分离小鼠心肌细胞protocol

1、分离小鼠心肌细胞Protocol实验动物：小鼠,体重2030g1急性分离心肌细胞A实验准备：1）无钙台氏液：配500mL无钙台氏液（50mL台氏母液+450mL去离子水+1g葡 萄糖），用NAOH调PH, 一般在7.357.4之间即可，注：充氧后调 PH值，否 则充氧后PH下调。调PH值前严格校正PH计，小鼠心肌细胞对PH值特别敏 感。表1:台式母液配方mMMWg/Lg/500ml (10x)NaCl12658.447.36336.82KCl5.474.550.4032.02Hepes10238.32.38311.92MgCl2.6H2O1.0203.30.2031.02NaH2PO4.2H2

2、00.33156.010.0520.2574CaCl21.8147.03Glucose10198.2注：CaCl2, Glucose配制时后加，（浓度 0.9M CaCl2母液6.616g（有水）或者4.995g（无水）+50ml去离子水），0.2ml CaCl2母液/100ml无钙台氏液2）称取5mg胶原酶H +8mg白蛋白3）配有钙液200ml:即200ml无钙液+0.4ml CaCl2 （0.9M）。注：小鼠心肌细胞 对钙浓度特别敏感，我们为了缩短心脏复跳时间，减少心肌耗氧，把有钙液中钙 离子浓度降到正常的浓度的1/44）准备器械：大弯剪刀一把，小直剪刀两把，直银子两把，止血钳两把，弯镶

3、 子两把，纱布一块，注射器60mL一个，10mL一个；手术线一团（小鼠主动脉比较细，手 术线比大鼠的要细”表面皿三个，小烧杯50mL三个，量筒50mL两个，500mL 一个；大烧杯500mL一个250mL一个；滤纸若干！滴管 4个，7号注射针头一 个(尖端磨平，靠近尖端两厘米处用止血钳夹出一道深沟以便于固定主动脉时系 线)。5) KB液配方mMMWg/LGlutamic acid70147.1310.3(谷氨酸)Taurine(牛黄崎)15125.141.875）KCl3074.552.237Hepes10238.32.383MgCl2.6H2O0.5203.30.1015Glucuse101

4、98.21.982EGTA0.5380.40.19KH 2PO410136.091.36注：5M KOH 调 PH 值（7.374）,5M KOH配制：28g KOH溶于100ML去离子水，KB液保存在-20 C冰箱中保存。B实验过程1)、实验前准备：(1)、准备仪器：电热恒温器(带水泵的)、Langendorff灌流系统。(2)、检查氧气瓶里是否有氧气。(3)、打开恒温灌流装置的电源开关，调节电热恒温器的水温，泵出的水打入冷凝管，使通过冷凝管的灌流液保持 37c的恒温。(4)、清洁Langendorff管路，第一次使用先泡酸后用蒸储水冲洗干净，以后 每次使用前先用去离子水将Langendor

5、ff管冲洗3遍即可开始实验。(5)、配制好无钙的细胞外液及有钙液，并取约 50ml有钙液置于表面皿中后 放置在冰袋上，使其温度降到0c左右；另一 50ml有钙液置于表面皿中放入4c 冰箱待用(6)、向冲洗后的Langendorff管中加入有钙液，用注射器轻轻吸出气泡，并向管中通入氧气。有钙液浓度降到正常浓度的1/4,灌入大概50ml有钙液，上 面倒无钙液。（ 7） 、分别称取5mg 胶原酶和8mg 白蛋白，用约50ml 无钙液溶解、备用。（ 8） 、 10ml 注射器连接预备好的7 号针头，手术线打松结待用。2） 、正式试验：（ 1） 、选取小鼠，称重，用1%戊巴比妥麻醉（ 腹腔注射），麻醉剂

6、剂量尽量小，如果无需监测心电可采用断髓法处死小鼠。不必打肝素，肝素抗凝同时对心脏也用副作用。（ 2） 、待麻醉充分后，迅速开胸取出心脏（取心脏时切忌用手碰到心脏，首先用小直剪刀靠近头段剪断主动脉，用另一只手持直镊子提起肺组织，从下方游离心脏） ，放到0的有钙液中洗涤（可以轻轻的用食指按压心脏，使心脏内的血液蹦出来，同时观察蹦出来的动脉孔，即主动脉），分离出主动脉（主动脉不能分离太长，同时去除心包膜，即周围的组织，动作要迅速，主动脉一般位于两个白色胸腺下方，主动脉上端可见其三个分支，沿分支处剪断主动脉，暴露主动脉干出口）， 用预备好的连在10ml 注射器的7 号针头轻轻插入主动脉，用手术线固定主

7、动脉（使灌流针头在主动脉的根部即可，太向下或者太向上灌流效果都不好，一般在肺动脉圆锥上端），将 Langendorff 管上三通打开，液体流出，然后把固定心脏的7 号针头连接到Langendorff 管上， 用有钙液灌流，同时观察肺动脉流出道是否被堵住，如果堵住立即用小剪刀剪开（同时观察液体流下的速度，调节灌流针的深度）待心脏跳动几次后，加入无钙液，直至心脏停止跳动（完全停止，否则影响酶的消化，同时用拇指和食指轻轻挤压心脏感觉硬度），无钙液灌流时间稍微长一点比较好，停跳后 1020 分钟加入预先配好的胶原酶和白蛋白混合液（先弃掉20mL而后开始计时）大约30min心脏颜色变浅、质地变软时， 煎

8、取少许右侧心肌组织放到 KB液中，待有细胞下来时，将剩余心肌组织取下， 用剪刀轻轻剪周围组织，不要剪断，然后将组织放到KB液中用吸管吹打，吹打时细胞下来，而组织相对保持完整形态比较好，吹打完细胞，剩余组织扔掉，心肌细胞保存在KB液中。稳定一小时后待用.小鼠心肌细胞消化时长大约在 3050 分钟（ 3） 、试验结束后，用去离子水冲洗整个管路系统，防止酶残留在管路中剩余的无钙液配成有钙液！2实验室溶液配方普通电极液(Pipette solution in mmol/L)KCl 20, K-aspartate 110, MgCl 2 1.0, HEPES 5, EGTA 10, Na2ATP 5 a

9、t pH 7.2 ;用KOH 调 pH 至 7.3。有钙台式液(Tyrode solution containing, in mmol/LNaCl 126, KCl 5.4, MgCl 2 1, CaCl21.8, NaH2PO4 0.33, glucose 10, and Hepes 10用NaOH 调 pH 至 7.4。3实验过程记录电流protocol内向整流钾通道电流记录 protocol将电压钳制于-40 mV,从-120 mV至+50 mV,以10 mV为步阶，脉冲持续时间为300 ms,可记录到内向整流钾电流。瞬时外向钾通道电流记录 protocol将膜电位钳制于-50 mV,给予1个100 ms的脉冲刺激，该脉冲在-40 mV至+50mV,以10 mV递