发酵工艺综合实习指导书-内容

1、发酵工艺综合实习指导书内容综合实验一土壤中稀有放线菌的分离和纯化及抗生菌的体外抗菌鉴定综合实验二玉米淀粉液化、糖化及酒精发酵综合实验三甜酒的酿造综合实验一土壤中稀有放线菌的分离和纯化及抗生菌的体外抗菌鉴定一 土壤中稀有放线菌的分离和纯化1实验目的了解采集土样的要求和方法，掌握由土壤中 分离稀有放线菌的基本原理和操作技术，学习并 掌握土壤稀释法和微生物的纯培养技术。2实验原理筛选放线菌是新抗研究的重要课题之一。迄 今为止，已发现的抗生素有80%皆来自于放线菌。 放线菌主要存在于土壤中，并在土壤中占有相当大 的比例。一般地，放线菌在比较干燥、偏碱性、含 有机质丰富的土壤中数量居多。通常，随着地理分

2、 布、植被及土壤性质的不同，放线菌的种类、数量和拮抗性也各不相同。土壤是微生物的大本营，其中的放线菌多以链 霉菌为主，因此人们通常将除链霉菌以外的其它 放线菌统称为稀有放线菌。若以常规方法进行分 离，得到的几乎全部是链霉菌。然而，当采用加 热处理土样、选用特殊培养基或添加某种抗生素 等方法时，均可提高稀有放线菌的获得率。由土壤中分离放线菌的方法很多，其中包括 稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本实验主 要采用稀释法，并通过选用特殊培养基的方法， 来获得少量稀有放线菌。3仪器和材料(1)培养基：葡萄糖天门冬素琼脂，精氨 酸琼脂，高氏1号琼脂，以上每种培养基皆用 500ml三角瓶分装2501111

3、。(2)灭菌物品：牛皮纸袋，培养皿，Imh 5ml吸管，250ml三角瓶分装90ml无菌水(含30 粒玻璃珠)，18 X 180mm试管分装9ml无菌水， 牙签，玻璃刮铲，18X180111111试管中分装10 ml 1%oK2cl207 母液。(3)其它：采土铲，细目筛，药勺，称量 纸，试管架，小天平，记号笔。4试验步骤(1)采土：选择适宜采样地点。用采土 铲去除表土，取510cm深处的土壤约150g左 右，装入无菌牛皮纸袋中，并注明采样日期、地 点、土壤类型、植被和采样人姓名等。(2) 土样预处理：新鲜土样应适当风干， 并喷施小剂量杀虫剂以防培养过程中虫卵发育 的影响。(3)制备平板：每组

4、取10套无菌培养皿， 将冷却至50c左右的各培养基，分别倒入平皿， 每皿约1520mL每种培养基中需加入20ppm的 K2Cr2O7溶液。在皿盖上注明培养基种类及组号。(4)制备土壤稀释液：每组称取10g 土样，放 入90ml无菌水中，得到十壤原液c手摇1520min 后，静置Imin。再用无菌吸管取1ml上清液，置于 9ml无菌水中，充分混匀，则得到10-2稀释液。依 此类推，制备10 3、1()-4稀释液(一般地，较肥的 土壤使用10- 310- 5稀释液，而瘦土则使 用KT?10- 4稀释液)。(5)铺平板：用1ml无菌吸管分别取0.1ml 10 一 310一5稀释液，置于培养基平板中央

5、。然后，再 用无菌的玻璃刮铲均匀涂布，静置lOmiiio每1稀释度3个重复，每1种培养基10套平板。并注 明各稀释度。(6)培养及观察：将各平板置于28c恒温箱 中倒置培养14天。要求分别在第2天、7天和14 天进行观察，并根据菌落大小、气生菌丝有无、 气生菌丝和基质菌丝的颜色及可溶性色素有无 等培养特征，选择单菌落放线菌进行纯培养，同 时在平板背面的相应位置上作好标记。(7)纯培养：及时将选定的单菌落接入高氏 1号琼脂斜面，每个菌株接1支斜面。必要时，中 间可加1次划线分离培养，然后再转斜面。5结果与讨论将实验结果填入下表。菌落特征鉴别培养基大小形态表面干湿颜色色索类型前萄糖天门冬素琼脂特赛

6、酸琼脂高氏1号琼脂思考题1、在分离土壤放线菌时为什么要选用多种培养 基？2、在培养基中添加KCr二O有何作用？二抗生菌的体外鉴别1实验目的了解抗生素产生菌体外筛选法的原理，学习 并掌握抗生菌的鉴别方法。2实验原理由土壤中分出的放线菌需进一步鉴别是否为需 要的抗生菌。首先应根据筛选目的确定试验模 型，然后利用培养基平板进行拮抗性测定。常用 的方法有琼脂块法和滤纸片法。其主要依据是扩 散原理，即观察在抗生菌周围是否会出现明显的抑 菌圈。抑菌圈的大小和透明度则表明了该菌株抗菌 活性的强弱。本实验选用了这两种方法。3仪器与材料(1)培养基：500ml三角瓶中分装300ml黄 豆饼粉琼脂，18X180i

7、iim试管分装4ml黄豆饼粉 浸汁，300nli三角瓶分装150ml细菌培养基， 1501111三角瓶分装501111马铃薯培养基。(2)试验菌：枯草芽泡杆菌(Bacillus subtilis )大肠杆菌(Escherichia coli )金黄色葡萄球菌(Staphlococcus aureus )第7页共62 页深红酵母(Ruodotomla nibra )(3)待测菌株：琼脂培养物：将融化的黄豆饼粉琼脂倒入无 菌培养皿，制成平板。用记号笔在平皿背面画一 直线，将平皿一分为二，分别注明待测菌株的编 号。并按照编号将待测菌株密集划线接入平板。 同法接入华美链霉菌(Streptomyces

8、splendens )和金霉素链霉菌(Streptomyces aureofaciens )作为对照菌，28下培养7天 发酵液：将待测菌株和对照菌分别接入黄豆饼 粉培养液，作好标记，28下振荡培养7天。(4)灭菌物品：培养皿，打孔器，镜子，圆 滤纸片，15 X 150imn试管分装5ml无菌水，1ml 吸管，无菌漏斗。(5)其它：接种用具，游标卡尺，记号笔， 摇床。4试验方法4.1 琼脂块法(1)分别取枯草芽抱杆菌、大肠杆菌和金 黄色葡萄球菌各1支,加入5nil无菌水 制成菌悬液，备用。(2)取9套无菌培养皿，向每套培养皿中分别加入1ml试验菌悬液，然后加入约12ml冷却至 45左右的细菌培养

9、基，迅速在实验台上摇匀， 制成指示菌平板。每1种指示菌3个重复，并注 明指示菌及测定菌株的位置。(3)用无菌打孔器将待测菌株和对照菌的 黄豆饼粉琼脂培养物切块，每种培养物9块。(4)用无菌接种针，将待测菌株和对照菌琼脂块分别移入各指示菌平板的相应位置上，菌 面朝上，间隔均匀摆放。(5)静置20min后，放入恒温箱，37下 培养 1824ho(6)用游标卡尺测量抑菌圈直径，并观察抑菌圈的透明程度和边缘整齐程度。4.2 滤纸片法(1)向深红酵母菌斜面中加入5nli无菌水， 制成菌悬液。(2)向已冷却至45°C左右的马铃薯培养基 中加入0.5ml深红酵母菌悬液，摇匀后，倒3个指 备用。示菌

10、平板,并在平皿背面标明测定菌株的位JUIMT <IWI(3)过滤各测定菌株的发酵液。(4)用无菌镒子取无菌的圆滤纸片，蘸取各测定菌株的发酵滤液，放入指示菌平 板的相应位置上，每1测定菌株3个重复。(5)静置20min后，28下培养2天。(6)用游标卡尺测量抑菌圈直径，并观察抑 菌圈的透明程度和边缘整齐程度。5结果将实验所得结果填入下表，抑菌圈直径以mm 来表示。抑曲圈巴径 (d)枯草芽抱杆菌123大肠杆菌123金黄色葡萄球 菌123深红酵母123待 测 菌 株12对菌 株华美链褥菌 金得素 链霉菌思考题1、为什么在移入琼脂块和滤纸片后不立即保温培养？2、抑菌圈小是否就意味着菌株的抑菌活性

11、差？为什么？实验进度安排第一天：设备准备，土壤采样, 培养基准备第二天：培养基准备，分离稀有放线菌体第三天：土壤稀释法和微生物的纯培养第四天：琼脂块法筛选，滤纸 片法筛选培养第五天：实验结果观察总结 报告撰写综合实验二玉米淀粉液化、糖化及酒精发酵1实验目的及要求要求学生掌握用酶法从淀粉原料到水解糖的制备原理及方法，淀粉水解糖酒精发酵方法。掌 握粗淀粉含量和还原糖、酒精含量的化学测定方 法。2实验原理发酵过程中，有些微生物不能直接利用淀 粉，因此，当以淀粉为原料时，必须先将淀粉水 解成葡萄糖，才能供发酵使用。一般将淀粉水 解第12页共62 页为葡萄糖的过程称为淀粉的糖化，所制得的糖液 称为淀粉水

12、解糖。发酵生产中，淀粉水解糖液 的质量，与生产菌的生长速度及产物的积累直接 相关。可以用来制备淀粉水解糖的原料主要有薯 类（木薯、甘薯）淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、大 米淀粉等，根据原料淀粉的性质及采用的水解催 化剂的不同，水解淀粉为葡萄糖的方法可分为酸 解法、酸酶结合法和酶解法。实验室中常采用酶 解法制备淀粉水解糖。酶解法是指利用淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖的过程。酶解法制葡萄糖可分为两步：第 1步是利用。-淀粉酶将淀粉液化为糊精及低聚糖, 使淀粉的可溶性增加I,这个过程称为液化；第 2步是利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解， 转 变为葡萄糖的过程，在生产上称为糖化。淀粉的 液化和糖化都是在酶的作

13、用下进行的， 故也称为 双酶水解法。利用酒精酵母将可酵糖转化为酒精 的过程称为发酵。2.1 酶法液化原理淀粉的酶法液化是以Q -淀粉酶为催化剂，该 酶作用于淀粉的。-1,4糖背键，从内部随机地水解淀粉，从而迅速将淀粉水解为糊精及少量麦芽 糖，所以也称内切淀粉酶。淀粉受到a-淀粉酶的 作用后，其碘色反应发生如下变化：蓝一紫一红 一浅红一不显色（即碘原色）。酶法液化以生产工 艺不同分为间歇法，半连续和连续式；液化设备 有：管式、罐式、喷射式。加酶方法有：一次加 酶、二次加酶、三次加酶。根据酶制剂的耐温性分 为中温酶法、高温酶法、或中温酶和高温酶混合 法。本实验采用：中温酶法，间歇式，罐式，二次 加

14、酶法。2.2 酶法糖化原理淀粉的糖化是以糖化酶为催化剂，该酶从非 还原末端以葡萄糖为单位顺次分解淀粉的a-1, 4糖昔键或a-1, 6糖昔键。因为是从链的一端逐 渐地一个个地切断为葡萄糖，所以称为外切淀粉 酶。淀粉糖化的理论收率：因为在糖化过程中， 水参与反应，故糖化的理论收率为111。（C6H 10O5）n+H2nC6H 120616218180淀粉糖化实际收率的计算：一糖液最（LN糖液葡萄糖含累：（） R痔市一Y100%投入淀粉量 原料中纯淀粉含量淀粉转化率：淀粉-葡萄糖转化率是指100份淀粉中有多少份淀粉被转化为葡萄糖。林化革=糖液易x糖液硒糖含戕（）-投入淀粉量X原料中纯淀粉含量X 1

15、.11淀粉转化率的计算：DE值：用DE值表示淀粉水解的程度或糖化 程度。糖化液中还原性糖以葡萄糖计，占干物质 的百分比称为DE值。还原糖含量（%）DE 值=x100%干物质含量（%）DE值计算：还原糖用裴林氏法或碘量法测定，浓度表 示：葡萄糖g/100ml糖液；干物质用阿贝折光仪测定，浓度表示：干物 质g/100g糖液。影响DE值的因素：糖化时间：最初糖化时，糖化速度快，DE值 显著上升；但2411后，当DE值达到90%以上 时，糖化速度显著放慢。液化DE值与糖化DE值的关系：液化程度应控制适当，太低或太高均不利。 原因是液化程度低，则粘度大，难操作；同时， 由于液化程度低，底物分子少，水解机

16、会少，影响糖化速度；液化程度低，易发生老化；但液化超 过一定程度，则不利于糖化酶与糊精生成络合结 构，影响催化效率，造成糖化液的最终DE值低。 故应在碘试本色的前提下，液化DE值越低，则糖 化液的最高DE值越高。一般液化DE值应控制在 12-18%。酶制剂用量与糖液DE值的关系：为加快糖化速度，可以提高酶用量，缩短 糖化时间。但酶用量太高，反而使复合反应严重， 最终导致葡萄糖值降低。在实际生产中，应充分 利用糖化罐的容量，尽量延长糖化时间，减少糖 化酶用量。2.3 酒精发酵原理以淀粉为原料，采用酸水解、酸酶结合水解 或酶水解方法，可以将淀粉转化为葡萄糖等可酵 糖。利用酒精酵母胞内的酒化酶系，葡

17、萄糖被转化为酒精即酒精发酵。以生产工艺不同，酒精发 酵可分为间歇式、半连续式、连续式过程，各种过 程又可以细分为多种形式。本实验采用酶法糖 化、一次添加间歇式方法进行酒精发酵。3实验仪器、设备和材料(1) 1000ml 烧杯(2)真空过滤装置(3)烘箱(4)量杯(5)量筒(6)分光光度计(7)水浴锅(8)滴定管(9)电炉(10)白瓷板(11)三角瓶(12)阿贝折光仪(13)玉米粉(14) a-淀粉酶(15)糖化酶(16) pH试纸(17)酒精活性干酵母（18）酒精蒸储装置及酒精计4实验步骤4.1 淀粉水解糖的制备4.1.1 淀粉的液化配制30%的淀粉乳，调节pH值至6.5,加入 氯化钙（对固形

18、物0.2%）,在3个1000ml烧杯中 分别加入淀粉乳700ml并分别加入液化酶12U/g淀粉、16U/g淀粉、20U/g淀粉，在剧烈 搅拌下，先加热至72C,保温15min,再加热至8090c （视酶的特性而定），并维持30min, 以达到所需的液化程度（DE值：15-18%）,碘反应 呈棕红色。液化结束后，观察液位，再升温至100,保持10-15min,以凝聚蛋白质，改进过 滤。记录液化时间。4.1.2 淀粉的糖化（糖化酶用量对糖化的影响）液化结束后，迅速将料液用盐酸将pH调至4.2 -4.5,同时迅速降温至60。将液化醪混匀后均分为3份，分别加入糖化酶320U/g淀粉、400U /g 淀

19、粉、480U/g淀粉，60保温,每隔2小时，取 样做酒精实验。当用无水酒精检验无糊精存在时， 即为糖化终点，记录糖化时间，同时将料液pH调 至4.8-5.0,并将料液加热至80,保温20mill.然后将料液温度降至60-70,开始过 滤。4.1.3过滤将烧杯内的料液冷却至60-70C；趁热采用真 空过滤（也可用滤布压滤），热水洗涤（60-70C） 滤饼；过滤结束后，洗净过滤的有关设备。量取糖 液体积；取样分析还原糖浓度。4.2酒精发酵421酒精酵母的活化：称取2g蔗糖，溶于 100ml经煮沸并冷却的水中，加入1g活性干酵母 于培养箱中30活化2hr,备用。4.2.2 清糖液发酵：将4.1方法制

20、备的淀粉水解糖 调整浓度为15%左右，于500ml三角瓶中加入该 糖液200ml,用无菌吸管取5ml活化酵母，摇 匀,密封三角瓶，置入培养箱中于32发酵24hr 后得到发酵成熟醪，蒸偏，测定酒精含量。4.2.3 混合醪发酵：（1）液化：称取2份各50g玉米粉，置于500ml 三角瓶中，混匀，记下液面刻度，加入a -淀粉酶（酶用量为4U/g淀粉原料）进行液化，得到糊化 醪。液化温度为85,液化时间为30min,然后冷 却至5860,保温。(2)糖化：在糊化醪中分别加入糖化酶200U/g 淀粉原料和400U/g淀粉原料，在5860保温糖 化3Omin得到糖化醪。(3)发酵：将糖化醪冷却至30,用无

21、菌吸管 接入活化酵母液5ml,摇匀，密封容器，置入培 养箱中于32发酵50hr左右后得到发酵成熟 醪，蒸镯，测定酒精含量。5实验分析项目和方法5.1 淀粉原料含水量的测定5.1.1 原理样品中的水分受热后产生的蒸汽压，高于空 气在电热干燥箱中的分压，水分便从样品中挥发 出来。样品干燥的速度取决于这个压差的大小，在 此条件下失去的主要是试样中的游离水。试样的 水分一般是指在100左右直接干燥的情况下，所 失去的总量。在此条件下失去的重量不仅是水 分，还有微量的挥发性物质。5.1.2 仪器与设备(1)分析天平(2)称量瓶(3)干燥器(4)电热恒温干燥箱5.1.3 测定步骤准确称取约2克试样，置入经

22、100-105 干 燥恒重后的称量瓶中，在100-105烘箱中干燥 3-4小时，取出，置入干燥器中冷却至室温，称 重。再于相同温度下干燥1小时左右，同上操作， 直至恒重。计算W -W水分（%） =-12XJOO%Wi -Wo式中 W o：称量瓶重（g）W 1：干燥前试样与称量瓶重（g） W 2：干燥后试样与称量瓶重（g） 5.1.4说明（1）原料的水分测定一般需采用100-105C烘箱 中直接干燥，其结果较为准确。对生产过程中的 水分快速测定，可采用更高温度下干燥（如 120-140C）或红外灯下干燥，以缩短分析时间。（2）测定水分时，称量恒重指试样连续两次 干燥后，称量之差不超过2mg。5.

23、2 淀粉原料中粗淀粉含量的测定5.2.1 原理淀粉经酸或水解生成葡萄糖：酸或酶(C6H10O5)n+nH2OnC6Hl2。6所生成的葡萄糖用斐林试剂测定。斐林试剂由甲、乙液组成。甲液为硫酸铜溶液， 乙液为氢氧化钠与酒石酸钾钠溶液。平时甲、乙液 分别贮存，测定时甲、乙液等体积混合。混合时， 硫酸铜与氢氧化钠反应，生成氢氧化铜沉淀：2NaOH+CuSO 4=Cu(OH) 2 I +Na2so4所生成的氢氧化铜沉淀与酒石酸钾钠反应，生 成酒石酸钾钠铜络合物，使氢氧化铜溶解：|OOK OOK CHOH CHO Cu(OH) 2+|= I+2H：OyooH yooCOONa COONa酒石酸钾纳铜络合物中二价铜是一个氧化剂， 能使还原糖中撅基氧化，而二价铜被还原生成一 价的氧化亚铜沉淀：yooH+ (CHOH) 4 -<u：O I(红色)CH2OH反应终点用次甲基蓝指示剂显示。因次甲基蓝 氧化能力较二价铜弱，故待二价铜全部被还原后，过量一滴还原糖立即使次甲基蓝还原，溶液 蓝色消失以示终点：(CHOH) 4CH2OH+H?O =2cr(无色)J3OOH*HOH) 4CH2OH5.2.2试剂5.2.2.1 斐林试剂甲液：称取69.3克硫酸铜(CuSO4 - 15H2O), 用水溶解并稀释至10