葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶共固定化

1、葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶的共固定化摘要：酶的共固定化是在原有的单酶固定化技术的基础上,将单酶体系改为双酶或多酶体系,或将酶同辅酶及其他与酶有相互作用的活性物质共同固定化在同一介质中形成偶联反应体系的过程。因为要兼顾不同酶的不同最适pH值、最适温度、共固定比例以及固定化次序等问题,所以酶的共固定相对单酶固定化要复杂得多。葡萄糖氧化酶(GOX)和辣根过氧化物酶(HRP)是常用的两种酶，前者多提取自黑曲霉发酵产物，而后者则来自天然植物辣根，两种酶在很多领域都有极为广泛的应用。本文主要概述这两种酶的共固定化方法及对共固定化酶(HRP是主酶,GOX提供H2O2是辅助酶)催化苯甲硫醚不对称氧化成苯甲亚

2、砜的反应的应用。酶的共固定化酶催化反应具有专一性强、效率高、作用条件温和等特点，因而在生物技术、生物医学，医药化工，食品等行业具有广泛的应用价值。然而，酶制剂由于造价昂贵，将其以游离酶的形式用于生产过程，存在稳定性差，难以回收利用，产物分离难度高等缺点，天然游离酶已经越来越不能胜任规模化生产的要求，也难以同传统化工和发酵产业相抗衡。酶的固定化不仅可以解决酶的回收，下游产物污染问题，还可以提高酶的稳定性，并在一定程度上加强了酶对高温，酸，碱乃至有机溶剂等条件的承受能力，拓宽了酶的应用范围，增强了酶的应用价值。葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶(Glucoseoxidase，GOX)，属氧化还原酶类，产自真

3、菌和某些昆虫（如蜜蜂）。葡萄糖氧化酶分子量为160kDa，由两个亚基构成，每个亚基的分子量为80kDa，并且，每个亚基的上分别通过非共价键结合着一分子的辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）。辅酶FAD在酶反应过程中起着电子传递体的作用。葡萄糖氧化酶的等电点（PI）为4.2，能选择性地在有分子氧的条件下，将-D-葡萄糖氧化为1,5-葡萄糖酸内酯和过氧化氢，产物过氧化氢的积累，会对GOX的活性起到产物抑制作用。所以要保持GOX的活性，往往需要及时地去除或者消耗掉产生的过氧化氢。辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidase,HRP,E.C.11.1.1.7）是一种植物过氧化物

4、酶，提取自常年生香草植物辣根（Horseradish）。辣根，又名西洋葵菜，作为一种香料作物在世界各地温和地区都有种植，来源非常广泛。所以，辣根过氧化物酶也是来源最为广泛，价格相对低廉的酶制剂。辣根过氧化物酶（HRP）在过氧化氢（或其他过氧化物）存在下，能通过一个二质子二电子过程催化芳香族化合物，酚类化合物，吲哚，胺类和磺酸盐等还原性底物的氧化，其中AH是即还原性底物，·A为自由基。在HRP催化反应中，自由基的形成暗示了HRP在植物胞内中可能所起的作用。这些功能可能包括一些交联反应，如：酪氨酸交联形成双酪氨酸，交联酚类单体形成软木脂，氧化偶合酚类化合物等。当遇到一些外部因素时，过氧化

5、物酶的交联反应就有可能启动，如：植物组织受到创伤。当失水或有病原体入侵时，此类植物就会合成一种保护性的聚合物屏障来减少伤害，如：软木脂等。作为过氧化物酶典型代表，HRP经常被用于研究过氧化物酶分子的结构、动力学和热力学性质，更是被广泛应用于有机合成、生物转化、相关酶检测、发光检测、免疫测定、废水处理、临床化学、环境化学和食品工业等领域，目前针对其在各个领域的生物传感器的研究更是为我们展现出其广阔的应用前景。葡萄糖氧化酶（GOX）和辣根过氧化物酶（HRP）共固定葡萄糖氧化酶（GOX）和辣根过氧化物酶（HRP）共固定是最常见的共固定化体系，葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶最适pH范围相近，同为糖蛋白，

6、含糖量也相近，它们存在着如图1所示的反应偶联关系：葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶都是糖蛋白，其丰富的糖基，会在室温下与异氰酸基团发生如上所示的反应，将酶共价结合于聚氨酯泡沫上；反应体系中的水与异氰酸基团反应生成CO2气体，使得聚合物形成多孔海绵状。该反应极适合糖基化酶的固定。在此双酶共固定体系中，葡萄糖氧化酶充当的是原位，H2O2供体的角色，通过添加葡萄糖替代直接添加H2O2，以消除H2O2局部浓度过高导致的辣根过氧化物酶失活的弊端。因此，在双酶系统中，辣根过氧化物酶是主体，因此，选定HRP的浓度不变，通过改变GOX的量来找到能使HRP达到最大酶活，从而为进一步的固定化研究提供依据。实验显示当活

7、力比为1的时候，HRP只表现出了部分活性，这可能是GOX产生H2O2不能及时扩散到HRP表面；随着比值的增加，HRP表现出越来越高的活性，在HRP显然，在活力比为2.5的时候，HRP能发挥出最大活力；然而超过3以后，酶活性反而出现了一定程度的下降，这应该是过高的H2O2浓度开始在一定程度上影响了酶活性。葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶共固定化的应用共固定化GOD和HRP主要应用于生物传感器。GOD分别和多种过氧化物酶共固定于聚氨酯泡沫上催化手性物质合成的研究表明，这些体系通过GOD氧化葡萄糖产生H2O2为过氧化物酶提供氧化剂，原位氧化模式使得过氧化物酶不易失活，比起原有的流加模式，设备简单且易于操

8、作，还可实现连续化操作，这为HRP在这方面的应用也提供了借鉴。手性亚砜是一类重要化合物，主要有以下几种用途： 可以作为手性辅剂和中间体用于合成复杂的手性天然产物； 作为手性配体或手性催化剂用于多种不对称催化反应； 作为手性药物用于治疗胃溃疡的质子泵抑制剂等。目前合成手性亚砜的主要方法为酶法手性合成和化学法不对称催化。化学法合成因为往往需要加入昂贵的手性诱导剂或其他难以回收的活性物质，且催化速率较低，所以仍然存在很多弊端。酶催化手性合成具有作用条件温和，催化效率高，不需要添加手性诱导剂等特点，相对化学方法更为环保，但是以游离酶为催化剂，酶易失活，不易回收，无法应用于生产。固定化酶就可以很好的解决

9、这个问题。辣根过氧化物酶可以催化芳基烷基硫醚氧化为对应得亚砜，单一固定化辣根过氧化物酶催化氧化亚砜化反应需要以过氧化氢为氧化剂，但是辣根过氧化物酶对过氧化氢浓度极其敏感，高浓度的过氧化氢会将其氧化成没有催化活性的中间态；此外，过氧化氢的腐蚀性，使得其存储和运输比较麻烦。采用双酶共固定技术，首先，可以通过控制双酶比例，通过加入葡萄糖来代替过氧化氢，双酶偶联作用可以保持反应体系中比较稳定的过氧化氢浓度，保持了酶的活性和手性选择性；其次，固定化系统为酶在有机相中反应提供了可能，可以解决作为底物的硫醚难溶于水相的问题；第三，固定化酶可以反复使用，为实现规模生产提供可能。综上所述，本实验关于共固定葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶催化手性亚砜的合成的研究，不论对于双酶共固定技术的进一步探索还是实现酶法催化手性物质合成的实际应用，都有非常重要的意义。参考文献：1. 陈培策，葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶共固定化催化手性苯甲亚砜的合成研究，浙江工业大学硕士论文，2.2.3 2.叶鹏 , 张剑波 , 陈嵩 , 等 . 固定化辣根过氧化物酶催化去除五氯酚 J . 北京大学学报 , 2005, 41( 6) : 9183. 陈培策 , 张朝晖 , 谢雪凤，共固定化辣根过氧化物酶的最新研究进展，材料导报·综述篇，2010.5.24（5）：75-774. 洪伟杰 , 张朝晖 , 芦国营