Anza限制酶克隆系统简化了定向克隆-ThermoFisherScientific

1、Invitrogen? Champion? pET302/NT-His白皮书 Anza限制酶克隆系统Anza限制酶克隆系统简化了定向克隆摘要尽管分子克隆近年来有诸多发展，但使用限制性内切酶 (REases) 和其他DNA修饰酶的传统克隆仍然是用于处理和扩增目的 DNA片段和质粒的最常用方法。Invitrogen? Anza? 限制酶克隆系统提供了128种限制酶和 5种DNA修饰酶，采用独特的统一缓冲液以及快速、方便使用的实验方案，进一步简化了传统克隆实验流程。我们在此介绍了Anza限制酶克隆系统的特点，以及如何使用 Anza组分将Emerald绿色荧光蛋白 (emGFP) 定向克隆至载体中。我

2、们的结果证明了Anza系统的简便、快速和高效，并提供了将这些新型试剂整合至标准克隆流程的最佳方法范例 。简介在过去 40年中，限制性内切酶和 DNA修饰酶已成为标准重组DNA技术“工具盒”的重要组成部分。利用这些酶可以将 DNA 分子连入质粒 ，用于载体构建、基因克隆和蛋白表达实验。要获得最佳克隆效率，必须精心制备载体和插入片段用于连接和转化。在传统克隆中，使用一种或两种内切酶酶切质粒 ，生成可以靶向连接插入片段的末端，完成载体制备 。DNA末端可以是平末端，一般适用于不注重插入片段方向的情况 ，例如，当生成克隆用于测序时 (请登录 thermo? ，查阅Anza限制酶克隆系统白皮书中的平末端

3、克隆)；也可以是粘性末端，带有3'-或5'-突出端，具体取决于所使用的限制酶。定向克隆需要特定方向地连接插入片段，应使用两种限制酶生成不配对的末端 。此外，还可以使用碱性磷酸酶处理载体 ，去除5'-磷酸基团。载体去磷酸化可以防止切割片段的再连接，减少转化过程中的载体背景。通常使用含有与制备载体末端配对的酶切位点引物对目标 DNA 序列进行 PCR扩增，完成插入片段的制备，用于定向克隆。使用 T4 DNA连接酶将插入片段与载体序列相连接 ，完成克隆，在ATP存在的条件下，T4 DNA连接酶催化了带有3羟基和5磷酸基的双链DNA之间磷酸二脂键的形成 。不幸的是，由于限制酶的

4、非特异性剪切 (星号活性 )、不兼容的缓冲液或多酶切温度、以及较长的酶切反应时间，其功能存在诸多限制。使用多种内切酶同时进行酶切使用的缓冲液可能对其中一种或多种限制酶效果不佳，导致剪切效率较低。其通常的解决方法是在最佳缓冲液中进行连续酶切 ，但这增加了样品制备的时间，并会造成样品损失。下文介绍了Anza系统的优点，并举例说明如何使用这些内切酶和DNA修饰酶将 emGFP基因定向克隆至Champion pET302/NT-His载体中。Anza 限制酶Invitrogen? Anza? 限制酶是 Invitrogen最先进的限制酶系统 。该酶附带统一缓冲液，可用于多种限制酶同时酶切，只需15分钟

5、，即便是过夜酶切，亦无星号活性。Anza限制酶只需采用一种简单的酶切实验方案，与DNA底物 (如质粒、PCR产物、基因组DNA和lambda DNA) 无关。独特的Invitrogen? Anza?统一缓冲液还包含了一种新型示踪染料，可以将酶切后样品直接上样至凝胶进行电泳，且适用于大部分下游实验。Anza 碱性磷酸酶Invitrogen? Anza? 碱性磷酸酶 (货号：IVGN2208) 可与Anza缓冲液完全兼容，用于去除Anza限制性酶切后残留的5'-磷酸基团，例如，在插入片段连接前进行载体去磷酸化 。使用Anza碱性磷酸酶处理载体可以防止载体自身连接和重新环化 ，从而降低了克隆

6、时的载体背景。ANZA ICONS / No thermal inactivationRequestor:Sapna PadmanabhanAnza T4 DNA 连接酶预混液Invitrogen? Anza? T4 DNA连接酶采用 4X浓缩预混液配方 (货DTTDamDcmCpGDamDcm号IVGN2108)可用于连接带有粘性末端和平末端的片段DcmCpGDamDNADcm ，DTT：Dam，Methylation sensitivityMethylation sensitivityMethylation sensitivityOverlapping methylationOverlap

7、ping methylation并修复带有3'-羟基和5'-磷酸末端的双链缺口 可在水、 、DNA。TE80洗°脱20缓冲液37或° 15缓冲液中进行DNA连接1X AnzaAP。APAPThermalDigestion1 Step RE-AP2 Step - Heat2 Step - Columninactivationpurication材料与方法AP实验评估了使用 Anza限制酶克隆系统将目的基因定向克隆至No thermalinactivationoption 5质粒载体的简单克隆流程 。克隆流程如图 1所示 。插入片段制备使用 Thermo Sci

8、enti?c? Phusion 高保真 PCR预混液 (货号：F-531S)，使用含有所选择内切酶位点的引物对从Invitrogen?pJTI? R4 Exp CMV EmGFP pA载体 货号：A14146)扩增(。使用Invitrogen? PureLink?快速Emerald GFP (emGFP)凝胶回收和PCR纯化两用试剂盒 货号：K2200-01)对1%琼(脂糖凝胶上的各PCR产物进行凝胶纯化。采用ThermoTAEScienti?c? NanoDrop?分光光度计测量 DNA浓度，使用所选的限制酶 各，在缓冲液体系中酶Anza(1 l) 20 L 1X Anza切 200 ng的

9、各种 PCR产物，37°C酶切 15分钟 。然后 80°C加热 20分钟将酶灭活 。载体制备使用所选的 Anza限制酶 (各1 l)对500 ng Champion pET302/CpGNT-His载体 (货号：K6302-03) 进行酶切 。此外，使用Anza一CpGOverlapping methylation步法去磷酸化实验方案处理此 500 ng载体，在20 L 1X Anza 缓冲液中酶切载体 ，同时使用 1 L Anza碱性磷酸酶进行去磷酸化，37°C孵育15 分钟。然后 80°C加热20分钟将酶灭活 。Anza DNA 连接实验方案使用 A

10、nza T4 DNA 连接酶预混液处理经酶切和去磷酸化的载体 (每个反应 10 ng) ，检验载体自身连接 。 将去磷酸化的载体与制备好的插入片段以 1:3摩尔比混合 ，然后使用 Anza T4 DNA连接酶预混液连接 。 20 L反应体系 ，室温孵育 15分钟后，将反应物置于冰上 。在1% agarose TAE 凝胶上分析连接产物 。转化和插入片段验证使用标准的推荐实验方案，将2各连接反应物 包含1 ngL(线性化载体 ) 转化至 Invitrogen? One Shot? TOP10化学感受态大肠杆菌 货号：C4040-03)中复苏 小时后，(。 37°C1将100各转化产物接

11、种至含有100氨苄青霉素的LBL g/mL琼脂板上 。同时转化超螺旋的 pUC19 和 pET302/NT-His 载体作为阳性对照 。 37°C过夜孵育后 ，计数各个培养板中的菌5'3'酶切加热灭活5' P3'3'5'3'P 5'emGFP扩增片段15 分钟,37°C20 分钟,80°C(0.7 kb ；Phusion 高保真 PCR预混液 )连接5'15 分钟,25 °C3'酶切 +加热灭活去磷酸化5'15 分钟,37°C20分钟,80°C3&

12、#39;pET302/NT-His 载体一步法(5.7 kb)连接前需 35分钟 (单管 )图1. 使用 Anza 限制酶克隆系统进行定向克隆的实验流程。 采用Phusion 高保真 PCR预混液扩增 emGFP 基因，然后凝胶纯化 ，然后按照标准实验方案 ，使用Anza限制酶进行双酶切处理 。同时使用Anza一步法实验方案对 pET302/NT-His 载体去磷酸化 。使用Anza T4 DNA 连接酶预混液连接经酶切生成的带有配对突出端的插入片段和载体，然后转化。落数，利用菌落 PCR筛选一定数量的菌落 ，进行插入片段转化和克隆效率验证。使用标准的T7启动子和T7反向引物，在25反应中采用

13、Anza限制酶克隆系统制备的载体和插入片段连接产物的转L利用Thermo Scienti?c? DreamTaq? Green PCR预混液(化效率可达 4.8 x 1056图至9.6 x 10。 3比较了载体-插入片段连接货号：K1081)对插入片段进行扩增。在水中4倍稀释PCR紫色与仅包含载体背景 灰色的转化效率 对于每个载体插()()。-产物，上样至Invitrogen? E-Gel? 48孔2%琼脂糖凝胶 货入片段连接反应 采用菌落筛选 个菌落 确定克隆效率(PCR。，12，号：G8008-02)上电泳观察。将生成约900 bp扩增片段的对于上述两种测试的Anza限制酶组合 超过90%

14、的筛选菌落包，样品标为阳性，空载体生成约220 bp的条带。计算每次反含插入片段 图 。( 4)应的转化效率(CFU/载体和克隆效率含有克隆插入gDNA)(片段的菌落百分比 )。讨论结果连接分析连接产物的凝胶电泳分析如图2所示 ，采用两个内切酶对制备 DNA片段：Anza 8 XhoI/Anza 15 XmaJI 和 Anza 12 XbaI/ Anza 8 XhoI 。未酶切样品 (U) 中可以观察到超螺旋和解旋环状 pET302/NT-His 质粒 。使用 Anza 限制酶对载体进行完全酶切，反应时间 15分钟，在泳道 1 (未使用 Anza 碱性磷酸酶 ) 和3 (使用 Anza碱性磷酸

15、酶 ) 观察到单条线性条带 。载体未去磷酸化，质粒可与短的剪切片段连接 ，形成载体多联体 ，如泳道 2所示 。 当采用 Anza一步法 DNA酶切和去磷酸化实验方案处理时 ，载体片段无法重新自连 ，仍保持线性形态 (如图 2中的泳道 4)。Anza T4 DNA 连接酶可以将去磷酸化的载体与经酶切生成的含有配对突出端的 emGFP 插入片段连接起来 ( 泳道 5)。Anza Xhol/XmaJlAnza Xbal/XholUM12345M12345MU图2. pET302/NT-His 载体和 emGFP 插入片段的酶切和连接产物。 泳道U：未酶切的Champion pET302/NT-His

16、 质粒；泳道M：Invitrogen? 1 Kb Plus DNA 分子量标准 (货号：10787018)；泳道1：使用指定的 Anza限制酶对进行双酶切的 pET302/NT-His 质粒；泳道2：使用Anza T4 DNA连接酶预混液处理的泳道 1的产物；泳道3：使用指定的Anza限制酶对和 Anza碱性磷酸酶，经一步法DNA酶切和去磷酸化实验方案进行双酶切并去磷酸化的 pET302/NT-His 质粒；泳道4：采用 Anza T4 DNA连接酶预混液处理的泳道 3的产物；泳道5：采用Anza T4 DNA连接酶预混液处理的泳道 3的产物和相应的 Anza酶酶切的 emGFP插入片段。上述

17、实验说明了如何评估使用 Anza限制酶克隆系统，利用定向克隆策略将 emGFP基因克隆至Champion pET302/NT-His 载体中。使用独特的 Anza统一缓冲液检测两种 Anza 限制酶组合，在15分钟反应内实现完全酶切 。即便使用两种不同的限制酶 ，未使用碱性磷酸酶处理的制备载体也可以自身连接 (图 2，泳道2样品 )；使用Anza T4 DNA连接酶预混液处理时，小的剪切片段可以重新插入载体内，并与较大的载体片段形成多联体。利用该方法制备的载体用于克隆会导致极高的背景，需要研究人员筛选大量的菌落 ，寻找一个含有目的片段的菌落。凝胶纯化是一种传统的解决方案 ，但延长了处理时间，会

18、导致样品损失 ，同时增加污染的几率 。因此，使用碱性磷酸酶处理是一种首选方法 ，采用Anza克隆系统可以在独特的Anza统一缓冲液中实现酶切和去磷酸化 。在大多数情况下，可以使用15分钟一步法 DNA酶切和去磷酸化实验方案 (如上文所示)，而其他供应商的产品推荐进行 15 60分钟酶切 (如果需要连续酶切，则时间更长)，然后还需要 30 60分钟进行去磷酸化 。若Anza一步法实验方案无法实现充足的去磷酸化 ，则Anza克隆系统可提供两步法 /加热灭活或两步法 /柱纯化实验方案 (详情请参见 Anza限制酶克隆系统用户指南 )。图2泳道3和4中的样品展示了一步法去磷酸化实验方案的效率 。Anz

19、a碱性磷酸酶不会影响酶切，且当使用 Anza T4 DNA连接酶预混液处理时载体也不会发生自连。使用定向克隆实验流程可以获得极佳的转化和克隆效率 (图3和4)。使用载体- 插入片段连接进行转化可以生成较载体背景约 9 至15倍的菌落落。利用菌落 PCR进行插入片段确认，验证了上述结果，从12个集落中筛选出了11或12个含有emGFP插入片段的菌落。图5比较了使用 Anza限制酶克隆系统与传统的定向克隆工作流程。使用传统的酶及不相容的缓冲液进行插入片段双酶切可能需要采用连续酶切及多次纯化步骤 ，而所有的 Anza限制酶均可独特的Anza统一缓冲液兼容，只需15分钟即可完全酶切 。使用传统的酶进行

20、载体制备可能也需要连续酶切 ，然后进行一小时使用限制酶克隆系统Transformation ef?cienciesAnzausing the Anza restriction进行定向克隆的转化效率enzyme cloning system for directional cloning一One步-法step去磷desphosphorylated酸化的pET302/NTpET302/NT-His-载His体vector一步法去磷酸化的载体与插入片段One-step desphosphorylatedpET302/NTpET302/NT-His-His vectoremGFPwithemGFP i

21、nsert1.00E+07y)cnA4.80E+06eiN率?D1.00E+06cDfre体o效载tnc化 goei转/tvg1.00E+05a UFm rC/o(fUsFnCa(1.00E+04rXbaI/XhoITXhoI/XmaJIAnza 限制酶对Anza restriction enzyme pairs图3. 使用 Anza 限制酶克隆系统制备的 pET302/NT-His 连接载体和 emGFP 插入片段的转化效率。Cloning ef?ciencies使用Anzausing限制酶克隆系统theAnzarestrictionenzyme cloning进行system定向克for隆

22、directional的克隆效率cloningCloning克隆效率ef?ciency(含有插(%入of片colonies段的集containing落%) insert)110%100%y90%cn80%eic70%?fe60%率 gni50%nol40%效隆克C30%20%10%0%XhoI/XmaJIXbaI/XhoIAnza 限制酶对Anza restriction enzyme pairs图4. 使用 Anza 限制酶克隆系统制备的 pET302/NT-His 连接载体与 emGFP插入片段连接的克隆效率。的去磷酸化步骤 。大部分Anza内切酶可使用一步法 DNA酶切和去磷酸化实验方案

23、，只需15分钟即可同时进行酶切和去磷酸化，然后加热将酶灭活 。使用Anza限制酶克隆系统，可在40分钟内完成载体和插入片段制备 。此外，Anza T4 DNA连接酶预混液可在15分钟内实现粘性末端片段的高效连接 ，用于定向克隆，使研究人员能在 1小时内完成克隆流程 。结论Anza限制酶克隆系统使研究人员能够在 60分钟内完成从经扩增DNA片段、超螺旋质粒到获得连接产物用于转化的过程 。本文显示了Anza系统用于常见定向克隆流程的灵活性 。本文中的范例是Anza限制酶克隆系统用于传统限制酶克隆流程的方法之一。如需了解更多实际范例，请登录 thermo? ，查找 Anza限制酶克隆系统用于其他克隆领域的白皮书 。过程插入片段制备使用两种限制酶进行酶切加热灭活或柱纯化载体制备使用两种限制酶进行酶切5'3'Digestion3'5'去