微生物与免疫学04 实验四 酶联免疫吸附实验 ELISA

1、实验五实验五 酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验免疫酶技术免疫酶技术 免疫酶技术是将免疫酶技术是将抗原抗体抗原抗体反应的特异性反应的特异性与与酶酶的高效催化作用有机结合的一种方法。的高效催化作用有机结合的一种方法。它以酶作为标记物，与抗体（或抗原）联结，它以酶作为标记物，与抗体（或抗原）联结，与相应的抗原（或抗体）作用后，通过底物与相应的抗原（或抗体）作用后，通过底物的颜色反应作抗原抗体的定性和定量，亦可的颜色反应作抗原抗体的定性和定量，亦可用于组织中抗原或抗体的定位研究，即酶免用于组织中抗原或抗体的定位研究，即酶免疫组织化学技术。疫组织化学技术。 目前应用最多的免疫酶技术是目前应用最多的免疫酶

2、技术是酶联免疫酶联免疫吸附实验吸附实验（ELISAELISA）。）。ELISA简介简介 1971年瑞典学者年瑞典学者 Engvall 和和Perlmann，荷兰学者，荷兰学者Van Weeman和和 Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为为酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验（ELISA） ELISA基本的实验过程基本的实验过程 包被包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载体表面，使抗原或抗体固相化固相载体表面，使抗原或抗体固相化 抗原抗体反应抗原抗体反应：先

3、后加入被检标本和酶结：先后加入被检标本和酶结合物，使之与固相抗原或抗体发生免疫反合物，使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固定应而被结合固定 酶促反应酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底：在反应体系中加入酶作用的底物，使发生酶促反应而显色物，使发生酶促反应而显色ELISAELISA检测抗原检测抗原 Ag +Ag + Ab Ab* * Ag-Ab Ag-Ab* *ELISAELISA检测抗体检测抗体 Ab +Ab + Ag Ag* * Ab Ab-Ag-Ag* *ELISAELISA检测抗体检测抗体( (间接法间接法) )Ag + Ab1 Ag-Ab1Ag + Ab1 Ag-Ab1Ag-Ab

4、1 + Ab2Ag-Ab1 + Ab2* * Ag-Ab1-Ab2 Ag-Ab1-Ab2* * 由于由于结合在抗原结合在抗原抗体复合抗体复合物上的荧光抗体显著多于直物上的荧光抗体显著多于直接法接法，从而提高了敏感性。，从而提高了敏感性。如细胞抗原上每个分子结合如细胞抗原上每个分子结合35个分子抗体，当此抗体个分子抗体，当此抗体作为抗原时又可结合作为抗原时又可结合35分分子的荧光抗体，所以和直接子的荧光抗体，所以和直接法相比荧光亮度可增强法相比荧光亮度可增强3或或4倍。此法除灵敏性高外，它倍。此法除灵敏性高外，它只需要制备一种种属间接荧只需要制备一种种属间接荧光抗体，可以适用于多种第光抗体，可以

5、适用于多种第一抗体的标记显示，这是现一抗体的标记显示，这是现在最广泛应用的技术。在最广泛应用的技术。 间接法比直接法灵敏间接法比直接法灵敏酶标板酶标板酶标仪一一 、ELISAELISA法间接法检测血清中法间接法检测血清中HBsAbHBsAb【实验目的【实验目的】1 1熟悉熟悉ELISAELISA的原理。的原理。2 2了解免疫标记技术的原理。了解免疫标记技术的原理。【实验原理【实验原理】采用采用纯化纯化HBsAg包被反应板，加入待测标本，包被反应板，加入待测标本，同时加入同时加入HBsAg-HRP。当标本中存在当标本中存在HBsAb时，就会形成时，就会形成HBsAg-HBsAb-HBsAg-HR

6、P复合物，加入复合物，加入TMB(四甲基联四甲基联苯胺苯胺 )底物产生显色反应，反之就无显色反应。底物产生显色反应，反之就无显色反应。将抗原将抗原HBsAg吸附于载体表面（厂家吸附于载体表面（厂家已经完成）已经完成）将待测血清加入，温育，将待测血清加入，温育，血清中如有血清中如有HBsAb，则抗，则抗原抗体结合原抗体结合加入酶复合物，加入酶复合物， (HBsAg-HRP),酶复酶复合物与表面抗体结合物与表面抗体结合合 加入酶的底物，酶加入酶的底物，酶与底物反应，显色与底物反应，显色二、二、ELISAELISA间接法间接法检测血清中检测血清中HBsAg 原理同检测抗体原理同检测抗体,但小孔底部包

7、被的为但小孔底部包被的为HBsAb 酶复合物为酶复合物为:HBsAb-HRP 当标本中存在当标本中存在HBsAg时，就会形成时，就会形成HBsAb-HBsAg-HBsAb-HRP复合物，加复合物，加入入TMB(四甲基联苯胺四甲基联苯胺 )底物产生显色反应，底物产生显色反应，反之就无显色反应。反之就无显色反应。【实验材料【实验材料】1 1乙肝病毒乙肝病毒HBsAgHBsAg（或（或HBsAbHBsAb）酶联免疫诊断）酶联免疫诊断试剂盒。试剂盒。预包被微孔条预包被微孔条（用纯化的单抗（用纯化的单抗-HBs-HBs或或纯化纯化HBsAgHBsAg包被）包被）酶结合物（多克隆抗酶结合物（多克隆抗-HB

8、s-HBs-HRP-HRP或或HBsAgHBsAg-HRP-HRP ）阳性对照阳性对照阴性对照阴性对照洗涤液洗涤液( (浓缩液，用前以蒸馏水稀释浓缩液，用前以蒸馏水稀释2525倍倍) )显色剂显色剂A A、B B（一般为四甲基联苯胺和（一般为四甲基联苯胺和H H2 2O O2 2 ）终止液（终止液（2 mol/L H2 mol/L H2 2SOSO4 4）。）。2 2微量加样器，吸水纸等。微量加样器，吸水纸等。 检测检测HBsAgHBsAg或或HBsAbHBsAb的反应条的反应条 酶标抗体酶标抗体阴性对照血清阴性对照血清阳性对照血清阳性对照血清洗涤液洗涤液显色液显色液(A,B)(A,B)ELI

9、SAELISA试剂盒包含以下各组分：试剂盒包含以下各组分： 待测血清待测血清1 1号、号、2 2号、号、3 3号、号、4 4号号 注意：待测血清是从医院采集的正常血清注意：待测血清是从医院采集的正常血清( (人为加进去乙肝表面抗原或者抗体人为加进去乙肝表面抗原或者抗体) )，但，但是并不表示血清中不含有可传染的疾病，是并不表示血清中不含有可传染的疾病，所以实验中要注意安全。所以实验中要注意安全。实验步骤实验步骤 每每4 4人一组，每组有检测人一组，每组有检测HBsAgHBsAg和检测和检测HBsAbHBsAb的的反应条各一条反应条各一条, , 每条含每条含6 6个反应孔。个反应孔。每组有每组有

10、2 2种试剂盒种试剂盒( (黄色测黄色测HBsAgHBsAg, ,粉粉红色测红色测HBsAbHBsAb),),黄色试剂盒用黄色反黄色试剂盒用黄色反应条应条, ,粉红色试剂盒用红色反应条。粉红色试剂盒用红色反应条。3 3、 检测方法检测方法每孔加待检血清每孔加待检血清50ul, 50ul, 每次实验各做每次实验各做1 1个个阴性阴性对照对照和和阳性对照阳性对照; ;本实验本实验空白对照孔空白对照孔不设，不设，前面讲台上有空白的反应条，可以作为空前面讲台上有空白的反应条，可以作为空白对照。白对照。注意：每位同学选择一种待测血清进行检测注意：每位同学选择一种待测血清进行检测（见下图）。（见下图）。阴

11、性阴性 阳性阳性 待检血清甲待检血清甲, ,乙乙, ,丙丙. .对照对照 对照对照 1 1号同学取待测血清号同学取待测血清1 1号号.阴性阴性 阳性阳性 待检血清甲待检血清甲, ,乙乙, ,丙丙. .对照对照 对照对照 1 1号同学取待测血清号同学取待测血清1 1号号2 2号同学取待测血清号同学取待测血清2 2号号 .2 2号同学取待测血清号同学取待测血清2 2号号 (2)(2)每孔加每孔加1 1滴酶结合物滴酶结合物 , , 充分混匀，充分混匀，3737孵育孵育30min30min (3)(3)甩弃孔内液体（在水池中甩弃，不要在甩弃孔内液体（在水池中甩弃，不要在实验室中随地甩弃）；实验室中随地

12、甩弃）； (4)(4)每孔加满洗涤液每孔加满洗涤液, ,静置静置1min, 1min, 甩干。甩干。 同同上洗涤重复上洗涤重复5 5次，拍干。次，拍干。(6)(6)每孔加显色液每孔加显色液A,BA,B各各1 1滴滴, ,充分混匀，置充分混匀，置373715min.15min.按以下方法按以下方法, ,进行肉眼观察结果进行肉眼观察结果: : 阴性阴性对照孔对照孔无色无色, ,阳性阳性对照孔对照孔蓝色蓝色; ; 待测孔待测孔显显蓝色蓝色, , 为阳性为阳性, ,否则为阴性。否则为阴性。(7)(7)加终止液（加终止液（本实验不加终止液）本实验不加终止液）4 4 结果记录及结论结果记录及结论阴性对照孔

13、阴性对照孔阳性对照孔阳性对照孔空白对照孔空白对照孔待测待测1 1待测待测2 2结果结果结论结论待测待测3 3待测待测4 4 HBVHBV属于嗜肝属于嗜肝DNADNA病毒科，是乙型肝炎的病病毒科，是乙型肝炎的病原体。原体。 在中国，在中国，HBVHBV感染或携带者已超过感染或携带者已超过1.31.3亿，亿，发病人数超过发病人数超过30003000万人。万人。HBVHBV基因组为双链基因组为双链环状环状DNADNA，其中有一个单链区。，其中有一个单链区。 HBVHBV的抗原组成由表面抗原（的抗原组成由表面抗原（HBsAgHBsAg）、核）、核心抗原心抗原(HBcAg(HBcAg) )和和e e抗原

14、抗原(HBeAg(HBeAg) )组成。组成。三种三种抗原具有其相应抗体：抗原具有其相应抗体： HBsAbHBsAb（抗表面抗（抗表面抗原抗体）、原抗体）、 HBeAbHBeAb （抗（抗e e抗原抗体）、抗原抗体）、 HBcAbHBcAb （抗核心抗原抗体）。（抗核心抗原抗体）。 HBsAgHBsAg为二聚体糖蛋白，大量存在于感染者血液中，为二聚体糖蛋白，大量存在于感染者血液中，为为HBVHBV感染的主要标志；感染的主要标志； HBcAgHBcAg存在于存在于DaneDane颗粒核心结构表面，为内壳成分，颗粒核心结构表面，为内壳成分，其外被其外被HBsAgHBsAg覆盖，不易在血循环中检出，

15、但能刺覆盖，不易在血循环中检出，但能刺激机体产生抗激机体产生抗-HBc-HBc，抗抗-HBc-HBc IgM IgM的存在提示的存在提示HBVHBV处处于复制状态；于复制状态； HBeAgHBeAg游离于血中，其消长与病毒体消长及游离于血中，其消长与病毒体消长及DNADNA多多聚酶消长基本一致，故聚酶消长基本一致，故HBeAgHBeAg为为HBVHBV复制及具有强复制及具有强感染性的一个指标；感染性的一个指标； HBeAgHBeAg刺激机体产生的抗刺激机体产生的抗- HBe- HBe能与受染肝能与受染肝细胞表面的细胞表面的HBeAgHBeAg结合，通过补体介导破坏结合，通过补体介导破坏受染肝细

16、胞，受染肝细胞，抗抗- HBe- HBe的出现是预防后良好的出现是预防后良好的象征。的象征。 HBVHBV的主要感染源是患者或无症状的的主要感染源是患者或无症状的HBsAgHBsAg携带者，通过血液、体液、母婴传播。携带者，通过血液、体液、母婴传播。 本实验只检测本实验只检测HBsAg及其抗体及其抗体HBsAbHBsAgHBsAg（本（本实验实验测）测）HBeAgHBeAg抗抗-HBs-HBs（本实（本实验测）验测）抗抗- -HBeHBe抗抗- -HBcHBc结果分析结果分析+ +- - - - -HBVHBV感染或无症状携带者感染或无症状携带者+ + +- - - -急慢性乙肝或携带者急慢性

17、乙肝或携带者+ + +- - -+ +“大三阳大三阳”急慢性乙肝患者（传染急慢性乙肝患者（传染性强）性强）+ +- - -+ + +“小三阳小三阳”急慢性乙肝感染，趋向急慢性乙肝感染，趋向于恢复于恢复- - -+ + + +既往感染恢复期既往感染恢复期- - - - -+ +既往感染或既往感染或“窗口期窗口期”- - -+ +- - -既往感染或接种过疫苗既往感染或接种过疫苗乙肝两对半检测的结果判断方法乙肝两对半检测的结果判断方法【注意事项【注意事项】1 1试剂盒应于试剂盒应于44存放，在有效期内使用。存放，在有效期内使用。2 2微孔条须密封防潮，从冷藏环境中取出时微孔条须密封防潮，从冷藏环境

18、中取出时, ,应在室温中平衡至潮气尽干后方可开封启用，余应在室温中平衡至潮气尽干后方可开封启用，余者及时封存。者及时封存。3 3滴加试剂前应将瓶摇匀，使液体混匀。滴滴加试剂前应将瓶摇匀，使液体混匀。滴加时瓶身应保持垂直，以使滴量准确，注意勿将加时瓶身应保持垂直，以使滴量准确，注意勿将试剂滴在孔壁上。试剂滴在孔壁上。4 4洗涤时各孔均须加满，防止孔口内有游离洗涤时各孔均须加满，防止孔口内有游离酶未能洗净。酶未能洗净。5 5待测标本不可用待测标本不可用NaNNaN3 3防腐。所有样品都应防腐。所有样品都应按传染源处理。按传染源处理。观看实验录像观看实验录像临床临床ELISAELISA测定中可能会出现的问题测定中可能会出现的问题及可能的原因及可能的原因 （非试剂盒本身的原因）（非试剂盒本身的原因） 1 1弱阳性样本检测不出弱阳性样本检测不出 温育的时间或温度不够；显色反应时间太温育的时间或温度不够；显色反应时间太短；所用配制缓冲液的蒸馏水有问题短；所用配制缓冲液的蒸馏水有问题 2 2测定的重复性差测定的重复性差 （相同样本两次测定结果不一致）（相同样本两次测定结果不一致） 这是典这是典型的由测定操作引起的问题，包括型的由测定操作引起的问题，包括