生物化学修正

1、生物化学结课论文题目：淀粉中提取总糖及还原糖的研究授课教师：斯琴格日乐11学院：化学与化工学院11专业班级：应用化学1402学号：3114130302191111姓名： 米 强1111成绩： 11111中文摘要本次试验的主要目的是为了掌握还原糖和总糖的测定原理，学习使用比色法测定还原糖的方法。为了确保食盐的准确进行，我们设计采用3,5二硝基水杨酸法进行比色法测定。主要是通过在NaOH和丙三酮存在作用下，3,5二硝基水杨酸与还原糖共热后生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物程橘红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品

2、中的含糖量。 最后在试验中，我们如愿地获取了较为准确的实验数据。并且通过实验数据的处理，绘制了葡萄糖标准曲线以及计算得出糖含量。关键词：多糖、还原糖、分离、纯化目录前言.4第1章 概论.5第2章 总糖及还原糖提取分离与纯化方法的研究.6第3章 实验部分.7第4章 结论与展望.10致谢.14参考文献.14前言总糖具有还原性，在一定条件下能够水解成为还原糖。本文通过对多糖的分离、纯化以及含量测定对于天然植物中的有效成分的研究具有极其重要的作用。在生物抗氧化性、生物免疫活性、生物抗肿瘤活性、生物降血糖活性等生物制药方面有机器中演的作用。本文主要的实验方法是通过3,5二硝基水杨酸法进行比色法测定样品中

3、的还原糖含量。3,5二硝基水杨酸与与还原糖共热水解后被还原生程氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈橘红色，在540nm出有最大吸收，利用比色法可测定淀粉中总糖和还原糖含量。概论多糖(polysaccharide)是由醛糖和酮糖通过糖苷键连接而成的高分子聚合物，分子结构庞大且复杂。多糖在自然界分布极广，广泛存在于高等植物、动物细胞膜和微生物细胞壁中，有的是构成动植物骨架结构的组成成分，有的作为动植物储藏的养分，有的具有特殊的生物活性。根据原料来源的不同，可分为植物、动物和微生物多糖，其中研究较多的是植物和微生物多糖。根据组成单糖种类的不同，可分为同多糖和杂多糖。由一种多糖分子缩合而成

4、的称为同多糖，如淀粉、糖原、纤维素；由不同类型单糖分子缩合而成的称为杂多糖，如透明质酸。根据溶解性不同，可分为酸溶性、碱溶性和中性多糖。根据是否有生物活性，又分为活性多糖和膳食纤维，膳食纤维包括胶体物质、纤维素和半纤维素等。多糖具有多种生物活性，如：增强免疫、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗感染、抗病毒、抗辐射、降血糖、降血脂、治疗艾滋病等。因此，多糖在食品、化妆品和医学等领域得到非常广泛的应用。目前，从生物体中已经分离出很多种多糖，包括菜籽、竹叶、桑椹、枸杞、人参、黑木耳、鲍鱼及青蛤等多糖。通过多糖的分离、纯化以及含量测定对于天然植物中的应用又极其重要的影响。有利于生物制药的进一步发展，而且还能够

5、协助广大农村山区发展具有特色的药材原料产业帮助广大农民脱贫脱困。不仅能够寻找到更多有效的药品还能够拓宽地方经济发展的新方向。总糖及还原糖提取分离与纯化方法的研究 多糖是极性大分子化合物，易溶于水，不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂。在提取之前，先要根据提取部位和存在方式的不同，采取合适的预处理方式。动物和微生物多糖多有脂质包围，一般需先用乙醚脱脂。植物细胞壁一般比较牢固，在提取前需进行破细胞操作，包括机械破碎（研磨法、压榨法、组织捣碎法、冻融法、超声波法、微波法）、溶胀和自胀、化学处理和生物酶降解等。多糖大多是通过氢键及基团的相互作用聚合在一起。因此，若要提取多糖，就必须以有效方法破坏糖链与其他物质的

6、共价结合。多糖的常用提取方法主要有：热水法、酸法、碱法、酶法、超声辅助、微波辅助及超临界流体萃取提取法等。热水浸提是提取多糖的最传统方法，主要是借助热力作用，使细胞原生质发生变化，导致质壁分离，水进一步渗透到细胞质和细胞壁中，溶解液泡中的物质，使之穿过细胞壁，扩散到溶液中。同时，细胞内和细胞间的物质通过扩散作用渗出并且由于多糖在强酸、强碱条件下，结构易遭受坏，影响其生物活性，所以提取剂多采用弱酸或弱碱溶液。通过相互比较选择3，5-二硝基水杨酸法（DNS法）来测定糖含量这是由于3，5-二硝基水杨酸法（DNS法）在碱性条件下，DNS与还原糖加热后被还原成橘红色氨基化合物，然后比色测定糖含量。该法可

7、测定还原糖和总糖含量，并可通过多糖=总糖还原糖，粗略获得多糖含量。相比之下，该方法具有操作简便、快速、灵敏度高、杂质干扰较小等优点 1-9 。“DNS法测定植物组织中还原糖及总糖含量”实验涉及了一些基本的生物化学实验技能，如组织捣碎（或研磨）、离心技术、定容操作、比色测定及标准曲线绘制等。该实验能有效提高学生的基本操作技和动手能力，同时能将理论知识与实际应用很好地结合在一起。多糖的分离纯化就是把蛋白质、色素等非多糖姐分除去，并通过多糖的分级和纯化，获得单一的多糖組分。在植物体和动物体中，多糖与蛋白质结合存在。在多糖的提取过程中，不可避免提取物中含有部分蛋白质及其他杂质如低聚糖、色素、无机盐类成

8、分，实验往往要运用各种方法除去这些杂质，才能对多糖的结构及功能进行更深层次的研究。法、大孔树脂法、氯己酸法、季钱盐沉淀法、聚酷胺法、揉酸法、等是去除多糖粗提取物中蛋白质的常用方法。实验部分【试剂和器材】1、试剂 3,5二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取 6.5g DNS 溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入 1000ml 容量瓶中，加入 2mol/L 氢氧化钠溶液 325ml，再加入 45g 丙三醇，摇匀，冷却定容至 1000ml。葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖 200mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至 100ml，即含葡萄糖为 2.0mg/ml。6mol/L HCl：取 250ml

9、浓 HCl（35%-38%）用蒸馏水稀释到 500ml , KII 2 溶液：称取 5g 碘，10g 碘化钾溶于 100ml 蒸馏水中6mol/L NaOH：称取 120g NaOH 溶于 500ml 蒸馏水中。0.1% 酚酞指示剂。2、材料:小麦淀粉或玉米淀粉。3、器材:721 型分光光度计，天平，锥形瓶，水浴锅，试管若干等。一、葡萄糖标准曲线制作 取 6 支 15mm×180mm 试管，按下表加入 2.0mg/ml 葡萄糖标准液和蒸馏水管号葡萄糖标准液/ml蒸馏水/ml葡萄糖含量/mgOD 值/540nm0.01.00.0010.20.80.20.11920.40.60.40.2

10、4930.60.40.60.30140.80.20.80.53551.00.01.00.629操作方法 ：在上述试管中分别加入 DNS 试剂 2.0ml，于沸水浴中加热 2min 进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水 9.0ml，摇匀，在 540nm 波长处测定光吸收值。以 1.0ml 蒸馏水代替葡萄糖标准液按同样显色操作为空白调零点。以葡萄糖含量（mg）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。二、样品中还原糖的提取 准确称取 0.5g 小麦（玉米）粉，放在锥形瓶中，先以少量蒸馏水(约 2 ml)调成糊状，然后加入 40ml蒸馏水，混匀，于 50恒温水浴中保温 20min，不时搅拌

11、，使还原糖浸出混和液。过滤，将滤液全部收集在 50ml 容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。三、样品总糖的水解及提取 准确称取 0.5g 小麦(玉米)淀粉，放在锥形瓶中，加入 6mol/L HCl10ml，蒸馏水 15ml，在沸水浴中加热 0.5h，取出 12 滴置于白瓷板上，加 1 滴 I-KI 溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解完毕，冷却至室温后加入 1 滴酚酞指示剂，以 6N NaOH 溶液中和至溶液呈微红色，并定容到 100ml，过滤，取滤液 10ml 于 100ml 容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释 1000 倍的总糖水解液，用于总糖测定。四、样品

12、中含糖量的测定 取 7 支 15mm×180mm 试管，分别按下表加入试剂：项目空白还原糖总糖H 2 O/ml1000000样品溶液/ml01111113,5-二硝基水杨酸试剂/ml2222222OD 值/540nm00.0080.0110.0120.1270.1150.163 加完试剂后，于沸水浴中加热 2min 进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水 9.0ml，摇匀，在 540nm 波长处测定光吸收值。测定后，取样品的光吸收平均值在标准曲线上查出相应的糖量。式中：C还原糖或总糖提取液的浓度，mg/ml；V还原糖或总糖提取液的总体积，ml；m样品重量，g；1000mg 换

13、算成 g 的系数。结论与展望实验结果 通过实验获取了有效的数据通过控制变量的方法，按照实验设计的歩骤以及预先制定好的各试剂的添加量添加药剂，并且测得其相应的OD值并且通过获取的数据绘制了葡萄糖标准曲线，根据公式计算出了其糖含量。1、葡萄糖标准曲线前景展望多糖是一类能够控制细胞分化、调节细胞生长衰老、增强机体健康的非特异性广谱免疫调节剂，广泛参与细胞识别、生长、分化、代谢、癌变、病毒感染、免疫应答等活动，具有提高免疫、抗衰老、抗氧化、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗疲劳、抗辐射、抗病毒、保肝和抗炎等多种生物活性，是现代食品化学和医学共同关注和研究的焦点。  1、抗氧化性 

14、 机体在生命活动的氧化代谢过程中不断产生各种氧自由基（ROS），如过氧化氢、羟基自由基和超氧阴离子自由基等。活性氧自由基被认为是造成生物体衰老和死亡的主要原因。当机体处于过氧化状态时，其自身的抗氧化体系不足以使机体完全得到保护。为了保护机体免受来自自由基的破坏，需要提供适当的抗氧化剂，尤其是无毒的天然抗氧化剂，如多糖。有研究证明，竹叶、灵芝、人参、猴头菌丝及鲍鱼等多糖能有效地清除氧自由基和羟基自由基，具有明显的抗氧化作用。 2、免疫活性   淋巴细胞增殖是细胞和体液免疫活性增强的体现。体外刀豆素 A（ on A）和脂多糖（LPS）诱导

15、脾淋巴细胞增殖，可分别作为评价 T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞活性的方法。许多药理学实验证明，多糖不仅可以激活 T、B 淋巴细胞、自然杀伤细胞（NK）、巨噬细胞、细胞毒细胞（CTL）、淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）等免疫细胞，还能促进细胞因子的生长，激活补体系统，进而促进抗体产生，对免疫系统发挥多方面的作用。  研究发现，菜籽粗多糖可使小白鼠的胸腺指数和脾脏指数增加，吞噬细胞的吞噬能力得到显著增强，对小白鼠因绵羊红细胞（SRBC）引起的迟发型过敏反应有明显促进作用。此外，还能促进小白鼠溶血空斑、溶血素抗体和 B&#

16、160;细胞抗体的生成。在体外，菜籽粗多糖能增强脾脏淋巴细胞的增殖能力。蜜环菌多糖能增强小鼠的免疫活性，随着多糖剂量的增加，刀豆素 A 和脂多糖诱导脾淋巴细胞增殖的活性越强3、抗肿瘤活性   中药及其有效成分是通过多靶点、多途径和多环节来防治肿瘤的，其作用机理包括调节机体免疫功能、抑制肿瘤血管生长、诱导肿瘤细胞分化和凋亡、调节肿瘤细胞信号传导、抑制端粒酶活性和细胞毒作用等。目前，研究已证实枸杞、茯苓、银耳、人参及香菇等多糖具有显著的免疫增强和抗肿瘤作用。多糖对机体细胞无直接的细胞毒作用，这是它不同于其它细胞毒性抗肿瘤药物的优点之一。平菇多糖的细胞毒性试验

17、显示，纯化后的平菇多糖有很强的抗肿瘤活性，且对人体脾293 T细胞没有影响，说明其对非癌细胞没有毒性。 4、降血糖活性   高血糖是糖尿病2型的主要病理特征之一。随着对多糖生物活性的大量研究发现，许多多糖对正常小鼠或高血糖小鼠有降血糖作用，有的多糖通过刺激胰岛素的分泌，促进血糖转化成糖原。从乌头、紫草、双蕙黄麻、冬苍术中提取得到的多糖，都对正常小鼠血糖有下降作用，下降量与多糖剂量呈正相关，其中有些对四氧嘧啶小鼠有明显降血糖作用。研究发现，从Tremellaaurantia 果肉中提取得到的一种水溶性酸性多糖，对正常小鼠和两种糖尿病模型小鼠均有明显的降血糖

18、作用。  5、降血脂和降血清胆固醇活性   血清胆固醇和甘油三酯含量是高血脂症的重要指标。研究发现，膳食高脂肪的小鼠往往与身体退行性疾病相关联。竹叶多糖能显著的降低实验动物血液中甘油三酯和总胆固醇浓度，升高高密度脂蛋白（HDL）和降低低密度脂蛋白（HDL）浓度。另外，竹叶提取物降血脂作用与银杏提取物相当。南瓜多糖水溶液能改善脂质代谢，降低血脂。6、多糖的其它活性   此外，多糖还具有益生元、抗疲劳、抗辐射、抗病毒、保肝和抗炎等活性。Chi 等研究发现，绞股蓝纯化多糖具有显著的抗疲劳活性。枸杞多糖能增强抗辐射作用，显著促进遭辐射损伤小鼠的免疫功能恢复。冬虫夏草多糖可以治疗慢性乙型肝炎，在保肝和抗病毒等方面发挥作用，取得较好的效果。喇叭多糖含量分析方法有直接测定法和分光光度法两种。裴会鹏通过蔥丽一硫酸显色法测定参暮的多糖含量。包志华采用，二硝基水杨酸比色法（法）测定巧莫子多糖的含量，实验葡萄糖为对照品，最大吸收波长为，方法精密度高、重现性好，能够有效进行薪寞子质量控制研究。 致谢及参考文献致谢：