OsMPK3即TEY型水稻C组MAPK、磷酸化与E-box元素结合的转录因子水稻OsbHLH65

1、OsMPK3即TEY型水稻C组MAPK、磷酸化与E-box元素结合的转录因子水稻OsbHLH65摘要主要信息 OsMPK3是一种TEY型水稻C组MAPK，它直接在细胞核内磷酸化OsbHLH65。OsMPK3和OsbHLH65在生物胁迫下被诱导表达，同时还可以抵抗相关激素。摘要 MAPKs参与大部分的信号通路，如通过目标分子的磷酸化调节植物生长和抗逆性。根据活性环中的TXY（X=E或D）模体，植物MAPKs被分为两个亚型，即TEY和TDY；TDY结构域是植物MAPKs所独有的。在水稻中，17个MAPKs被分为6组。到目前为止，TDY型的水稻MAPKs的功能已经清楚，但是，TEY型水稻C组MAPK

2、s和它们可能的目标底物所知甚少。在本研究中，我们认为TEY型水稻MAPK属于C小群，命名为OsMAPK3，它在细胞核中磷酸化其底物OsbHLH5。我们的电泳迁移率改变分析结果表明：OsbHLH65特异结合E-box的顺式元件而不是G-box。OsMPK3和OsbHLH65都是被诱导治疗稻瘟病、稻褐飞虱和防御相关激素，如茉莉酸甲酯和水杨酸。我们的研究结果表明：OsMPK3通过磷酸化bHLH转录因子促进防御信号转导。关键词 水稻 稻瘟病菌 MAPK bHLH 生物胁迫 E-box顺式元件缩略词MAPK(MPK) 促丝裂原活化蛋白激酶BPH 稻褐飞虱ERK 胞外信号调节激酶CD 常见停靠位点TF 转

3、录因子MAPKsbHLH 基本螺旋-环-螺旋前言MAPKs在胞内信号转导中扮演关键角色。MAPK级联顺序包括3个蛋白激酶，即MAPKKK、MAPKK和MAPK（Ichimura et al.2002）。根据活性环中TXT（X=E或D）模体类型，植物MAPKs分为两个亚型，而且它们都可以被MAPKK磷酸化。TEY模体类似于动物ERK型MAPKs，但是TDY是植物特有的（Cristina et al.2010;Doczi et al.2012;Hamel et al.2006）。从藻类到高等植物，这两个模体都是高度保守的。根据序列的相似性和蛋白质结构，拟南芥MAPKs被分为4组，A-D（Ichim

4、ura et al.2002），然而在水稻中已经确定有17个基因编码MAPKs被分为6组，A-F（Reyna and Yang 2006;Rohila and Yang 2007）。在水稻中，A、B、C组MAPK有一个TEY模体和一个MAPKK的CD。相比之下，D、E、F组MAPKs缺少CD，其活性环有一个TDY模体（Reyna and Yang 2006）。TDY型MAPKs在活性环附近有3-4个氨基酸插入。很多TDY型水稻MAPKs的功能已经清楚，但是对C组MAPK知之甚少（Liu and Xue 2007;Pires and Dolan 2010;Rohila and Yang 2007

5、）。无论在动物还是植物基因组中，TFs中的bHLH结构域都是高度保守的。bHLH结构域是由50-60个氨基酸组成，形成两个不同的片段，一个基本片段是由10-15个氨基酸组成，一个HLH通过一个可变环将两个两亲螺旋分开（Carretero-Paulet et al.2010）。DNA结合域位于bHLH的N-端。两个bHLH蛋白的两亲螺旋可以相互绑定形成同源或异源二聚体。总共167个和162个bHLH编码基因分别在水稻和拟南芥中被确定（Carretero-Paulet et al.2010），曾有报道bHLHs参与植物防御反应。两个拟南芥bHLH TFs MYC3和MYC4需要JA调控生理过程，包

6、括根系生长、抑制和抵抗病原体和昆虫（Fernandez-Calvo et al.2011）。在水稻中，WRKY和基本亮氨酸拉链（bZIP）TFs已确定作为MAPKs的目标分子，但是bHLH的类似信息仍然缺乏（Singh et al.2012）。最近，据报道：水稻bHLH TF、RAI1被A组MAPKs磷酸化，如OsMAPK5和OsMAPK6（Reyna and Yang 2006），同时可以调节诱导子应答基因PAL1和WRKY19对抗稻瘟病（Kim et al.2012）。然而，bHLH TFs家族相对较大，多个目标底物被水稻MAPKs磷酸化，在防御反应中这些目标底物被活化。小粒野生稻很早就有

7、研究（Cho et al. 2005；Shim et al. 2004），它抗褐飞虱和稻瘟病。我们一个水稻MAPK，命名为OsMAPK3，与OmMPK同族。在本研究中，我们筛选它可能的底物OsbHLH65，使用酵母双杂筛选系统鉴定该转录因子是否被OsMPK3磷酸化，我们也研究与OsbHLH65作用的顺式作用元件，用以分析在响应稻瘟病及褐飞虱和防御相关激素（如MeJA和SA）时OsMAPK3和OsbHLH65基因的表达。材料与方法植物材料和病原菌处理水稻变种：华城幼苗25生长，光周期：16 h光照培养、8 h黑暗培养。致病的KJ101和不致病的KJ301用于水稻稻瘟病接种。我们大量喷射分生孢子悬

8、浮液于生长4周的幼苗。水稻褐飞虱侵染参考Shim et al（2004）。我们将褐飞虱幼虫放置于生长4周的幼苗上，每次10 s。激素处理水稻变种的无菌种子：韩国华城种子在湿滤纸的培养皿25°C 1周在黑暗条件下发芽之后，转移到组织细胞培养基上，其中有四层纱布(5×5厘米)和45mLMS培养基，25°C条件下，以光照培养16h黑暗培养8h为光周期培养2周。幼苗根系三个不同的植物激素分别处理，即：茉莉酸甲酯、乙烯利、水杨酸，其使用浓度分别是100、500、200µM。OsMAPK3和OsbHLH65的克隆以分别被稻褐飞虱和稻瘟病处理的水稻叶片为材料提取总RN

9、A，混合后反转录成cDNA,以cDNA为模板PCR扩增得到全长OsMPK3和OsbHLH65.PCR产物克隆到pGEM-T简单载体(Promega)。构建克隆表达重组蛋白,用SmaI酶切OsMPK3、EcoRI和XbaI 双酶切OsbHLH65分别多克隆到pGEX4T-3和pMAL-c2X。然后转化到大肠杆菌BL21菌株内。根据说明书分别用谷胱甘肽琼脂糖和直链淀粉树脂制备OsMPK3-GST和Osb HLH65-MBP融合蛋白。体外活性测定用4个反应缓冲液进行活性测定(20 mM HEPES, 10 mM MnCl2or MgCl2, 1 mM Na2-VO4, 0.5 mM PMSF, 2

10、mM EDTA, 2 mM DTT, 200 nMATP, 1µCi 32-P-ATP) ，将缓冲液和纯化的OsMPK3-GST和Osb HLH65-MBP融合蛋白各1ug用15uL反应体系反应。髓磷脂碱性蛋白作为阳性对照。使用10mMMn2+ 或者Mg2+测试金属离子辅助因子偏好性。反应混合物30°C孵育30分钟，通过添加十二烷基硫酸钠(SDS)样品缓冲(250 mM Tris-Cl pH 6.8,10% SDS、30%甘油、0.02% 间溴苯芬蓝色)终止反应。立即95°C煮沸5分钟。然后10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。凝胶用考马斯亮蓝R - 250染色、晒

11、干。然后使用富士胶片bas - 2500图像分析系统进行放射自显影。双分子荧光互补分析为构建BiFC分析克隆载体、OsMPK3和OsbHLH cDNA分别被克隆在pUC-SPYNE载体的Spe I/ XhoI位点和pUC-SPYCE载体的Spe I/ SmaI位点(Walter et al . 2004年)。每1ug载体样品混合成同等体积氦启动粒子输送系统(pds - 1000 / HeTM;Bio-Rad)使用1100 psi的防爆膜和1.0 um黄金微载体导入洋葱表皮细胞。然后样本MS固体培养基上25°C在黑暗培养12 h。用DAPI(4 6-diamino-2-phenylin

12、dole)孵育洋葱表皮细胞5分钟给细胞核染色(1ug mL-1 DAPI的磷酸缓冲盐)。BX51荧光显微镜下观察荧光。反转录聚合酶链式反应和q RT - PCR分析使用TRI试剂提取总RNA，根据说明书以用低聚糖(dT)为引物用Super Script III反转录酶将5ug总RNA反转录成cDNA，RT- PCR分析,OsMPK3和OsbHLH65使用24个周期 EF1a作为内参基因使用22个周期。RT- PCR条件是95°C 3min、22 - 24 个循环、95°C30s、57°C20s、72°C30s。实时PCR,根据说明书以Light Cycl

13、er 480 SYBR Green I控制系统。实时定量PCR循环程序包括95°C 10分钟激活初始聚合酶，其次95°C10s、58 °C10s、72°C20s、40个循环。每个循环的72°C延伸后用Mono Hydrolysis Probe setting (483533 nm)检测荧光。用Light Cycler480 定量软件中的倒数最大法分析数据。每个cDNA样品扩增的时候做3个重复，为使其标准化用水稻EF1作为内参基因。反转录PCR和实时定量PCR所用引物见附录表S1。电泳迁移率分析(EMSA)根据说明书用一个非同位素方法轻移发光EM

14、SA试剂盒（Thermo Scientific），检测DNA蛋白复合物。用四种生物素标记的寡核苷酸（G-box，GCC盒，W-box，E-box）作为探针（20 nm；补充表S1）。一个2ug OsbHLH65-MBP融合蛋白的样品在20 uL反应混合物中室温下搅拌20分钟用结束标记DNA中孵育。蛋白酶因子Xa（0.2 LG；NEB）被添加到反应混合物中除去麦芽糖结合蛋白（MBP）。然后，反应样品（20ul）用6.5%天然聚丙烯酰胺凝胶电泳然后转尼龙膜。通过davinch-Chemi TM cas-400sm检测DNA蛋白质复杂的图像（davinch-Chemi）。用于EMSA检测所有探针都在

15、补充表S1列出。酵母菌双杂系统筛选媒人TM图书馆建设和筛选工具(Clontech)是用于分析蛋白质相互作用根据制造商的协议。构建一个GAL4广告融合图书馆,我们使用池rna提取o .漂白亚麻纤维卷叶处理稻瘟病,前列腺肥大,乙烯利,我是的,或SA。开放阅读框(ORF)Os MPK3 c DNA克隆在坐标系到pGBKT7向量被用作诱饵屏幕cDNA表达文库。酵母b-galactosidase化验,Os MPK3-p GBKT7和Osb HLH65-p GADT7 constructswere co-transformed酵母AH109应变。转换后的酵母细胞培养在合成辍学介质(缺乏低浓缩铀,Trp,他

16、和正面)。根据说明书Matchmaker文库的构建和筛选试剂盒（Clontech）用于分析蛋白相互作用。我们混合稻瘟病，BPH，乙烯利，MeJA和SA处理下的水稻叶片提取的RNA以构建一个GAL4 AD文库。以OsMPK3的 cDNA的开放阅读框（ORF）克隆到质粒载体上以筛选cDNA表达文库。，构建的osmpk3-pgbkt7和osbhlh65-pgadt7共转化酵母菌AH109菌株，以测定酵母-半乳糖苷酶。转化的酵母细胞在缺失培养基上培养（缺乏亮氨酸、色氨酸、组氨酸和腺嘌呤）结果和讨论序列比较和系统发育分析OsMPK3OsMPK3，与OmMPK同源，是水稻栽培稻的野生稻O.minuta在以

17、前的研究中获得数据的褐飞虱和稻瘟病抗病因子（Cho等.110你等。2007）被选为种植水稻的抗病因素o .马唐基于之前的研究中获得的数据在一个普通野生稻minuta,这是抗稻瘟病和BPH(Cho et al.2005;You et al . 2007)。OsMPK3，与OmMPK之间氨基酸序列同源性为99%(数据没有显示)。OsMPK3曾有两个不同的名字，OsMPK3，OsMPK2，但其确切的功能尚未被确定（Liu and Xue 2007）。在水稻研究的情况下，系统命名法尚未明确，这导致了同一基因的不同名称。OsMPK3在这项研究中是不同于OsMPK3之前已经报道过属于A组(Liu and

18、Xue 2007;Wang et al . 2013),也称为OsMAPK2 、OsBIMK1 、OsMSRMK2 、OsMAPK5或OsMAP1(Agrawal et al. 2002; Rohila and Yang 2007; Song et al.2006; Song and Goodman 2002; Xiong and Yang 2003)。在我们的研究中,我们采用2006的 Reyna 和Yang提出的命名系统（2006）和命名基因OsMPK3。我们的分析显示，OsMPK3包含两个内含子和两个外显子，有1113个核苷酸，开放阅读框（ORF）编码370个氨基酸，分子质量为42.4

19、k Da和PI为7。第一内含子位于50非翻译区和第一外显子之间，第二内含子位于第一外显子和第2外显子之间（补充图1A）。用EcoRI 、 EcoRV 或BglII酶切，Southern blot分析，证实在水稻基因组中的单拷贝存在OsMPK3（补充图1B）系统发育和对其使用推导的氨基酸序列与其他植物OsMPK3分析显示C组MAP激酶高相似性（图1A）。OsMPK3显示与ZmMPK14，OsMPK4，MPK1，AtMPK2，MPK7、AtMPK14和NtMPK14氨基酸同源性分别为96，92，84，84，82，80，和77%（图1b）。像其他植物C组MAPK，OsMPK3由TEY和CD位点（图1

20、B）。此外，OsMPK3非常接近OsMPK4，这是C组的功能已被确定的水稻MAPK。OsMPK4在植物发育中已知的功能有糖饥饿和生物和非生物胁迫（Agrawal et al. 2003; Fu et al. 2002）由激素、稻瘟病和水稻褐飞虱诱导的OsMPK3的表达我们使用被稻瘟病和处理的幼苗合成cDNA研究OsMPK3的表达模式发现OsMPK3两种表达机制，如预期在O. minuta的结果。OsMPK3在非正常条件下轻微表达，但在6小时后，其由水稻褐飞虱引起表达并逐渐增加（图2A）。稻瘟病接种后，OsMPK3从8到48 h时表达稳定（图2B）。一滴水对稻瘟病菌分生孢子的产生生长分化为专业的

21、生殖管感染的结构称为附着胞粘附叶表面（Gan et al . 2012）。附着胞产生侵入钉刺，它通过水稻叶表面的表面，使真菌菌丝，它分泌的诱导和吸收养分从活植物细胞，渗透到水稻表皮细胞中扩散到邻近的细胞（Gan et al . 2012）。这种感染过程大约需要12到24小时，假设应答系统MPK3对水稻叶片表面的物理变化或诱导是瘟病感染的初始步骤。在35个周期的聚合酶链反应检测显示：OsMPK3整体的叶、茎、根组织中叶组织中明显高于在茎或根组织（数据未显示）。用激素SA，MeJA和乙烯利处理后，我们特征化OsMPK3表达模式。相比正常情况下，SA诱导1.5 h后OsMPK3表达增加约三倍而达到一

22、个最大值，在MeJA处理4小时后超过2.5倍。然而，正常的情况如下降低乙烯利处理，它的表达下降到50%（图2C）。因为OsMPK3有92%的氨基酸序列同OsMPK4，因为后者是无毒的病原体引起的是激素而不是由乙烯（Reyna and Yang 2006），我们认为OsMPK3具有功能与OSMPK4相同。基于这些数据，我们认为OsMPK3参与防御反应。OsMPK3磷酸化细胞核的转录因子OsbHLH65为确定OsMPK3是否具有激酶活性，我们进行了在体外激酶测定发现OsMPK3有磷酸化活性促进髓鞘碱性蛋白磷酸化，一个典型的MAPK底物（图4c）。为确定OsMPK3底物，我们进行了酵母双杂交筛选测定

23、。首先，我们在酵母细胞中共转化OsMPK3和空的活化载体，确认OsMPK3没有交易（补充图S2）。60个阳性克隆测序，我们筛选了17个假定的相互作用蛋白然后选择一个具有相同序列的克隆做三个独立重复，其中包含bHLH结构域（图3A）。核苷酸序列全长的脱氧核糖核酸显示，这种对应的蛋白质是OsbHLH65。随后的数据库搜索显示OsbHLH65在C端区域有MAP激酶的位点（图3b）。一般来说，MAPK的CD是保守的转录因子，这是位于之间基本和疏水残基（图3b）（Sharrocks et al. 2000）。这些数据表明，OsbHLH65是OsMPK3潜在底物。亚细胞定位实验结果表明OsMPK3定位于细

24、胞质和细胞核（图4A）。核定位信号（NLS；skkprn）在推导的氨基酸序列OsbHLH65也由PSORT程序确定（）（图3b）。因此，MPK3是由细胞质运送到细胞核，才可以与底物OsbHLH65作用，我们使用双FC法研究OsMPK3与OsbHLH65的体内相互作用。正如预期的那样，该试验清晰显示OsMPK3和OsbHLH65在细胞核相互作用（图4B）。为了证明OsbHLH65是OsMPK3和直接磷酸化的底物，我们使用已使用GST珠子和纯化直链淀粉纯化的OsMPK3-GST和OsbHLH65-MBP融合蛋白进行体外激酶测定。图4显示的结果表明MPK3直接磷

25、酸化OsbHLH65。结果是相同的，所观察到的OsMPK3自身磷酸化，磷酸化OsbHLH65（图4c）。这些数据导致的结论是，OsMPK3细胞核内磷酸化OsbHLH65，而锰离子作为一种金属离子辅因子。与Osb HLH65结合的E-box 顺式元件类型选择P32标记双链的随机寡核苷酸探针的方法进行Oligo DNA结合分析（Jeong et al. 2011）来确定与OsbHLH65结合的顺式作用元件。然而，这个实验的结果是不令人满意的。因此，为确定共同的顺式元件，我们从SDS聚丙烯酰胺凝胶切除DNA蛋白复合物，洗脱DNA进行测序。22个克隆测序，我们确定了存在的四个已知的顺式元件，即G-bo

26、x，GCCbox，W和E-box。然后，我们合成了40个碱基探针的这些四顺式作用元件（补充表S1）我们用这些探针在OsbHLH65-MBP融合蛋白的结合。结果表明，OsbHLH65没有结合到G-box，也没有特异性结合的E-box（图5）。bHLH结构域是高度保守的50个氨基酸区域，HLH和N-末端的基本含有约17个基本氨基酸的区域（Li et al. 2006; Pires and Dolan 2010; Sailsbery and Dean 2012）。基本区域在识别中起着至关重要的作用。在动物bHLH蛋白，A组谷氨酸（E）在位置9，进入直接残留与脱氧核糖核酸，即所谓的E-box（Li e

27、t al. 2006; Pires and Dolan 2010; Sailsbery and Dean 2012）。在水稻，共167 个OsbHLH蛋白分为2组：（1）脱氧核糖核酸和（2）非脱氧核糖核酸。对这167个OsbHLH，141（84%）bHLH蛋白具有平均六个基本残基是脱氧核糖核酸的粘合剂，和26bHLH蛋白缺乏基本的残基的非DNA粘合剂。141个基因的粘合剂，114（88%）是公认的E盒结合蛋白，可以进一步细分为两组：non-G-box 粘合剂和G-box粘合剂。这个95（83%）的114个E-box粘合剂HLH蛋白属于B到G-box（CACGTG）亚组，而剩下的19（17%）属于non-G-box结合组。因此，bHLHS大多属于基于动物B组bH