耐高温α-淀粉酶的研究进展

1、耐高温a 淀粉酶的研究进展试验研究耐高温oc.淀粉酶的研究进展王楠,马荣山(沈阳农业大学，沈阳110161)摘要:耐高温一淀粉酶是重要的工业用酶制剂之一，本文介绍了耐高温一淀粉酶的 分子结构特点和催化机理及其研究进展.关键词:耐高温一淀粉酶;分子结构;催化机理;随机突变中图分类号ts201.2+5文献标识码:a文章编号:10062513(2007)04009003ad vancesinstudyonthermostable-amylasewangnan,marong-shan(shenyangagricuhraluniversity.shengyang 110161)abstract:high

2、thermostableamylaseisaimportantenzymethatisusedwidelyinindustrialprocesses.thisreview provideinformationaboutthemolecularstmctureofthethermostable一amylaseandcatalyticmechanism.andprovide alsoinformationabouttherecentprogress.keywords:thermostableamylase;molecularstructure;catalyticmechanism;randommu

3、tagenesis0【一淀粉酶(0 -amylase)广泛地存在于动植物和微生物中，它是一种内切葡萄糖昔酶，按酶委会(enzymecommission)的标准为 ec，是指类作用于淀粉分子,从分子内部切开ot 1,4键，牛成糊精和还原糖的水解酶，产物的末端葡萄糖残基c1碳原子为ot构型，故称0【一淀粉酶.0淀粉酶是目前最重要的工业酶制剂之一， 在味精，饴糖，葡萄糖，酒精，啤酒，乳酸，柠檬酸等 工业中发挥着巨大作用当今广泛使用的酶制剂 始于1906年人类发现了用于液化淀粉牛产乙醇的 细菌淀粉酶，首先应用于工业的0【一淀粉酶是来自 于真菌的.但是，由于一些细菌0【一淀粉酶具有耐 高温

4、，耐酸，耐碱等特性，更符合工业生产屮的各 种极端条件,因此,0前在需高温的发酵等工业中 收稿日期:20061220作者简介:王楠(1982 )，女，硕士研究生在读.使用的最为广泛的是细菌0【一淀粉酶，尤其是来自 杆菌(如解淀粉芽孑包杆菌和地衣芽孑包杆菌)的耐高 温ot 一淀粉酶已占据相当大的市场.1耐高温淀粉酶的种类耐高温ot 一淀粉酶按来源分为古菌ot 一淀粉酶 和真细菌0【一淀粉酶;他们的最适作用温度在60°c 以上一般古菌来源的ot淀粉酶较真细菌能够 耐受更高的温度许多古菌能够在各种极端的条 件下牛存,如高温，高渗，强酸强碱等，维持他们牛 命活动的很多蛋白质也是适应其生存环境的

5、，因 此，耐高温ot 一淀粉酶也有很多是来自古菌的.以 下列出部分耐高温仅一淀粉酶的性质.表1耐高温淀粉酶的种类2耐高温淀粉酶的分子结构根据x一射线衍射等技术得知的或由基因序列推算出的耐高温0【一淀粉酶的分子量大多在4o60kd之间,有的以单体形式存在，有的以二聚体存在通过对己知结构的细菌ot 一淀粉酶的氨基酸 序列比对发现，他们都含有四个保守区.大部分 细菌一淀粉酶都需要有ca的存在才能发挥催 化活性，而来自于古细菌pyrococcusfuriosus的嗜热 ot 淀粉酶(pfa)则无需另外添加钙离子它们的 二级结构是常见的0【一螺旋,p 折叠,p转角等， 这些二级结构元件排列堆积成有催化活

6、性的三级 结构.虽然各种来源不同的一淀粉酶的一级结 构不同，有的完全-致的氨基酸不足30%(如 rococcuswoesei 与 bacilluslichenrmis 的一致性为 29%)j,但它们的三级结构却极其相似，这也表 明三级结构是催化活性的关键因素.这些三级结 构都显示出一个共同的特点，即由三个结构域组 成，以 baciuuslicheniformisot一amylase(bla)为例， 如图1j,结构域a是由8个0【螺旋和8个13折 叠交替组成的b桶状结构，形成一淀粉酶的中 部,约包含280个氨基酸残基，这是一个较为刚性 的区域，维持酶的基本构彖结构域b位于结构 域a的第三个ot

7、一螺旋和第三个b 一-折叠之间，它 的二级结构主要是一个或几个13层这种结构能 产生较大的柔性，推测它可能与底物特异性结合 有关,结构域b所包含的残基数因不同来源的0【一 淀粉酶有较大差异，如bla约包含100个,pfa含 58个，但它们的三级结构都是13层和松弛的无规 则卷曲.0【一淀粉酶的催化活性口袋位于结构域a 和b之间，在b桶状结构的底部,这与其它拥有 这种结构域的酶的活性中心位置相似已知结构 的0【一淀粉酶在结构域a和b z间都有一个或几 个钙离子及其他金属离子结合位点，推测它可能与 稳定酶的结构有关结构域c构成一淀粉酶的碳 端，由反平行13层组成，它包含的氨基酸少，距离活 性位点远

8、，缺乏柔性，目前它的功能尚不清楚.a图1淀粉酶三个结构域将一级结构和三级结构的特点对应起来研究，一级结构显示出的4个保守区分别位于结构域 a的第3个，第4个，第5个13 折叠以及第7个13 折叠和第7个0【一螺旋之间，这些保守区构成催化 活性中心和对活性起调节作用.保守区i位于第 3个13 折叠的碳端，包括3个保守的氨基酸： asplo0,asnl04,hisl05,保守区 ii 位于第 4 个 13 折叠，包括两个保守的氨基酸:asp231 ,arg229,保 守区iii位于第5个13 折叠的碳端，只有一个完全 保守的氨基酸g1u261,保守区iv位于第7个b 折 叠和第7个0【一螺旋的连接

9、处，这一区域完全保守 的氨基酸是asp328,而327位经常是his.随着一淀粉酶微观知识的不断丰富，我们可 以了解酶催化的作用机理，包括其活性位点，作用 方式，构象变化等，这些都是酶促反应宏观现象的 基础，3淀粉酶的催化机理目前公认的0【一淀粉酶的催化机理如图2所 示,催化中心位于a/13桶状结构的底部,glu261 和asp231是起催化作用的两个重要残基. 整个催化过程可分三步:第一步，淀粉链中的 糖昔氧被质子供体g1u261质子化，第二步亲核基试验研究hohohiii一 oo图2ix淀粉酶的催化机理团asp231亲核攻击葡萄糖残基的cl,糖昔键断氨基酸突变如何导致酶宏观性质 的改变的解

10、释说裂,葡萄糖残基与asp231形成酯键，同时去质子法不一，这还有待进一步研究. 化状态的glu261夺取一个水分子h,产生一个 0h 一,第三步0h 攻击葡萄糖残基的cl,使酯键 断裂,glu261和asp231重新恢复初始状态.在已 知结构的一淀粉酶中，在b桶状结构的底部， 都含有glu和asp两个残基，它们的相对位置相 似，并口所有一淀粉酶的整体三维结构都很相 似，因此，它们的催化反应机理应该是相同或相近 的.以对一淀粉酶分子结构和催化机理的研究 为基础，通过各种手段改善酶的催化反应特异性， 使其更适合于在工业生产屮应用是近年來新兴的 发展趋势当传统的从环境中筛选和重组表达不 能满足工业

11、牛产需要时，基因水平上的改造便成 为许多科学家关注的热点.4淀粉酶的突变研究目前应用得最广泛的基因水平上的突变主要 有两种，随机突变和定点突变，有吋也将两种方法 结合使用随机突变采用首先构建突变文库，然后根据研究酶的特点设计高通量的筛选方法它 的优点是不必明确知道酶的三维结构，催化机理 等定点突变需要对酶的结构机理有较明确的认 识，它更适用于研究单个或多个位点对酶分子的 影响.将这些方法应用于一淀粉酶的研究已有定进展目前有关突变的研究大多针对于bla,如takase研究发现ash326lys/asp能够显着 改变bla的ph特性.nielsenje等对bla进 行定点突变，发现gln264se

12、r和asnl90phe能提高 bla的热稳定性.shawa等通过随机突变，得 到metl5thr能増强bla的稳定性,在此突变的基 础上，在进行随机突变，发现metl5,lllr和 asnl88ser使bla热稳定性提高两倍.但目前就 5淀粉酶的应用与展望耐高温一淀粉酶以其优良的性能广泛的应 用于柠檬酸，乳酸发酵，啤酒，酒精，昧精，淀粉糖 等工业领域，为了使它的性能更符合生产的需要， 许多研究者对其进行了深入的研究，从诱变育种 （如紫外，亚硝基弧，甲基磺酸乙酯）到构建基因工 程菌，再到基因突变技术，耐高温一淀粉酶的性 能得到了巨大的改善口前耐高温淀粉酶的 研究已经深入到基因体外定向进化和定点突

13、变阶 段，这主要是基于有关耐高温一淀粉酶微观分子 结构和催化机理研究的积累一淀粉酶是食品 工业中用量最大的酶类之一，也是生物技术应用 于食品工业的典例,生物技术与食品工业的紧密 结合,将是食品工业未来发展不可抵挡的趋势. 参考文献：1王镜岩，等生物化学(第三版)北京:高等教育出版社,2002,4112 |lindena,mayaso,meyerklauckew.differentialregulationofa hyperther一mophilicalpha一amylasewithanove|(ca,zn)two-metal centerbyzinc,jbiolchem,2003mar 14,

14、278(11):9875一843 machius,m.5declerck,n.,huber,r.activationofbacillusli? cheniformisalphaamylasethm u adisorder->onlcitransitionof thesubstratebindingsitemediatedbyacalcium?sodium?calcium metaltriad,structure, 1998mar 15 ;6(3): 281 一924 nielsenje,borcherttv.proteinengineeringofbacterialalpha一am? ylases,biochimbiophysacta,2000dec29;l 543(2):253一2745 k.takase.effectofmutationofanaminoacidresi