项目十七 T淋巴细胞表面标志和功能检测

1、项目十七T淋巴细胞表面标志和功能检测一、E花环形成试验(Erythrocyte rosette formation assay)【实验原理】人外周血T淋巴细胞表面具有绵羊红细胞(SRBC)受体，可与SRBC结合形成花环样细胞团(即E花环)。此试验用于计数T细胞数量，进而可判断机体细胞免疫状况。由于T 细胞的异质性，其中在4放置1h以上，所形成的花环数代表T细胞总数，称为总花环(Et花环)，而淋巴细胞与SRBC混合后不经4作用，立即反应形成的花环称为活性花环(Ea花环)。【试剂和器材】1肝素抗凝剂用Hanks液将肝素配成500U/ml，分装，每管0.1ml，置4备用。2淋巴细胞分离液(密度为1.

2、077±0.001)。3小牛血清56加热灭活30min，按2:1比例与沉积SRBC混合，置3730min，离心，收集血清备用。40.5SRBC悬液取脱纤维或Alsever液保存的羊血，用510倍量生理盐水洗 3 次。第3次2500r/min离心10min，弃上清液，用生理盐水配成0.5的SRBC悬液(约108个细胞/ml)。50.8戊二醛取30.25ml 4.5 g/L NaCl 盐水，加入1ml 25戊二醛即可。6姬姆萨-瑞氏染液取磷酸缓冲液(PB：1/15 mol/L, pH7.07.4)10ml，加入姬姆萨染液6滴及瑞氏染液1滴。7Alsever液、Hanks液(无Ca2+和M

3、g2+, pH7.27.4)、PB(1/15 mol/L, pH7.07.4)、生理盐水。8离心机、水浴箱、电冰箱、显微镜、离心管、载玻片、盖玻片、吸管、吸球、注射器。【步骤和方法】1淋巴细胞悬液的制备取2ml肝素抗凝血，加入2ml Hanks液，叠加于2ml 淋巴细胞分离液上，水平离心2000 r/min 20 min。取出单个核细胞层，用45倍Hanks液洗2次，每次离心1000r/min 10min。弃去上清液，留下沉淀细胞约0.2ml。 2Et花环试验(1)取0.2ml 0.5SRBC悬液和0.1ml小牛血清，加入到沉淀细胞管中混匀，置37水浴5min。(2)取出离心500 r/min

4、 5min，置412h或过夜。(3)沿管壁加入0.8戊二醛0.2 ml，置420min。(4)弃上清，留约0.2ml，轻轻吹吸混匀沉淀细胞。(5)结果观察湿片法观察：取1滴细胞悬液滴加于载玻片上，加入少许姬姆萨-瑞氏染液染色，加盖玻片后高倍镜下观察。干片法观察：取细胞悬液涂片，自然干燥，用姬姆萨-瑞氏染液染10min，水洗，干燥后高倍镜或油镜下观察。3Ea花环试验 与Et花环试验基本相同，不同之处是SRBC悬液的浓度为0.1， SRBC与淋巴细胞混合之比为10:120:1，混合后立即离心1000r/min 5min。加入戊二醛固定，染色，观察均与Et花环试验相同。【结果判定】淋巴细胞呈蓝紫色或

5、淡蓝色，SRBC不着色，凡结合3个SRBC或以上者为E花环形成细胞(ERFC)。计数200个淋巴细胞，求出E花环形成率()。正常值：EtRFC为 60%80，EaRFC为20%40。【注意事项】1SRBC与淋巴细胞混合后离心速度不能过高，在Et花环试验中，置4应至少1h以上或过夜。2绵羊红细胞以保存1周内者最好，超过2周与淋巴细胞结合力下降，超过56周则不能再用。3Et花环试验SRBC与淋巴细胞混合比例以100:1200:1为宜，Ea花环试验中以10:1 20:1为宜；淋巴细胞离体后不能超过6h；否则会影响花环形成率。4温度对实验结果影响较大，故实验温度条件应保持一致，从4取出后应立即计数。5

6、计数前将沉淀细胞重悬时，使细胞团块松散均匀即可，不可强力吹打，以免SRBC从淋巴细胞上脱落。【方法评价】方法简便易行，曾被广泛应用，但影响因素较多，结果偏差较大，故细胞计数已被CD抗原免疫检测法取代。【临床意义】 可用于先天性细胞免疫缺陷病的检测；肿瘤病人疗效观察及预后判断；评价迟发型变态反应，某些感染和组织器官移植，可了解机体细胞免疫状态；探讨某些疾病发病机理；考核药物疗效及研究药物作用机理；也可用于T淋巴细胞的分离。【思考题】E花环试验原理与EA、EAC花环试验有何不同？二、T淋巴细胞亚群的检测(T lymphocyte subset assay)人T淋巴细胞表面具有CD3、CD4、CD8

7、等多种分子，通过检测这些分化抗原鉴定T细胞及其亚群的方法有多种，归纳起来有两大类：一类是用标记的抗体着染细胞，之后根据标记物不同，采用相应的方法对CD抗原进行检测分析，如免疫荧光法、免疫酶法、ABC法及免疫金银染色法等；另一类是用抗CD抗原抗体致敏的红细胞与淋巴细胞做花环形成试验。两类方法各具特点，以下分别选取两类方法中较具代表性的一种加以介绍： (一) 间接免疫荧光法【实验原理】 利用鼠源抗CD抗原单克隆抗体与淋巴细胞反应，然后再采用荧光素标记的羊(或兔)抗鼠IgG的第二抗体进行染色，最后在荧光显微镜下计数细胞，统计荧光阳性细胞百分数，即可测知T细胞亚群数量、百分率及比值。 【试剂与器材】

8、1抗CD3、CD4、CD8抗原单克隆抗体。 2FITC标记羊(或兔)抗鼠IgG抗体(第二抗体)。 3淋巴细胞分离液(比重1.077±0.001)。 4含2% BSA的无Ca2+、Mg2+ Hanks液(PH7.2±0.2)，Hanks液。 5荧光显微镜、离心机、离心管、吸管、试管、Eppendorf微量管、玻片等。 【步骤与方法】 1取肝素抗凝静脉血2ml，常规用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，以含2% BSA的无Ca2+、Mg2+ Hanks液洗涤3次并重悬，进行细胞计数，调整细胞浓度至5×106/ml备用。 2取4只Eppendorf 微量管，各加入淋巴细胞悬液5

9、0l，然后分别加入适当稀释的抗CD3、CD4、CD8 单抗各50l，另一管加50l Hanks液作为阴性对照，轻轻混匀，冰浴或4作用3060 min。 3取出反应管，用Hanks液洗涤3次(每次1000r/min离心1 min)，弃上清，留取沉淀细胞。每管加入适当稀释的FITC标记羊(或兔)抗鼠IgG抗体(第二抗体)50l，轻轻混匀，冰浴或4作用3060 min。 4取出反应管，用Hanks液洗涤3次(每次1000r/min离心1 min)，并用Hanks液重悬至原量。用吸管取样滴于载玻片上，加盖玻片后在荧光显微镜下观察结果。 【结果判定】 1先用普通光源计数视野中的淋巴细胞总数，再改用紫外光

10、源计数同一视野中的荧光阳性细胞数，统计其百分比。 2荧光强度分级：“”为无荧光着色；“±”为弱的可疑荧光；“”为细胞膜点状荧光着色，荧光弱但清晰可见；“”为细胞膜点状荧光着色，荧光清晰明亮；荧光闪亮为“”至“”。特异性反应荧光强度应达“”以上。3一般需计数200个淋巴细胞，从中统计阳性细胞百分率，计算CD4+/CD8+比值。4正常参考值： CD3+：66.0±9.9%； CD4+：43.8±9.0； CD8+：31.3±7.0%。在确定正常值范围时，应据不同试剂盒情况加以调整，以求准确。【注意事项】 1实验过程中，离心速度不宜过大，洗涤和混匀操作亦应动作

11、轻柔。 2非特异荧光的问题：由于非特异荧光来源较多，首先应在进行预实验的基础上确定各抗体的最佳浓度，尤其是荧光标记第二抗体的浓度；其次在判定结果时，应认真观察阴性对照，对于非特异荧光导致的假阳性仔细加以排除。为减少试验误差，对于死细胞及分散不好的细胞团块应不作计数。 3被检测标本应新鲜，荧光染色后的标本最好当日观察，否则随时间延长，荧光强度会逐渐下降而影响结果的可靠性。【方法评价】 该方法是目前临床上检测T淋巴细胞亚群较为常用的方法，其优点是特异性强且敏感性较好，缺点是标本不能长期保存，而且结果判定易受主观因素影响。在荧光染色后，如能采用流式细胞仪进行细胞计数，在一定程度上可以使结果更为客观、

12、准确。【临床意义】 T淋巴细胞亚群测定对于检测机体细胞免疫功能具有重要的参考价值，对于临床上一些免疫缺陷病、自身免疫病、移植免疫、及肿瘤性疾病的诊断及疗效观察均有一定的参考意义。CD4+/CD8+比值可作为评价机体免疫调节功能的重要指标之一。 (二)抗体致敏红细胞花环形成法【实验原理】 用抗CD抗原单克隆抗体致敏的醛化绵羊红细胞作为指示物，在将该红细胞与受检淋巴细胞反应后，借助单抗与淋巴细胞表面对应CD抗原的结合，使抗体致敏的红细胞吸附于对应淋巴细胞表面而形成花环，然后在显微镜下计数花环阳性细胞，统计其百分率。【试剂与器材】 1CD系列单抗致敏红细胞试剂。 2无Ca2+、Mg2+ Hanks

13、液。 3含20%新生牛血清的无Ca2+、Mg2+ Hanks 液。 4离心机、离心管、吸管、试管、Eppendorf 微量管、玻片，普通显微镜等。【步骤与方法】 1取肝素(50U/ml)抗凝血2 ml，常规用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，以含20%新生牛血清的无Ca2+、Mg2+Hanks 液洗涤3次，并重悬，进行细胞计数，调整细胞浓度至5×106/ml。将试管呈20°角倾斜放置，于37孵育45min后将细胞悬液取出置于另一只试管中，原管弃去以去除粘附细胞。离心去上清并恢复至原量备用。2根据待检样品取一定量CD系列单抗致敏红细胞悬液，离心弃上清，再用含20%新生牛血清的无Ca

14、2+、Mg2+ Hanks 液恢复至原量。 3将淋巴细胞悬液与致敏红细胞悬液等量混合(各25l)，室温(2225)置10min后500 r/min离心10 min，室温继续放置1h, 之后4作用2h 或过夜。4取出反应管，轻轻重悬后用Giemsai染液染色30min，用吸管轻轻混匀并吸取标本少许滴于载玻片上，盖上盖玻片，普通显微镜下观察结果。【结果判定】用高倍镜检查，淋巴细胞周围粘附有3个或以上红细胞者为花环阳性细胞，未粘附红细胞者为阴性细胞，粘附一、二个红细胞者不作计数统计。共计数100200个淋巴细胞，算出形成花环细胞的百分率。【注意事项】 1本实验中抗体致敏红细胞试剂务求新鲜，试剂打开后

15、，尽量避免长期、反复使用。 2实验过程中，离心速度宜小；混匀及取样滴片检测时，操作宜轻柔。 3实验结果应尽快于当日或次日观察，不应长期放置。【方法评价】本方法简便、快捷，计数结果方便，不需要荧光显微镜等特殊仪器，因此易于应用，而且本方法尚可应用于淋巴细胞及其亚群的分离提取，但是结果同样易受主观因素影响。也可以通过用第二抗体(羊或兔抗鼠IgG)致敏的红细胞试剂，采取间接花环形成法进行此实验，这样可避免应用多种单抗致敏红细胞而带来的不便，使本法应用更为方便。【临床意义】 同方法(一)【思考题】 1T淋巴细胞表面CD抗原与其细胞亚群之间的对应关系是怎样的？ 2如何利用上述方法(二)进行T细胞及其亚群

16、的分离与提取？ 3为何荧光抗体活细胞染色在冰浴或4进行？ 三、淋巴细胞转化试验(Lymphocyte transformation test) T淋巴细胞在受到非特异性有丝分裂原或特异性抗原刺激后能发生增殖反应，细胞代谢旺盛，蛋白质和核酸合成增加；与此同时细胞体积增大，分裂呈母细胞样，此为淋巴细胞转化现象。因此可借助形态学方法，3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法或MTT比色法测定淋巴细胞转化程度。此处只介绍形态学方法和MTT比色法。(一) 形态学方法小鼠体内诱导法【实验原理】植物血凝素(PHA)在小鼠体内能刺激T细胞发生增殖，可逐渐转化为体积较大的母细胞，胞浆增多，核增大并可见核仁，也可

17、出现有丝分裂现象。根据形态鉴别、计数转化细胞的百分率可反映机体内T淋巴细胞转化情况。【试剂和器材】1小鼠昆明种小白鼠，雄性。2PHA Difco产品(PHA-P)，每瓶用5ml蒸馏水溶解，再加入生理盐水20ml，终浓度为2mg/ml。3瑞氏染液、75酒精棉球。4注射器、载玻片、剪刀、显微镜。【步骤和方法】每只小鼠每天肌内注射PHA 10mg/kg体重(0.10.2 ml)，连续3天。第8天采尾血推片，自然干燥，瑞氏染色后油镜下观察。【结果判定】1镜下淋巴细胞形态可以见到以下几种类型。(1)淋巴母细胞胞体比未转化淋巴细胞大34倍，呈圆形或椭圆形，胞浆染色淡蓝，可有伪足、空泡，细胞核增大，核质疏松

18、，呈细网状，可见分裂现象。(2)过渡型淋巴细胞形态介于淋巴母细胞和正常淋巴细胞之间，体积稍大，多为1215mm，胞浆稍多，淡蓝色，核稍大，核质疏松。注意与大淋巴细胞区别，后者虽然体积较大，但核质致密，胞浆较少，嗜碱性强。(3)正常淋巴细胞与未经刺激的淋巴细胞一样，体积小，核质致密，胞浆少，嗜碱性强。2淋巴细胞转化率计算按上述判断标准检查推片头、体、尾三部分，计数200 个淋巴细胞，算出转化率。【注意事项】1PHA 剂量应预先确定，太大对小鼠有毒性作用，太小不足以刺激淋巴细胞转化，注射剂量常为610mg/kg体重。2为使结果稳定应选用体重相近的雄性小鼠，最好选用近交系小鼠。【方法评价】本法操作简

19、便，排除了体外试验时人工条件所致的各种因素的影响，结果稳定，能较好反映体内淋巴细胞转化情况。【临床意义】常用于药物筛选及免疫药理学研究，比体外试验结果较为客观。(二) MTT比色法【实验原理】MTT3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide，噻唑蓝是淡黄色可溶性物质，细胞增殖时通过线粒体能量代谢过程，可将MTT代谢裂解还原成蓝紫色的甲(formazan)，沉积于细胞内或细胞周围，甲的形成量与细胞增殖程度呈正比。甲经异丙醇溶解后呈蓝紫色，比色测定即可知细胞增殖程度。 【试剂和器材】1RPMI-1640培养液用前加入10小牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100g/ml、谷氨酰胺30.0g/L，用NaHCO3调pH至7.27.4。2PHA 用RPMI-1640基础培养液配成10mg/ml。3MTT取MTT 50mg，溶于10ml 0.01mol/L pH7.4 PBS中，用