PCR)PCR (multiplex PCR)： 在一个反应体系中使用一对

36、以上引物的在一个反应体系中使用一对以上引物的PCRPCR称为多重称为多重PCRPCR。其结果。其结果是产生多个是产生多个PCRPCR产物，用于检测特定基因序列的存在或缺失。产物，用于检测特定基因序列的存在或缺失。第五节第五节 PCRPCR产生的产生的DNADNA指纹指纹二、随机扩增多态性二、随机扩增多态性DNA (random amplified polymorphic DNA, RAPD)： 在高等真核生物庞大基因组背景下，引物长度缩短到一定程度以后，在高等真核生物庞大基因组背景下，引物长度缩短到一定程度以后，单一引物就可以扩增出多个单一引物就可以扩增出多个PCRPCR产物。产物。RAPDR

37、APD引物一般为引物一般为10-11nt10-11nt。 Electrophoresis in an agarose gel= oligo 10 base primer1 2 3三、扩增片段长度多态性三、扩增片段长度多态性 (amplified fragment polymorphism, AFLP)：将高等真核生物基因组将高等真核生物基因组DNADNA酶切，连接接头，然后进行选择性酶切，连接接头，然后进行选择性PCRPCR扩增。扩增。Genomic DNA5 - AATTC T - 3 3 - G AAT - 5Ligate adapters + Ligase5 - CTCGTAGACTGC

38、GTACCAATTC TTACTCAGGACTCAT - 3 3 - CATCTGACGCATGGTTAAG AATGAGTCCTGAGTAGCAG - 5EcoRI adapterMseI adapterAmplication(+n) AATGAGTCCTGAGTAGCAG MseI primerPreamplificationEcoRI and MseI5 - CTCGTAGACTGCGTACCAATTC TTACTCAGGACTCAT - 3 3 - CATCTGACGCATGGTTAAG AATGAGTCCTGAGTAGCAG - 5(+1 to +3) AATGAGTCCTGAGTA

39、GCAGMseI primer5 - CTCGTAGACTGCGTACCAATTC TTACTCAGGACTCAT - 3 3 - CATCTGACGCATGGTTAAG AATGAGTCCTGAGTAGCAG - 5 EcoRI primer GACTGCGTACCAATT (+1 to +3)No selective bases= No PCR products= label primer EcoRI primer GACTGCGTACCAATT (+n)PCR与模板定量与模板定量：PCR最终产物是其模板一定程度的放最终产物是其模板一定程度的放大，因此大，因此PCR产物的量可以间接反映初始

40、模板的量。但正因产物的量可以间接反映初始模板的量。但正因为为PCR是对初始模板的指数式扩增，如果不同样品之间在扩是对初始模板的指数式扩增，如果不同样品之间在扩增中偏离指数的程度稍有不同，用增中偏离指数的程度稍有不同，用PCR产物来反映初始模板产物来反映初始模板丰度就会有很大的误差。丰度就会有很大的误差。通过特定设计的通过特定设计的PCR仪器来实时检测仪器来实时检测PCR扩增过程中每扩增过程中每一轮产物的累积数量，可以很好地推算初始模板丰度，这种一轮产物的累积数量，可以很好地推算初始模板丰度，这种工作方式叫做实时定量工作方式叫做实时定量PCR (real-time PCR)。第六节第六节 实时荧

41、光定量实时荧光定量PCR一、实时荧光定量一、实时荧光定量PCR的定量方式的定量方式RT-qPCR仪同时进行仪同时进行PCR扩增和荧光检测，监测动态变扩增和荧光检测，监测动态变化。化。阈值阈值(threshold)：荧光信号由本底进入指数增长阶段的：荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的荧光强度值。拐点所对应的荧光强度值。Ct值：荧光信号达到阈值所对应的值：荧光信号达到阈值所对应的PCR循环数，它具有循环数，它具有极好的重复性。极好的重复性。基线：从第基线：从第3个循环起到个循环起到Ct值前值前3个循环止，其终点要根个循环止，其终点要根据每次实验的具体数据调整，一般以据每次实验的具体数据调整，一般以3-15之间。之间。Ct值是一个完全客观的参数，通