本科毕业论文撰写参考格式

1、安徽医科大学本科毕业论文申请学位类别： 理学学士学位 安 徽 医 科 大 学ANHUI MEDICAL UNIVERSITY本 科 毕 业 论文重组猪干扰素工程菌发酵过程中质粒稳定性研究Restructuring the pig interferon engineering bacterium fermentation plasmid stability study学 生 姓 名： 汪利文 学 号： 121060015 所属院系专业： 生命科学学院生物技术 论文实习单位：安徽医科大学教研室提交论文日期： 论文答辩日期： 指 导 教 师: 职称 单位 职称 单位 五号宋体 2013年5月（小四号

2、，中文宋体，居中）15目 录（小二黑体）中英文词汇对照表1中文摘要.2英文摘要.31 前言 .42 材料与方法.52.1 实验材料.62.2 实验方法.103 实验结果.184 讨论.205 结论.216 参考文献.22附录：致谢 24中英文词汇对照表（小二黑体）英文缩写 英文全名中文全名E.coliEscherichia coli大肠杆菌Ampampicillin氨苄青霉素LBluria-Bertani mediumLB 培养基IPTGisopropylthio-D-galactoside异丙基硫代-D-半乳糖苷ODoptical density光密度PBSphosphate buffer

3、saline磷酸盐缓冲液TAEGelSafe核酸燃料SDSsodium dodecyl sulphate十二烷基磺酸钠APSammonium Persulfate过硫酸铵PAGEPolyacrylamide gel electrophoresis聚丙烯酰胺电泳TEMEDtetramethyl ethylene diamine四甲基乙二胺EDTAethylene diaminetetra-acetic acid乙二胺四乙酸重组猪干扰素工程菌发酵过程中质粒稳定性研究 中文摘要目的 检测重组猪干扰素工程菌发酵过程中质粒的稳定性，并设计发酵工艺提高质粒的稳定性，以满足工业化生产需求。方法 通过四区划线

4、挑单菌落连续传代至20代检测重组猪干扰素工程菌质粒的结构稳定性，采用摇床观察不同培养基，诱导剂，诱导温度对质粒分裂稳定性的影响。结果 该工程菌质粒具有分裂不稳定性和结构稳定性。当外源蛋白表达时，便会出现分裂不稳定性，且蛋白表达量越高，质粒丢失率情况越严重。采用LB培养基，质粒丢失率为95%，采用改良LB培养基质粒丢失率为51.5%；使用IPTG为诱导剂，质粒丢失率为97.91%，使用乳糖为诱导剂，质粒丢失率为30.8%；改变诱导温度，分别以32，28，24诱导，测得丢失率分别为结论 关键词 重组猪干扰素工程菌 发酵 质粒稳定性Construction of prokayotic express

5、ion plasmid and prokayotic expression of Sm29 gene of Schistosoma mansoni（小二号Times New Roman粗体）Abstract（小二号Times New Roman粗体）Objective: To explore the value of anti-rSj29 monoclonal antibody on detection of rSm29.Methods: A couple of primers were designed according to the known sequence of Schistoso

6、ma mansoni Sm29 and the Sm29 gene was synthesized in vitro. Results: The specific fragment of Sm29 was amplified and the recombinant prokaryotic expression plasmid pET28a-Sm29 was successfully constructed. Conclusion: There is no value of . （以上为：小四号Times New Roman）Key words Schistosoma mansoni / mem

7、brane protein / prokayotic expression 重组猪干扰素工程菌质粒稳定性的研究（小二号黑体）1 前言（一级标题，四号黑体，下同）2 材料与方法2.1 实验材料（二级、三级标题，小四号黑体，下同）2.1.1 菌株大肠埃希菌(E.coli)菌株 表达质粒 pET32a 。2.1.2 主要实验试剂 蛋白胨，酵母粉，甘油，NaCl，PBS，Na2HPO4·12H2O ，KH2PO4，MgSO4·7H2O，KCl ，琼脂，AMP，IPTG，-乳糖，50×TAE 电泳缓冲液，Tris，冰醋酸，EDTA (Na2EDTA2H2O)，10%SDS，

8、丙烯酰胺，N，N-亚甲双丙烯酰，10%过硫酸铵(APS)，1.5M Tris-HCl (PH8.8)，0.5 M Tris-HCl (PH6.8)，10%分离胶，5%浓缩胶，考马思亮蓝染液，脱色液，甲醇，冰乙酸，电泳缓冲液，甘氨酸，AXYGEN质粒抽提试剂盒，Xho1快切酶，EcoR1快切酶，GelSafe，DL 2000 DNA Marker，10x Q.cut.G.buffer。 2.1.3 部分试剂配制PBS (0.01M )NaCl Na2HPO4·12H2O KH2PO4KCl 去离子水加至1000ml。8.00g3.59g0.24g0.20gLB 液体培养基胰蛋白胨酵母提

9、取物 NaCl 1.0g0.5g1.0g去离子水加至100ml，用NaOH调PH值7.2-7.4之间，高温灭菌后储存于 4。LB 固体培养基在LB液体培养基基础上按每100ml加入1.5g琼脂，高温灭菌后备用。氨苄青霉素/卡那霉素(100mg/ml)1.0g溶于10ml去离子水中，0.22m滤器过滤，-20保存。 IPTG (100g/L)50ml H2O 加 5.0g IPTG ，用0.22m滤器过滤除菌，4保存。50×TAE 电泳缓冲液Tris冰醋酸EDTA (Na2EDTA2H2O)溶解加水至 1000ml。242.0g57.1ml37.2g 乳糖（100g/L）50ml H2

10、O 加 5.0g-乳糖，用0.22m滤器过滤除菌，4保存。10%SDS90ml 水溶 10.0g SDS，加热助溶(68)，定量至 100ml。2×蛋白上样缓冲液1M Tris-HCl(PH6.8)-巯基乙醇10%SDS 0.1%溴酚兰 甘油去离子水 1.0ml1.0ml4.0ml0.5ml2.0ml1.5ml30%丙烯酰胺溶液丙烯酰胺N，N-亚甲双丙烯酰29.0g1.0g去离子水加至 100 ml(37助溶)。10%过硫酸铵(APS)1.0g APS溶于10ml水中，4保存数周。1.5M Tris-HCl (PH8.8)Tris 18.16g溶于70ml水，调PH至8.8，用水补至

11、 100ml，4保存。0.5 M Tris-HCl (PH6.8)Tris 6.05g 溶于 70ml 水，调 PH 至 6.8，用水补至 100ml，4保存。12%分离胶(5ml)去离子水30%丙烯酰胺溶液1.5M Tris-HCl(PH8.8)10%SDS 10%过硫酸胺 TEMED 1.6ml2.0ml1.3ml0.05ml0.05ml0.002ml5%浓缩胶(2ml)去离子水 30%丙烯酰胺溶液 0.5 M Tris-HCl(PH6.8) 10%SDS10%过硫酸胺 TEMED1.4ml0.33ml0.25ml0.02ml0.02ml0.002ml考马思亮蓝染液0.25g 考马思亮蓝

12、R250 溶于 100ml 脱色液中，用 1 号 Whatman滤纸过滤后，室温保存。脱色液按甲醇:冰乙酸:水=45:10:45 比例配制，室温保存。SDS-PAGE 电泳缓冲液甘氨酸 Tris 10%SDS 去离子水加至 1000ml。18.8g3.02g10.0ml2.1.4 实验主要仪器LQG157A 台式高速离心机珠海黑马医学仪器有限公司凝胶成像系统天能科技（上海）有限公司UV-2102C 型紫外可见分光光度计尤尼柯(上海)仪器有限公司DK-8D 型电热恒温三孔水槽上海跃进医疗器械有限公司隔水式恒温培养箱上海一恒科技有限公司FA1104 电子天平上海精密科学仪器厂PHS-3D 精密数显

13、酸度计上海天达仪器有限公司TY-80R 脱色摇床江苏金坛市医疗器械厂WD-9405B 型水平摇床北京六一仪器厂微波炉格兰仕电器公司电泳仪 BIO-RAD公司U410-86 超低温冰箱NBSC 公司普通冰箱合肥美菱冰箱厂SW-CJ-IB型单人单面净化工作台苏州净化设备有限公司纯水机艾科浦公司HVE-50高压锅Hirayama公司CXG-1电脑恒温层析柜上海沪西分析仪器厂有限公司HJ-2双头磁力加热搅拌器金坛市杰瑞尔电器有限公司Trans-Blot SD半干转膜仪BIO-RAD公司制冰机SANYO公司4500SF全自动数码凝胶化学发光图像分析系统天能科技（上海）有限公司DNP-9162电热恒温培养

14、箱上海三发科学仪器有限公司高压均质机ATS工业系统有限公司2.2 实验方法2.2.1 Sm29基因原核表达重组质粒的构建和鉴定2.2.1.1 细菌的培养及阳性克隆的挑选保存1）无菌操作台中，取实验室冻存的已测序鉴定过的菌种pUC57-Sm29XL1-Blue一支，融化后用接种环沾取少量菌液；2）另取实验室冻存的pET28aXL1-blue空表达载体一支，3）做好标记，将两块平皿置于37恒温培养箱中倒置培养12-16个小时；4）无菌操作台中，分别挑取单个菌落，接种到；5）留菌种：无菌操作；2.2.1.2 质粒的制备将留菌种后剩余菌液全部用于质粒制备，具体操作步骤按生工生物 (上海)有限公司质粒小

15、提试剂盒操作说明进行。2.2.1.3 质粒DNA的限制性内切酶酶切鉴定1）双酶切：用EcoR和Xho同时双酶切重组pUC57-Sm29载体和空表达载体pET28a，37水浴2h；酶切体系（L)：pUC57-Sm29pET28aplasmid6610×H buffer11EcoR I0.50.5Xho I0.50.5ddH2O22总体积10102） 琼脂糖凝胶电泳（1%琼脂糖凝胶）：分别将酶切产物与2 L 6×loading buffer充分混合，开始上样，上样顺序为： pET28a酶切产物，pUC57-Sm29酶切产物，DNA marker DL2000。90V电泳30mi

16、n；3）小心将胶取出并快速于紫外灯下观察、拍照；2.2.1.4 DNA片段的回收1）将酶切鉴定结果正确的重组pUC57-Sm29载体和空表达载体pET28a质粒用EcoR和Xho同时进行双酶切，37水浴2h；酶切体系（L)：pUC57-Sm29pET28aplasmid121210×H buffer22EcoR I11Xho I11ddH2O44总体积20202） 琼脂糖凝胶电泳（1%琼脂糖凝胶）：分别将酶切产物与4L 6×loading buffer充分混合，开始上样，上样顺序为： pET28a酶切产物，pUC57-Sm29酶切产物，DNA marker DL2000。9

17、0V电泳30min；3）小心将胶取出并快速于紫外灯下观察；4） 将鉴定正确的片段进行胶回收，；5）将部分胶回收产物进行琼脂糖凝胶电泳（1%琼脂糖凝胶）鉴定，拍照；2.2.1.5 目的片段与表达载体的连接（DNA重组）将鉴定正确的胶回收产物部分用于连接：按6:2摩尔比将此二片段4连接过夜；连接体系（L)：Sm296pET28a2T4 ligase1T4 buffer1总体积102.2.1.6 CaCl2法制备XL1-BLue感受态细胞(BL21感受态细胞制备方法相同)2.2.1.7 连接产物转化至XL1-BLue感受态细胞扩增重组质粒2.2.1.8阳性克隆的挑选、鉴定及保存2.2.2 重组的Sm

18、29基因在大肠杆菌中的表达2.2.2.1重组表达质粒 pET28a-Sm29转化至感受态细胞BL21进行原核表达将鉴定正确的重组表达质粒 pET28a-Sm29 1µL转化至200µL BL21感受态细胞,转化步骤同前述；2.2.2.2 IPTG诱导表达蛋白1) SDS-PAGE12%凝胶配制，配方如下:。2.2.3 rSm29融合蛋白免疫印迹法(Western blotting)鉴定。2.2.3.2 半干转膜。2.2.3.3 封闭。2.2.3.4一抗孵育。2.2.3.5二抗孵育。2.2.3.5 化学发光(ECL)显色并拍照。3 实验结果3.1 Sm29基因克隆的酶切鉴定分

19、别将pET28a和pUC57-Sm29XLI-Blue阳性克隆进行双酶切(EcoR和Xho)鉴定。产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，分别得到，如图1所示。图 1 pET28a质粒和pUC57 -Sm29 重组质粒的双酶切鉴定1: pET28a质粒双酶切产物，2: pUC57 -Sm29 重组质粒双酶切产物， M:DL 2000 MarkerFig.1 restriction endonuclease analysis of pET28a plasmid and pUC57-Sm29 recombinant plasmid3.2 重组表达质粒 pET28a-Sm29的双酶切鉴定及蛋白表达pET28a

20、-Sm29重组质粒分别用EcoR、Xho双酶切鉴定，分别得到长约570bp的片段，其酶切图，如图3所示。图 2 重组表达质粒 pET28a-Sm29的双酶切鉴定1: pET28a-Sm29双酶切产物，M:DL 2000 MarkerFig.2 Identification of pET28a-Sm29 plasmid by restriction endonuclease analysis4 讨论4.1 曼氏血吸虫表膜rSm29 蛋白的表达及鉴定血吸虫的表皮曾被认为是无活力，只是有保护作用的“角皮”。但深入的研究发现，它是覆盖整个虫体的“合胞体”结构14,15。4.2 日本血吸虫膜蛋白 rSj

21、29 抗体检测价值的评估据报道日本血吸虫与曼氏血吸虫虫卵卵壳成分中氨基酸组成非常相似17，朱荫昌等18认为曼氏血吸虫与日本血吸虫虫卵抗原存在着共同抗原成分，他们的研究结果显示日本血吸虫的虫卵抗原用于检测曼氏血吸虫病同样具有很高的敏感性和特异性。通过Blast基因序列对比，我们发现。5 结论。6 参考文献1 陈名刚. 世界血吸虫病流行情况及防治进展. 中国血吸虫病防治杂志，2002；14(2):81-83.2 Fernanda CC, Gilson CM, Elisandra G, Gregory TK, Vitor LM, Alan LM, Marcelo VC, Giulliana TA,

22、Thiago MV, Sergio VA, Sergio CO. Schistosoma mansoni Tegument Protein Sm29 Is Able to Induce a Th1-Type of Immune Response and Protection against Parasite Infection. PLOS Neglected Tropical Diseases, 2008; 2: e308.3 Ismail M, Botros S, Metwally A, William S, Farghally A, Tao LF, Day TA, Bennett JL.

23、Resistance to praziquantel: direct evidence from Schistosoma mansoni isolated from Egyptian villagers. Am J Trop Hyg, 1999; 60(6): 932-935.4 Sturrock RF, Butterworth AE, Houba V, Karamsadkar SD, Kimani R. Schistosoma mansoni in the Kenyan baboon (Papio anubis): the development and pridictability of

24、resistance to homologous challenge. Trans R Soc Trop Med Hyg, 1978; 72(3): 251-261.5 Chitsalo L, Engel D, Moutresor A, Savioli L. The global status of Schistosomiasis and its control. Acta Tropica, 2000; 77:41-51.6 Bergquist NR. Present aspects of immunodiagnosis of Schistosomiasis. Mem Inst Oswaldo

25、 Cruz, 1992; 87(Suppl 4):29-38.7 De Jonge N, Kremsner PG, Krijger FW, Schommer G, Fillié YE, Kornelis D, van Zeyl RJ, van Dam GJ, Feldmeier H, Deelder AM. Detection of the Schistosomiasis circulating cathodic antigen by enzyme immunoassay using biotinylated monoclonel antibodies. Trans R Soc Tr

26、op Med Hyg, 1990; 84(6):815-818.8 Oliveira EJ, Kanamura HY, Lima DM. Efficancy of an enzyme-linked immunosorbent assay as a diagnosis tool for Schistosomiasis mansoni in individuals with low worm burden. Mem Inst Oswaldo Cruz, 2005; 100(4):421-425.9 李雍龙. 人体寄生虫学. 人民卫生出版社，2004:124.10 吴桂兰, 吴小兰, 石佑恩. 血吸

27、虫循环抗原及检测研究进展. 湖北预防医学杂志，1995；6(1):51-54.11 查任远, 沈继龙, 汪学龙. 抗rSj142323单克隆抗体检测循环抗原及疗效考核价值的初步研究. 安徽医科大学学报，2004；39(3):204-207.12 任翠平, 刘淼, 赵志荣, 雷黎, 朱绍春, 王晓楠, 沈际佳. 日本血吸虫29000膜外蛋白的表达和纯化及功能初步鉴定. 中华检验医学杂志，2008；6:685-686.13 Cardoso FC, Pacífico RNA, Mortar RA, Oliveirab SC. Human antibody responses of patients living in endemic areas for schistosomiasis to the tegumental protein Sm29 i