盐霉素联合脐血间充质干细胞干预对乳腺癌MCF-7细胞的影响及作用机制

1、www.CRTER.org吕文月，等. 盐霉素联合脐血间充质干细胞干预对乳腺癌MCF-7细胞的影响及作用机制盐霉素联合脐血间充质干细胞干预对乳腺癌MCF-7细胞的影响及作用机制吕文月1，王振宇1，郭 阳1，刘艳欣2(北京市延庆县妇幼保健院，1乳腺科，2保健科，北京市 102100)引用本文：吕文月，王振宇，郭阳，刘艳欣. 盐霉素联合脐血间充质干细胞干预对乳腺癌MCF-7细胞的影响及作用机制J.中国组织工程研究，2016，20(50):7543-7548.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.50.014 ORCID: 0000-0003-4168-3832(吕文

2、月)文章快速阅读：盐霉素联合脐血间充质干细胞干预对乳腺癌MCF-7细胞的影响吕文月，主治医师，主要从事乳腺方面的临床研究。中图分类号:R394.2文献标识码:B文章编号:2095-4344(2016)50-07543-06稿件接受：2016-09-17Western blot分析ABCG2蛋白的表达水平划痕愈合实验测定MCF-7细胞迁移能力CCK-8检测MCF-7细胞的增殖MCF-7细胞加入脐血间充质干细胞悬液和盐霉素脐血间充质干细胞干预能使乳腺癌MCF-7细胞的增殖能力、迁移能力得到抑制，与盐霉素联合干预后抑制作用更为显著文题释义：盐霉素：为一元羧酸聚醚类动物专用抗生素，对大多数革兰阳性菌和

3、各种球虫有较强的抑制和杀灭作用，不易产生耐药性和交叉抗药性，排泄迅速，残留量极低。乳腺癌：是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤。女性乳腺是由皮肤、纤维组织、乳腺腺体和脂肪组成的，乳腺癌中99%发生在女性，男性仅占1%。由于乳腺并不是维持人体生命活动的重要器官，原位乳腺癌并不致命；但由于乳腺癌细胞丧失了正常细胞的特性，细胞之间连接松散，容易脱落。癌细胞一旦脱落，游离的癌细胞可以随血液或淋巴液播散全身，形成转移，危及生命。摘要背景：间充质干细胞分泌的因子所形成的的微环境能够抑制肿瘤细胞的恶性增殖，而盐霉素也对肿瘤细胞生长有抑制作用。目的：探讨盐霉素联合脐血间充质干细胞干预对乳腺癌MCF-7细胞的影响及

4、作用机制，为乳腺癌的治疗寻找新的靶点和治疗策略。方法：选取对数生长的MCF-7乳腺癌细胞，将其随机分为对照组、脐血间充质干细胞组及联合组。对照组细胞不做任何处理，干预组加入脐血间充质干细胞悬液，联合组细胞同时加入脐血间充质干细胞悬液和盐霉素。结果与结论：干预48 h后，与对照组及脐血间充质干细胞组相比，联合组乳腺癌MCF-7细胞的增殖与侵袭能力抑制作用更为明显；细胞中POSTN蛋白的表达水平也较低。提示脐血间充质干细胞与盐霉素联合干预能有效抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖与迁移，为乳腺癌的治疗提出一种新的治疗方法。关键词：干细胞；移植；乳腺癌；MCF-7细胞；脐血间充质干细胞；盐霉素；增殖；迁移

5、；抑制主题词：乳腺肿瘤；肿瘤侵润；组织工程3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083Effect of salinomycin with umbilical cord blood mesenchymal stem cells in breast cancer MCF-7 cellsLv Wen-yue1, Wang Zhen-yu1, Guo Yang1, Liu Yan-xin2 (1Department of Breast Surgery, 2Department of Health Care, Maternity and Child Care Ce

6、nter of Yanqing County, Beijing 102100, China)AbstractBACKGROUND: Mesenchymal stem cells-released factors can form a microenvironment inhibiting malignant tumor cell proliferation, and moreover, salinomycin also inhibits the growth of tumor cells.OBJECTIVE: To explore the effect of salinomycin with

7、umbilical cord blood mesenchymal stem cells in breast cancer MCF-7 cells and its action mechanism, in order to seek a new target and therapeutic strategy to treat breast cancer. METHODS: Logarithmically growing MCF-7 cells were randomly divided into control, umbilical cord blood mesenchymal stem cel

8、l group and combination group. Cells in the control group were given no treatment, while those in the other two groups were given umbilical cord blood mesenchymal stem cell suspension or umbilical cord blood mesenchymal stem cell suspension combined with salinomycin, respectively. RESULTS AND CONCLU

9、SION: Forty-eight hours after the intervention, the proliferation and invasion of MCF-7 cells and expression of POSTN protein in cells were significantly reduced in the combination group compared with the other two groups. These findings indicate that the combination of umbilical cord blood mesenchy

10、mal stem cell suspension and salinomycin effectively reduces the proliferation and migration of MCF-7 cells, and this combined use provides a new insight into the treatment of breast cancer. Subject headings: Breast Neoplasms; Neoplasm Invasiveness; Tissue EngineeringCite this article: Lv WY, Wang Z

11、Y, Guo Y, Liu YX. Effect of salinomycin with umbilical cord blood mesenchymal stem cells in breast cancer MCF-7 cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(50):7543-7548.Lv Wen-yue, Attending physician, Department of Breast Surgery, Maternity and Child Care Center of Yanqing County, Beijing 1021

12、00, China7545ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction流行病学研究结果显示，中国乳腺癌的发病率逐年上升，每年约增加3%，发病高峰年龄为40-49岁，与欧美国家相比提前了10年1-2。美国癌症协会调查显示，目前乳腺癌的发病率已位居美国女性恶性肿瘤的第1位3-4。可见乳腺癌已严重威胁到女性朋友的生命健康。随着医疗水平的提高，对乳腺癌采用的手术、放疗、化疗、靶向治疗等综合治疗手段，已取得较好疗效，但对乳腺癌的复发和转移问题仍是目前治疗的难题之一5-6。间充质干细胞是一种具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，存在

13、于骨髓、脂肪组织、脐血及多种胎儿组织，可分泌多种细胞因子及生长因子，促进造血干细胞的增殖与分化。间充质干细胞还具有免疫调节、抗炎和组织修复作用，可减轻移植物抗宿主病及其他移植相关并发症7。体外实验发现，白细胞介素18基因转染后的间充质干细胞能够成功的靶向性到肿瘤细胞中，促进肿瘤细胞的凋亡8。另有研究发现，无基因修饰的间充质干细胞亦能够影响肿瘤细胞的增殖9。房敬超等10研究发现，间充质干细胞分泌的因子所形成的的微环境能够抑制肿瘤细胞的恶性增殖。盐霉素为一元羧酸聚醚类动物专用抗生素，对大多数革兰阳性菌和各种球虫有较强的抑制和杀灭作用，不易产生耐药性和交叉抗药性，排泄迅速，残留量极低4，11-12。

14、盐霉素不仅能杀死小鼠身上的乳腺癌干细胞，还能抑制新肿瘤细胞的生长，同时还能减缓已经存在的肿瘤的增殖速度13。实验拟将脐血间充质干细胞与盐霉素联合干预乳腺癌MCF-7细胞，为临床治疗乳腺癌寻找新的方法。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 随机对照细胞学实验。1.2 时间及地点 实验于2014年2月至2015年3月在北京实验动物研究中心完成。1.3 材料细胞株：人乳腺癌MCF-7细胞由于中国医科大学药理教研室提供。人脐血间充质干细胞由中国医科大学细胞生物学系实验室原代培养后冻存。1.4 方法1.4.1 乳腺癌MCF-7细胞的复苏 将冻存的MCF-7细胞投入40

15、-42 水中进行复苏，添加含体积分数10%胎牛血清的DMEM液，800 r/min离心5 min，弃上清液。细胞以DMEM重悬，接种细胞于25 cm2玻璃培养内，于37 、体积分数5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。1.4.2 脐血间充质干细胞培养 将冻存于液氮中的原代脐血间充质干细胞取出，于37 水浴中迅速融化， 800 r/min离心5 min，弃冻存液，采用含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基进行传代培养，根据细胞生长状况每3或 4 d换液1次，待细胞融合度为70%-80%时，用0.125%胰酶按13比例消化，传代。选择第3代人脐血间充质干细胞备用。乳腺癌MCF-7细胞干预及

16、检测使用的主要试剂与仪器：试剂及仪器来源DMEM培养基Invitrogen公司胎牛血清天津市灏洋生物制品科技有限责任公司PBS美国Promega公司胰蛋白酶美国Pharmacia公司CCK-8试剂盒上海酶联生物科技有限公司Western blot反转录试剂盒华美生物工程公司MMLV 试剂盒上海诗溪化工科技有限公司AMV反转录试剂盒大连宝生生物公司DAB显色液福建迈新生物技术有限公司POSTN鼠抗人单克隆抗体(浓度1100)北京赛百盛基因技术有限公司羊抗兔 IgG 抗体上海鑫乐生物科技有限公司恒温二氧化碳培养箱上海百典仪器设备有限公司超净工作台苏州安泰空气技术公司酶标仪上海永创医疗器械有限公司倒

17、置显微镜上海蔡康光学仪器厂凝胶成像系统上海精科公司1.4.3 细胞分组 取对数生长的乳腺癌MCF-7细胞(细胞浓度为1×1010-5×1010 L-1)，随机分为对照组、脐血间充质干细胞组及联合组。对照组细胞不做任何处理，干预组加入1 mL脐血间充质干细胞悬液(细胞浓度为1×107 L-1)，联合组细胞同时加入1 mL脐血间充质干细胞悬液(细胞浓度为1×107 L-1)和50 mg盐霉素。1.4.4 CCK-8检测 将各组乳腺癌MCF-7细胞按4 000个/孔细胞密度接种于96孔培养板上，加入200 L含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液，每组设有6

18、个复孔，空白组设为空白孔。每孔加入20 LCCK-8孵育4 h，以酶标仪检测490 nm处的吸光度值。1.4.5 划痕愈合实验 采用细胞划痕实验检测乳腺癌MCF-7细胞的迁移能力。收集3组细胞，以5×103个/孔的密度接种至6孔板，待培养的细胞形成细胞单层后，用移液枪头做“一”字型的划痕。每孔加入2 mL不含血清的DMEM培养液培养48 h，倒置显微镜观察细胞由划痕边缘向划痕中央迁移后剩下的距离，比较细胞迁移能力的变化。1.4.6 Western blot分析 人乳腺癌MCF-7细胞弃去上清，加入1 L的PMSF裂解液，摇匀置于冰上，裂解 30 min，PBS洗3次，提取总蛋白，采用

19、BCA法测定蛋白浓度。吸取50 g总蛋白，去离子水补至20 L，入等体积2×上样缓冲液，99 变性10 min。5%浓缩胶40 V衡压1 h，10%分离胶恒压60 V 3.5 h，湿转14 V恒压 14 h，37 摇床封闭2 h，分别加入11 000稀释的POSTN鼠抗人单克隆抗体4 过夜，TBST洗膜5× 5 min，洗膜后加入15 000 HRP标记的二抗及-actin，37 摇床孵育120 min。PBS洗2次，DAB显色，通过ECL法检测。经暗室用X射线曝光，结果用凝胶成像系统摄像，Image-Pro Plus 7.0软件分析，POSTN的相对表达水平以目的蛋白与-

20、actin的吸光度值表示。1.5 主要观察指标 MCF-7细胞的增殖、迁移能力以及细胞增殖POSTN蛋白的表达水平。1.6 统计学分析 采用SASS 19.0软件对数据进行统计分析，结果以±s表示，组间比较采用t 检验；计数资料采用2检验进行分析，P < 0.05为差异有显著性意义。2 结果 Results 2.1 MCF-7细胞和脐血间充质干细胞的形态 MCF-7细胞复苏后呈多边形贴壁生长，部分细胞形成悬浮细胞球样克隆，球体致密，紧实(图1A)。第3代脐血间充质干细胞为均一成纤维细胞样，呈漩涡状分布，细胞核清晰，边界清楚，细胞克隆呈集落状生长，胞体中央膨大(图1B)。2.2

21、MCF-7细胞的增殖 CCK-8法检测结果显示，干预48 h后，脐血间充质干细胞组乳腺癌MCF-7细胞增殖受到明显抑制，联合盐霉素作用后抑制作用更为明显 (P < 0.05；表1)。2.3 MCF-7细胞迁移能力 细胞划痕结果显示，干预 48 h后，与对照组相比，脐血间充质干细胞组细胞划痕愈合较为缓慢；与脐血间充质干细胞组相比，联合组细胞划痕愈合更为缓慢。提示脐血间充质干细胞干预后可以明显降低乳腺癌MCF-7细胞的侵袭能力，与盐霉素联合干预后MCF-7细胞的侵袭能力得到更明显的抑制(图2)。2.4 POSTN蛋白的表达水平 Western blot检测显示，干预48 h后，脐血间充质干细

22、胞干预后POSTN蛋白的表达较对照组明显下降，在联合盐霉素干预后，POSTN蛋白的表达水平呈现更明显的下调(P < 0.05；图3)。3 讨论 Discussion乳腺癌的浸润、迁移又是导致患者死亡的重要原因之一14。因此，对其浸润、迁移途径的抑制进行研究是 B A表1 盐霉素联合脐血间充质干细胞干预对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响 (±s，吸光度值)Table 1 Effect of salinomycin with umbilical cord blood mesenchymal stem cells on breast cancer MCF-7 cells表注：与对照组和

23、脐血间充质干细胞移植组相比，aP < 0.05。组别1 d 2 d 3 d 4 d对照组脐血间充质干细胞组 联合组 0.30±0.05 0.32±0.04 0.19±0.03a 0.47±0.020.40±0.03 0.25±0.01a 0.78±0.05 0.60±0.06 0.34±0.07a 0.86±0.030.75±0.050.45±0.02a 图1 MCF-7细胞和脐血间充质干细胞的形态(×400) Figure 1 Morphology of M

24、CF-7 cells and umbilical cord blood mesenchymal stem cells (×400)图注：图中A为呈多边形、悬浮生长的MCF-7细胞；B为第3代脐血间充质干细胞呈纤维形、漩涡状。对照组 脐血间充质干细胞组 联合组48 h 0 h图2 盐霉素联合脐血间充质干细胞干预对乳腺癌MCF-7细胞迁移能力的影响(×200) Figure 2 Effect of salinomycin with umbilical cord blood mesenchymal stem cells on the migration of breast can

25、cer MCF-7 cells (×200)图注：48 h后对照组细胞划痕已基本长满，联合组细胞划痕愈合明显变缓，脐血间充质干细胞组划痕愈合速度居中。对照组 脐血间充质干细胞组 联合组POSTN-actinPOSTN相对表达水平(与-actin吸光度死的比值)210对照组 脐血间充质干细胞组 联合组图3 盐霉素联合脐血间充质干细胞干预对乳腺癌MCF-7细胞中POSTN蛋白表达水平的影响 Figure 3 Effect of salinomycin with umbilical cord blood mesenchymal stem cells on POSTN protein exp

26、ression in breast cancer MCF-7 cells图注：与对照组相比，aP < 0.05；与脐血间充质干细胞移植组相比，bP < 0.05。aab目前乳腺癌研究工作中的重点及热点15-16。研究发现脐血间充质干细胞在肿瘤发生发展的过程中能够诱发多种反应，如抑制促进肿瘤新血管形成的基因表达，抑制肿瘤细胞克隆形成等作用17-19。Gupta等20研究发现，盐霉素具有抗乳腺癌干细胞的能力，其对降低乳腺癌干细胞比例的作用远远大于常规化疗药紫杉醇强的作用。有研究报道，盐霉素可以引起乳腺癌细胞生物学行为的改变21-24，作者利用脐血间充质干细胞联合干预后48 h后，乳腺癌

27、MCF-7细胞的增殖受到明显的抑制，侵袭能力也明显降低，而联合盐霉素作用后抑制作用更为明显，侵袭能力亦得到更显著的抑制，表明盐霉素可以降低乳腺癌细胞的增殖能力、能有效抑制乳腺癌的迁移，改善乳腺癌预后25-26。在乳腺癌转移过程中，乳腺癌细胞要经过一系列复杂的过程，方能够在转移灶形成转移癌。研究报道，乳腺肿瘤的发生发展受到乳腺癌微环境变化的影响27-28。改变微环境对乳腺癌的治疗有很大帮助。细胞外基质作为肿瘤微环境的重要组分，其发生异常性改变是肿瘤侵袭转移过程中的一个关键步骤29-34。实验研究表明，POSTN作为一种细胞外基质蛋白跟胚胎发育、炎症发生以及肿瘤发生发展有着密切关联。有研究报道，P

28、OSTN在小鼠肿瘤干细胞的维持和肿瘤转移过程中具有有重要的调节作用35-40。另有实验研究发现，基质蛋白在间充质干细胞功能调节中起着关键作用，其中POSTN蛋白被认为是肿瘤转移过程中的一个重要因素，设法抑制POSTN蛋白的表达可以阻断肿瘤干细胞启动肿瘤转移41。Western blot检测结果显示，脐血间充质干细胞干预后POSTN蛋白的表达较对照组明显下降，在联合盐霉素干预后，POSTN蛋白的表达量进一步显著下降，表明抑制POSTN蛋白的表达，可以影响乳腺癌MCF-7细胞的转移。综上所述，脐血间充质干细胞可以影响乳腺癌MCF-7细胞的生物学特性，但其具体机制尚未清楚，有待进一步深入研究。此外，

29、将盐霉素发展为治疗乳腺癌的一种新方法，对其药理作用、安全性、抗癌活性及毒性的研究将成为今后肿瘤研究工作中的重要任务和挑战。作者贡献：吕文月进行实验设计，所有作者共同完成资料收集与实验实施，实验评估及审校为吕文月和郭阳，吕文月和刘艳欣成文。利益冲突：所有作者共同认可文章内容不涉及相关利益冲突。伦理问题：实验未涉及到伦理问题。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁

30、，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4 参考文献 References1 尹宏达,谢振斌.盐霉素对乳腺癌干细胞作用的研究J.世界最新医学信息文摘(连续型电子期刊),2015(26): 142-143.2 赵月,沈娜,郭辉,等.盐霉素对乳腺癌细胞抑制的作用J.中华实验外科杂志,2013,30(6):1311-1312.3 孙秀梅,高峰,刘子凤.盐霉素对结肠癌干细胞特性的抑制作用J.山东大学学报(医学版),2013,51(9):40-44. 4 Lu Y, Ma W, Mao J, et al. Salinomycin exerts anticancer e

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