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文档简介

1、慢病毒包装零碎简介及利用 之杨若古兰创作 一、慢病毒包装简介及其用处慢病毒(Lentivirus )载体是以HIV-1 (人类免疫缺陷I型 病毒)为基础发展起来的基因医治载体.区别普通的逆转录病毒载体,它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力.慢病毒载体的研讨发展得很快,研讨的也非常深入.该载体可以将外源基因无效地整合到宿主染色体上,从而达到持久 性表达.在感染能力方面可无效地感染神经元细胞、肝细 胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多品种型 的细胞,从而达到良好的的基因医治后果,在美国曾经开 展了临床研讨,后果非常理想,是以具有广阔的利用前景.目前慢病毒也被广泛地利用于表达RNAi的研讨

2、中.因为有些类型细胞脂质体转染后果差,转移到细胞内的siRNA半衰期短,体外合成siRNA对基因表达的按捺感化通常是短 暂的,因此使其利用受到较大的限制.采取事先在体外构建能够表达siRNA的载体,然后转移到细胞内转录siRNA的计谋,不单使脂质体无效转染的细胞品种添加,而且对基 因表达按捺后果也不减色于体外合成siRNA ,在持久波动表达载体的细胞中,甚至可以发挥持久阻断基因表达的感 化.在所构建的siRNA表达载体中,是由 RNA聚合酶田启 动子来指点RNA合成的,这是因为 RNA聚合酶田有明确的起始和终止序列,而且合成的RNA不会带poly A尾.当RNA聚合酶田碰到连续 4个或5个T时

3、,它指点的转录就 会停止,在转录产品 3,端构成14个U . U6和H1 RNA启 动子是两种RNA聚合酶田依附的启动子,具特点是启动子 本身元素均位于转录区的上游,适合于表达21ntRNA和50ntRNA茎环结构(stem loop ).在siRNA表达载体 中,构成siRNA的公理与反义链,可由各自的启动子分别 转录,然后两条链互补结合构成siRNA ;也可由载体直接表达小发卡状 RNA(small hairpin RNA, shRNA),载体包含位 于RNA聚合酶ID启动子和 45 T转录终止位点之间的茎 环结构序列,转录后即可折叠成具有14个U 3 ,突生端的茎环结构,在细胞内进一步加

4、工成siRNA .构建载体前通常要通过合成siRNA的方法,寻觅高效的 siRNA ,然后从中 挑选符合载体请求的序列,将其引入siRNA表达载体.慢病毒载体(Lentiviral vector )较逆转录病毒载体有更广的 宿主范围,慢病毒能够无效感染非周期性和有丝分裂后的 细胞.慢病毒载体能够发生表达 shRNA的高滴度的慢病毒, 在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵和分化的后代 细胞中表达shRNA ,实此刻多品种型的细胞和转基因小鼠 中特异而波动的基因表达的功能性沉默,为在原代的人和 动物细胞组织中快速而高效地研讨基因功能,和发生特定 基因表达降低的动物提供了可能性.慢病毒表达载体包含

5、了包装、转染、波动整合所须要的遗 传信息.慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所须要的所有辅助蛋白.为发生高滴度的病毒颗粒,须要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞, 在细胞中进行病毒的包装,包装好的假病毒颗粒分泌到细 胞外的培养基中,离心取得上清液后,可以直接用于宿主 细胞的感染,目的基因进入到宿主细胞以后,经过反转 录,整合到基因组,从而高水平的表达效应分子二、这一零碎的目的,主如果为了解决以下成绩:1 .对于一些较难转染的细胞,如原代细胞、干细胞、不分化 的细胞等,能大大提高目的基因转导效力,而且目的基因 整合到宿主细胞基因组的几率大大添加,这就为RNAi ,cD

6、NA克隆和陈述基因的研讨提供了一个有益的途径2 .进行稳转细胞株的筛选;3 .为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液;在细胞相干的实验操纵中,对于一些按惯例方法难以转染 甚至没法转染的细胞,通过病毒介导的实验能够大大提高 基因的转导效力,以达到目的基因的高效瞬时表达 慢病毒载体(Lentiviral vector, LVs )是在 HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体零碎,它能高效的将目的基因(或RNAi )导入动物和人的原代细胞或细胞系.慢病毒载体基因组是正链RNA ,其基因组进入细胞后,在细胞浆中被其本 身携带的反转录酶反转为 DNA ,构成DNA整合前复合 体,进入细胞核后

7、,DNA整合到细胞基因组中.整合后的DNA转录mRNA ,回到细胞浆中,表达目的蛋白;或发生 RNAi干扰.慢病毒载体介导的基因表达或RNAi干扰感化持续且波动,缘由是目的基因整合到宿主细胞基因组中,并随细胞基因 组的分裂而分裂.另外,慢病毒载体能无效感染并整合到非 分裂细胞中.以上特性使慢病毒载体与其它病毒载体比拟, 比方不整合的腺病毒载体、整合率低的腺相干病毒载体、只整合分裂细胞的传统逆转录病毒载体,有光鲜的特色.大量文献研讨标明,慢病毒载体介导的目的基因持久表达的 组织或细胞包含脑、肝脏、肌肉、视网膜、造血干细胞、 骨髓间充质干细胞、巨噬细胞等 .慢病毒载体不表达任何 HIV-1蛋白,免

8、疫原性低,在打针 部位无细胞免疫反应,体液免疫反应也较低,不影响病毒 载体的第2次打针.1.构建道理慢病毒属于逆转录病毒科,但其基因组结构复杂,除gag、pol和env这3个和单纯逆转录病毒类似的结构基因外,还 包含4个辅助基因,vif、vpr、nef、vpu和2个调节基因tat和rev . HIV 21是慢病毒中最具特征性的病毒,第一个慢病 毒载体零碎即以此病毒为基础进行构建的.慢病毒载体的构建道理就是将HIV 21基因组中的顺式感化元件(如包装旌旗灯号、长末端反复序列)和编码反式感化蛋白的序列进行分离.载体零碎包含包装成分和载体成分:包装成分由HIV21基因组去除了包装、逆转录和整合所需的

9、顺式感化序列 而构建,能反式提供发生病毒颗粒所需的蛋白;载体成分 与包装成分互补,含有包装、逆转录和整合所需的HIV 21顺式感化序列.同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及 在此位点拔生的目的基因.为降低两种成分同源重组发生有复制能力的病毒(RCV )的可能性,将包装成分的5 ' LTR换成巨细胞病毒(CMV )立即初期启动子,3 ' LTR SV成40 polyA位点等.将包装成分分别构建在两个质粒上,即一 个表达gag和pol、另一个表达 env根据这个道理,Naldini 和Kafri等构建了三质粒表达零碎.2 .三质粒表达零碎三质粒表达零碎包含包装质粒、包膜蛋白质粒和

10、转移质粒.其中包装质粒在 CMV启动子的控制下,表达 HIV 21复制 所需的全部反式激活蛋白,但不发生病毒包膜蛋白及辅助 蛋白vpu;包膜蛋白质粒编码水泡性口炎病毒G蛋白(V SV2G),利用VSV 2G包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的 靶细胞嗜性范围,而且添加了载体的波动性,答应通过高 速离心对载体进行浓缩,提高了滴度;转移质粒中除含有包装、逆转录及整合所需的顺式序列,还保存 350 bp的gag 和RRE,并在其中拔生目的基因或标记基因(绿色荧光蛋白GFP).将载体零碎分成三个质粒最大的好处是使序列堆叠的 机会大大减少,减少载体重组过程中发生RCV的可能性.通过三质粒共转染293T细胞,超速离心后病毒滴度可达 109IU /m l .3 .四质粒表达零碎为了减少HIV 21包装结构的序列同源性,进一步减少重构 成RCV的可能性,Dull等人将辅助基因去除.但因为gag2pol 的转运须要rev,是以,在上述的三质粒零碎的基础上,构 建成四质粒表达零碎,该零碎加上含rev的质粒减少了发生RCV的可能性,而且对非分裂期细胞转导效力无影响.1 .将目的基因/RNAi基因转入难以转染的细胞,比方神经元细胞、干细

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