拟南芥过表达

1、学院：生命科学学院专业：植物学姓名：乔亚飞学号：216021001OverexpressionofSsCHLAPXsconfersprotectionagainstoxidativestressinducedbyhighlightintransgenicArabidopsisthaliana盐地碱蓬CHLAPXs基因在拟南芥中过表达可以保护由强光引起的氧化应激作者：Cai-HongPang,KeLiandBaoshanWang期刊：PhysiologiaPlantarum影响因子：3.52摘要：为了研究抗坏血酸过氧化物酶（CHLAPX）在活性氧清除系统中的作用的重要性，本实验克隆了盐地碱蓬ch

2、lapx（sschlapx）编码基质APX（sAPX）和类囊体膜APX（tAPX）。基质sapx 的cDNA由1726个核苷酸组成，其中包括一个1137bp开放阅读框（ORF），编码378个氨基酸。类囊体tapx 的cDNA由1561个核苷酸组成，包括1284bp的开放阅读框，编码427个氨基酸。ss.sapx与ss.tapx 氮端378个氨基酸是相同的，而炭末端49种氨基酸不同。通过农杆菌转化法将apx转入到拟南芥中，用高光（1000molm21）处理转基因株系。研究结果表明在强光下，转基因株系的Fv/Fm和叶绿素含量在正常光照下差异较小，但是在强光处理下过表株系均显著高于野生型。这些结果表

3、明，在强光胁迫下，SsCHLAPX对叶绿体中活性氧的清除起着重要的作用。APX同工酶大致可以分为四类：细胞质型APX(cAPX)、叶绿体型APX(chlAPX)、线粒体型APX（mitAPX）和微体型APX(mAPX)。chlAPX具有两种类型的同工酶：基质型(sAPX)和类囊体(tAPX)。之前有报道称拟南芥tAPX和豌豆APX基因在烟草中过表达可以降低百草枯对其产生的氧化胁迫(Murgiaetal.2004,Yabutaetal.2002)。烟草中APX基因的过表达无法缓解臭氧产生的胁迫(Torsethaugenetal.1997)。研究的目的：第一，验证APX酶是否具有清除活性氧的功能；

4、第二，研究APX基因的表达部位。13. 在高浓度50%(w/v)甲酰胺缓冲液中,准备使用一个随机引物标记工具32p探针标记DNA。杂交袋至于65中洗膜，待印记变干后取出，在-70下进行底物显色。14. 探针对转录结果的分析显示SsCHLAPX放大了以下引物:SsCHLAPX-f（顺序）(5-GTCGTCAAACCCAACCAACCTCCTC-3)andSsCHLAPX-r（逆序）(5-ACTCTTGCCGGATGAATACTTGG-3).探针对转基因拟南芥转录结果的分析显示sAPX/tAPX放大了以下引物Ss.sAPX/Ss.tAPX-f(5-GTCGTCAAACCCAACCAACCTCCTC

5、-3)AndSs.sAPX/Ss.tAPX-r(5-TGCCTCATAGAATCCGACAGCTCAC-3).拟南芥载体的构建与转化15. 构建转基因载体，采用GATEWAY技术（一种大规模克隆技术）在CaMV35S启动子的控制下将拟南芥中的整条sAPX和tAPX脱氧核糖核苷酸克隆（整合）到AMBIA1300。利用农杆菌侵染法将质粒载体克隆到拟南芥中。利用PCR检测转基因16. 根据Yabuta等的方法从野生型和转基因拟南芥中提取基因组DNA样本，利用以下引物通过PCR扩增tAPXandsAPX当中的100ng的基因组DNA。Ss.sAPX/Ss.tAPX-f(5-GTCGTCAAACCCAA

6、CCAACCTCCTC-3)AndSs.sAPX/Ss.tAPX-r(5-TGCCTCATAGAATCCGACAGCTCAC-3.)制备粗酶提取物17. 粗酶是根据Rao等人的方法从野生型和转基因拟南芥的叶子中提取。（K-phosphatebuffer和M-phosphatebuffer分别是碱性和中性磷酸缓冲液）1g新鲜的叶子放于4的2ml溶液中。50mMl1的碱性磷酸缓冲液,PH7.8，5mMl1的EDTA（乙二胺四乙酸）和2mMl1的AsA。匀浆在4下15000转离心15min。测定上清液中蛋白质含量,过氧化氢酶,抗坏血酸过氧化物酶和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。强光照射处理18.将转

7、基因和野生型拟南芥的叶子剪下来至于卤钨灯下(1000molm2s1)照射2h，灯与样品之间加以流动的水来滤除红光来阻止叶子受热。对照组的叶子至于含水的培养皿中在强光90molm2s1的条件下照射2h。抗氧化酶实验（分析）19.过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性的测定分别根据Raoetal.(1997)andGiannopolitis的方法。APX的测定根据JimenezetalandRies(1997)的方法。蛋白质含量的测定根据Bradford(1976)的方法，以牛血清蛋白为标准。脂质过氧化作用分析（脂质过氧化作用（LipidPeroxidation）是指多不饱和脂肪酸和脂质的氧化变质。脂质过

8、氧化作用能对细胞膜、脂蛋白以及其他含脂质结构产生严重的损害，例如使细胞膜的流动性以及渗透性发生改变、损伤DNA以及蛋白质，进而影响细胞正常功能。人类的许多疾病，如肿瘤、血管硬化及衰老现象都涉及脂质过氧化作用）20. 拟南芥在强光下与非强光环境下叶子中过氧化脂质蛋白的含量以丙二醛(MDA)含量为参照，根据Gueta-Dahan等人的方法（略有修改）用硫代巴比妥酸（TBA）测定MDA的含量（1997）。简略说就是将0.1g的叶子(鲜重)放于1.5毫升0.1%三氯乙酸(TCA)和1.5毫升0.5%硫代巴比妥酸的，沸水煮10分钟后在自来水冷却,然后在1400转下离心15min。MDA浓度计算基于吸光度

9、A532,吸光度A600和它的摩尔吸光系数，公式如下:（FW鲜重）MDAcontent(mol/gFW)=(A532-A600)×103×提取液体积(ml)/1.56×105×样品鲜重(g)过氧化氢染色21. 拟南芥的叶子在用DAB（二甲基联苯胺）染色过程中，内源性过氧化物酶会在原位产生过氧化氢。将拟南芥的叶子取下来至于1mg/ml（PH3.8）的DAB溶液中光照8小时，之后，将叶子在96%沸腾的乙醇中浸泡10min并转移到96%的乙醇中保存。过氧化氢产物可以通过染色的颜色（红棕色）直观的看出来。叶绿素含量22. 根据Lichtenthaler(1987

10、)方法略有改动来，来测定芥拟南芥叶子中叶绿素含量。新鲜的叶子(0.1g)用去离子水冲洗,然后用80%的丙酮提取。总叶绿素含量通过定量溶血分光光度法测定663和645nm处的吸光度来测定，表示为g/g。叶绿素荧光（荧光参数）23. 叶绿素荧光的变化用PAM2000叶绿素荧光仪来测定。PSII的最大量子产率计算公式是如下：Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm反应植物潜在的最大光合能力F0：PSII反应系统处于完全开放时的荧光产量Fm：最大荧光产量共焦显微镜24. 将包含sAPX/tAPX和GFP（绿色荧光蛋白）转基因的拟南芥种子转移到琼脂板上。培养4天的幼苗固定在载玻片上，在共焦显微镜下镜检，绿色荧光

11、蛋白的荧光在共焦显微镜下可以很明显的看到。统计分析25.所有的实验设计均为三次重复，15个转基因株系种子各测试一次。所有实验室数据进行方差分析，用单因素方差和多样本间差异显著性分析野生型与转基因型拟南芥的区别。结果盐地碱蓬CHLAPX（叶绿体抗坏血酸过氧化物酶）的分离与测序26. 根据来源于烟草和拟南芥的CHLAPX同源基因序列，利用反转录酶进行对CHLAPX的3和5端扩增来获得完整的SsCHLAPX序列。通过对3端的替换处理产生两种成熟的RNA，一种是编码类囊体的APX（Ss.tAPX），一种是编码基质的APX（Ss.sAPX）。完整的Ss.tAPXcDNA（脱氧核糖核酸）序列包含1561个

12、核苷酸有1284-bp开放阅读框。编码的蛋白由427个氨基酸组成，估测分子质量为46.3KDa。完整的Ss.sAPXcDNA（脱氧核糖核酸）序列包含1726个核苷酸有1137-bp开放阅读框。编码的蛋白由378个氨基酸组成，估测分子质量为40.96KDa。有趣的是Ss.tAPXcDNA和Ss.sAPXcDNA氮端的378个氨基酸完全相同，而炭端的49个氨基酸不同。SsCHLAPX同工酶的氮端有一个转运肽包含约64个残基。cDNA：中文译名为脱氧核糖核酸，是染色体的主要化学成分SsCHLAPX氨基酸序列的同源性分析27. 为了分析个别氨基酸的异同，我们对不同植物CHLAPXs氨基酸的序列进行推导

13、对比。分析显示SsCHLAPX氨基酸序列与盐土植物crystallinum的CHLAPX氨基酸序列很相似，crystallinum通过切换光合途径（C3光合作用到CMD景天酸代谢）、增加节水来适应干旱，高浓度盐环境。SsCHLAPX蛋白的定位28. SsCHLAPX蛋白序列分析表明在氮端有一个信号肽。为了弄清SsCHLAPX的具体位置，我们培育了稳定表达GFP的转基因植物：Ss.tAPX+GFP和Ss.sAPX+GFP融合蛋白。如图2中G,K所示，融合蛋白确实仅仅位于叶绿体中。盐处理对SsCHLAPXmRNA水平的影响29. CHLAPX基因甚至在非光合组织中例如根中也表达，为探讨用NaCl处

14、理盐地碱蓬时CHLAPX的转录诱导，对盐处理后的盐地碱蓬枝和根的基因进行Northernblot（诺瑟杂交），一组用400mM/l的NaCl处理24或48小时，空白对照不用盐处理；另一组用200mM/l的Nacl处理48h，空白不做盐处理。Northernblot（诺瑟杂交）分析表明400mM/l的NaCl处理24或48小时会提高叶绿体APX基因的转录（如图3A）。400mM/l的NaCl处理盐地碱蓬24小时会使嫩枝CHLAPX转基因水平不断升高，24小时后会逐渐下降。在400mM/l的NaCl处理48小时后，嫩枝SsCHLAPXmRNA的水平仍然高于空白对照。30. 在根部，对SsCHLAP

15、X转录水平与治疗时间的增加而增加（图3A）。在200和400毫米长1NaCl的比较（48小时暴露），在芽SsCHLAPX转录水平较高，有200毫米长NaCl1比400毫米长1NaCl（图3b）；然而在根部，SsCHLAPXmRNA表达水平明显高于400毫米L1NaCl比200毫米长1NaCl（图3b）。在根中，SsCHLAPX的转录水平随着处理时间而增加，如图3A。200mM/l的NaCl处理与400mM/l的NaCl处理相比，前者会使根部的SsCHLAPX转录水平更高。然而，400mM/lNaCl处理后SsCHLAPXmRNA水平均高于200mM/l的NaCl处理SsCHLAPXmRNA水平

16、，图3B。拟南芥转基因株系的鉴定31. 通过Northernblot（诺瑟杂交）分析验证，转基因拟南芥植物过表达ss.sapx和ss.tapx基因是在CaMV35S启动子的控制下产生的（图4）。在转基因株系的纯合单插入位点，SS.sapx-7/15（S-7，S-15）和SS.tapx-11/16（t-11,t-16）株系mRNA的积累相对野生型增加。因此,这四种株系(T3代)被分开独立传播进行进一步分析。转基因和野生型拟南芥在正常条件下生长不会产生表型和生长的区别。（数据未列出）Northernblot（诺瑟杂交）是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过Northernblot

17、（诺瑟杂交）的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。Northernblot（诺瑟杂交）首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。“Northernblot（诺瑟杂交）”这一术语实际指的是RNA分子从胶上转移到膜上的过程，当然它现在通指整个实验的过程。Northernblot（诺瑟杂交）在1977年由斯坦福大学JamesAlwine，DavidKemp和GeorgeStark发明。Northernblot（诺瑟杂交）ting实际上依照比它更早发明的一项杂交技术Southernblot（依

18、据生物学家EdwinSouthern名字来命名）来命名，Southernblot主要用来对DNA进行分析拟南芥过度表达S.SalsaCHLAPX可以增加其对强光的耐性强光照射对丙二醛含量的影响32. 脂质过氧化是细胞氧化损伤的一个指标,通过测定MDA的含量来确定强光照射对脂质过氧化的影响。在自然环境下，野生型和转基因型叶片中的MDA含量区别不明显（图5);在强光环境下，转基因株系中的MDA含量明显低于野生型植株的MDA含量。结果显著强光照射对拟南芥叶片叶绿体PSII光系统最大光能转换率的影响较小。33. 为了进一步研究SsCHLAPX在保护由强光引起的氧化胁迫中发挥的作用，我们测定了在正常环境

19、下野生型植株和转基因株系的最大光能转化率和叶绿素含量，结果显示野生型与转基因型的最大光能转化率和叶绿素含量区别并不明显（图6）。在强光环境下野生型和转基因型的最大光能转化率和叶绿素含量都下降了，但是转基因型明显高于野生型（显著）。叶绿素的含量类似Fv/Fm(Table1)。在强光照射下，转基因株系t11,t16ands15的叶绿素a、b及叶绿素a/b的比率均高于野生型。强光照射对拟南芥叶片中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、抗坏血酸过氧化物酶的影响34.在正常光照下，转基因和野生型拟南芥中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、抗坏血酸过氧化物酶的活性差异极小（图7A,B,D,E），但是转基因株系的APX活性明

20、显高于野生型（图7C,F)。在用强光处理后，转基因和野生型植株中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、抗坏血酸过氧化物酶的活性都会明显下降，但是Ss.sAPX和Ss.tAPX过表达的株系下降程度明显低于野生型。有趣的是,插入的抗氧化酶基因在环境胁迫下其活性增强。强光对叶片中过氧化氢水平的影响35.所有的实验株系在用强光处理后，都会抑制其抗氧化酶活性并伴随过氧化氢水平的升高（图8）。然而，DAB染色在过表达株系中颜色较浅，表明SsCHLAPX过度表达可以缓解由强光引起的过氧化氢累积。DAB染色法也叫二氨基联苯胺法，用于检测细胞中过氧化物酶的活性部位。原理：细胞颗粒中的过氧化物酶，能将过氧化氢中的氧释放出来

21、，氧化二氨基联苯胺（DAB），形成金黄色沉淀而定位于过氧化物酶活性的部位。讨论36. 当植物处于光照下时，叶绿体中的氧化压力远高于其他细胞器的氧化压力。因此，叶绿体被认为是产生超氧自由基和过氧化氢的主要部位(Davletovaetal.2005)。抗坏血酸过氧化物酶是叶绿体中清除过氧化氢的主要酶(Asada1992)。在一些植物中，叶绿体中抗坏血酸过氧化物酶的水平不因环境胁迫而发生变化（Yoshimuraetal.2000）。例如，菠菜在应对干旱、高盐度、脱落酸时，其叶片中的sAPXandtAPX转录水平不发生变化。在水稻幼苗的叶子中，虽然盐处理会使基质APX上升，但是会使类囊体APX下降(K

22、imetal.2007)。37. 为了进一步研究盐地碱蓬叶绿体APX是否对强光引起的胁迫具有保护作用，我们克隆了CHLAPXs使其在拟南芥中过表达（图2）。融合蛋白（Ss.tAPX+GFPandSs.sAPX+GFP）完全位于叶绿体中。此外，印迹分析表明在过表达Ss.tAPXandSs.sAPX的拟南芥株系中mRNA的积累远高于野生型（图4），并且转基因植株叶片提取物中APX的活性明显高于野生型（图7）。这些结果说明Ss.CHLAPX位于转基因拟南芥的叶绿体并且已表达。38. 有趣的是Ss.tAPXcDNA和Ss.sAPXcDNA氮端的378个氨基酸完全相同，而炭端的49个氨基酸不同。这表明，

23、盐地碱蓬中有一个基因编码叶绿体apxs。3端替代处理由于替代多聚腺苷酸化和剪接产生两种成熟mRNA。SsCHLAPX同工酶有转运肽组成，在其N-末端约64个残基。SsCHLAPX同工酶的氮端有一个转运肽包含约64个残基。未完待续39. 氨基酸序列的同源性分析表明,兼性盐土植物M.crystallinum的CHLAPX和SsCHLAPX序列很相似（图1）。M.crystallinum是一种盐土植物，其叶子和茎在盐胁迫下会形成盐膀胱。特别是,在盐碱和干旱等环境压力光合作用将从C3途径转为CAM途径（景天酸途径：植物特别适应于干旱地区，其特点是气孔夜间张开，白天关闭。夜间二氧化碳能够进入叶中，也被固定在C4化合物中，与C4植物一样。白天有光时则C4化合物释放出的二氧化碳，参与卡尔文循环），这使其可以在干旱和盐碱环境下生存。这些结果表明植物在压力-例如盐碱胁迫下盐碱植物SsCHLAPXs较非盐碱植物SsCHLAPXs具有更高的清除过氧化氢能力，但是综合分析，还需要进一步的研究，包括酶的性质、基因表达的模式、ROS维持平衡之间的联系。40. 在这项研究中我们假设SsCHLAPXs在拟南芥中的过表达可以缓解由强光照射引起的氧化损伤。在强光环境下，转基因植株较野生型植株表现出较低的氧化损伤，而且转基因株系MDA含量低于野生型，而叶绿素含量和最大光化