原位核酸分子杂交技术-生命经纬－关注生命科学及医学研究

1、原位核酸分了杂交技术原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(in situ hybridization isii)是应用已知碱基顺序并 带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形 成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在被检 测的核酸原位形成带颜色的杂交信号，在显微镜或电子显微镜下进行细胞内定位。这一技术 为研究单一细胞中dna和编码各种蛋白质、多肽的相应mrna的定位提供了手段，使从分子水 平研究细胞内基因表达及有关基因调控提供了有效的工具。可视为组织化学或免疫细胞化学 中革命性的突破。原位杂交技术己应用于基础研究如基因组图

2、(gene mapping),转基因检测, 基因表达定位(localization of gene expression),核dna和rna的mrna的排列和运输 (arrangement and transport of mna),复制(rep 1 icat ion)和细胞的分类(sorting of cel 1 s) o 临床研究应用在细胞遗传学(cytogenetics),产前诊断(prenatal diagnosis),肿瘤和传染性 疾病的诊断，生物学剂量测定(biological dosimetry)和病毒学的病原学诊断等。随着核酸探 针的制备，标记方法和基本操作方法的不断改进，新的

3、技术不断涌现，相信在不久的将來，原位 杂交技术将会更广泛的被应用于各个学科，并不断为生命科学提供新的资料，开拓新的领域。第一节原位核酸分子杂交技术的发展原位杂交1969年美国耶鲁大学gall和pardue首先创立的，他们用爪蟾核糖体基因探针与其 卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁屮。与此同时，buongiorno nardelli 和amaldi,john及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位。orth (1970)应用 3h标记的兔乳头状瘤病毒crna探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂 交，首次用原位杂交技术检出了病毒dna在细胞中的定位。 由于同位素标记

4、探针具有放射 性既污染环境，又对人体有害，且受半衰期限制等特点，因此研究用非放射性的标记物标记 核酸探针进行原位朵交，引起了许多学者的重视和探索。bauman(1981)等首先应用荧光素标 记crna探针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成功。shroyer (1982)报道用2, 4 二 硝基苯甲醛(dp)标记d7a探针，使该dna探针具有抗原性，然后用兔抗dnp的酶标抗体来识 别杂交后的探针，最后经免疫过氧化物酶组织化学的方法显示杂交信号。brigat(1983)首先建立生物素标记的探针在组织切片上检出了病毒dna,通过生物素 与抗生物素结合，过氧化物酶抗过氧化物酶显示系统显示病毒dna

5、在细胞屮的定位，生物 素标记探针技术目前已被广泛应用，特别是在病毒学和病理学的临床诊断中。boer inger mannhem biochemisca于1987年将地高辛标记的有关试剂及药盒投放市场，和其它非放射性 标记物一样，地高辛较放射性标记系统安全，方便、省时间。同时在敏感性和质量控制方面 比生物素标记技术要优越,地高辛标记法显示的颜色为紫蓝色(标记碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶 显色系统)，有较好的反差背景，更有利于与免疫组织化学相结合，同时可以检测基因表达。 核酸探针根据标记方法的不同可粗略分为放射性探针和非放射性探针两类。根据探针的核酸 性质不同又可分为dna探针、rna探针、cdna探针

6、、cra探针和寡核廿酸探针等。dna探针 还有单链 dna(single stranded, ssdna)和双链 dna(double stranded, dsdna)之分。所以原位 杂交可分为dma dna, cdna rna, rnarm和寡核背酸探针与dm或rna等杂交方式。原位杂交技术在生命科学的研究屮可视为一顶革命性的技术。它使我们的研究从器官、组织 和细胞水平走向分子水平。为各个学科的研究带来突破性的进展.第二节原位分子杂交技术的基本方法 原位杂交技术的基本方法包括：杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织的处理，如何 增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等；杂交；杂交后处理；显示(v

7、isualization ):包插放射自显影和非放射性标记的组织化学或免疫组织化学显色。(一) 固定原位杂交固定的目的是为了保持细胞形态结构，最大限度地保存细胞内的dna或rna的水平; 使探针易于进入细胞或组织。dna是比较稳定的，mrna是相对稳定的但易为酶合成和降解。 rna更易被酶降解，在rna的定位上，如果要使rna的降解减少到最低限度，取材后应尽快 了以冷冻或固定。在解释结果时应考虑到取材至进入固定剂或冰冻这段时间对rna保存所带 来的影响，因组织中nirma的降解是很快的。1 最常用多聚甲醛固定组织，因其不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，不会影响探针穿透 入细胞或组织。2 酷酸酒精

8、的混合液和bouin/ s固定剂也能获得较满意的效果。3 mrna的定位将组织固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中2 h,在冷冻前浸入15%蔗糖溶液 屮，置4°c冰箱过夜，次日切片或保存在液氮屮待恒冷箱切片机或振荡切片机切片。4 组织也可在取材后直接置入液氮冷冻，切片后才将其浸入4%多聚甲醛约10 min,空气干 燥后保存在-70°co如冰箱温度恒定，在-70°c切片可保存数月之久不会影响杂交结果。在病 理学活检収材时多用福尔马林固定和石蜡包埋，这种标本对检测dna和mrna有时也可获得杂 交信号，但石蜡包埋切片市于与蛋白质交联的增加，影响核酸探针的穿透，因而杂交信号常

9、 低于冰冻切片。同时，在包埋的过程屮可减低mrna的含量。其它固定剂如应用多聚甲醛蒸汽 固定干燥后的冷冻切片也可获满意效果。各种固定剂均有各自的优缺点，如沉淀性 (precipitating)固定剂：酒精/醋酸混合液、bonin' s液、car noyz s液等能为增加核 酸探针的穿透性提供最佳条件，但它们不能最大限度地保存rna,而且对组织结构有损伤。 戊二醛较好地保存rm和组织形态结构，但由于和蛋白质产生广泛的交联，从而大大地 影响了核酸探针的穿透性。(二) 玻片和组织切片的处理1 玻片的处理玻片包括盖片和载玻片应用热肥皂水刷洗，自來水清洗干净后，置于清洁液中浸泡24 h,清 水洗

10、净烘干，95%酒精中浸泡24 h后蒸馆水冲洗、烘干、烘箱温度最好在150°c或以上过夜 以去除任何rna酶。盖玻片在有条件时最好用硅化处理，锡箔纸包裹无尘存放。要应用粘附剂预先涂抹在玻片上，干燥后待切片时应用，以保证在整个实验过程中切片不致 脱落。常用的粘附剂有珞矶明胶液，其优点是价廉易得，粘附效杲较差。多聚赖氨酸液具 有较好的粘附效果，但价格昂贵。一种新的粘附剂apes粘附效果好，价格较多聚赖氨酸便宜, 制片后可长期保存应用。2 增强组织的通透性和核酸探针的穿透性增强组织通透性常用的方法如应用稀释的酸洗涤、去垢剂(detergent)或称清洗剂 triton x100、酒精或某些消

11、化酶如蛋白酶k,胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和淀粉酶 (diastase)等。这种广泛的去蛋白作用无凝可增强组织的通透性和核酸探针的穿透性，提高 杂交信号，但同时也会减低rna的保存量和影响组织结构的形态，因此，在用量及孵育时间 上应填为掌握。 蛋白酶k(proteinase k)的消化作用的浓度及孵育时间视组织种类、应用 固定剂种类、切片的厚薄而定。一般应用蛋白酶klug/ml (于01 mol/l tris/50 mmol/ledta, ph8. 0缓冲液中)，37°c孵育1520min,以达到充分的蛋白消化作用而不致影响组织的 形态为目的。蛋白酶k还具有消化包围着靶dna的蛋

12、白质的作用，从而提高杂交信号。甘氨 酸是蛋白酶k的抑制剂，常用01 mol/l的甘氨酸溶液(在pbs中)清洗以终止蛋白酶k的消化作用,burns等(1987)报道应用胃蛋白酶(pepsin) 20 100 u g/ml (用01 n hc1配)37°c、30 min进行消化，所获实验结果优于蛋白酶k。为保持组织结构，通常用4%多聚 甲醛再固定。3 减低背景染色背景染色的形成是诸多因素构成的。杂交后(posthybridization)的酶处理和朵交后的洗涤 均有助于减低背景染色。在多聚甲醛固定后，浸入乙酸at (acetic anhydride)和三乙醇胺(t riethanolam

13、ine)中以减低静电效应，减少探针对组织的非特异性背景染色。预杂交(prehybridizaiton)是减低背景染色的一种有效手段。预杂交液和杂交液的区别在于 前者不含探针和硫酸葡聚糖(dextran sulphate)。将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非 特异性杂交点的目的，从而减低背景染色。在杂交后洗涤中釆用低浓度的rna酶溶液(20 ug/ml)洗涤一次，以减低残留的内源性的rna 酶，减低背景染色。4 防止rna酶的污染由于在手指皮肤及实验用玻璃皿上均对能有rna酶，为防止其污染影响实验结果，在整个 杂交前处理过程都需戴消毒手套。所有实验用玻璃器皿及银子都应于实验前一h置髙温(240

14、 °c)烘烤以达到消除rna酶的目的。要破坏rna酶，其最低温度必需在150°c左右。(三) 杂交(hvbridsation)杂交是将杂交液滴于切片组织上，加盖硅化的盖玻片，或采用无菌的蜡膜代替硅化的盖玻片 ,加盖片防止孵育过程中杂交液的蒸发。在盖玻片周圉加液体石蜡封固或加橡皮泥封固。硅 化的盖玻片的优点是清洁无杂质，光滑不会产生气泡和影响组织切片与杂交液的接触，盖玻 片自身有一定重量能使有限的杂交液均匀覆盖。可将复有硅化盖玻片进行杂交的载玻片放在盛有少量5xssc或2xssc(standhd saline citrate, ssc)溶液 的湿盒中进行孵育。(四) 杂交后处

15、理(post hybridi sat ion t reatment)杂交后处理包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。特别因为大多数的原位杂交实验 是在低严格度条件下进行的，非特异性的探针片段粘附在组织切片上，从而增强了背景染色 。rna探针杂交吋产生的背景染色特别高，但能通过杂交后的洗涤有效地减低背景染色，获 得较好的反差效果。在杂交后漂洗中的rna酶液洗涤能将组织切片中非碱基配对rna除去 o 一般遵循的共同原则是盐溶液浓度rh高到低而温度rh低到高。必须注意的是漂洗的过程中 ,切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很难减少非特异性结合，从而增强了 背景染色。(五) 显示(vis

16、ual ization)显示又可称为检测系统(detection system) o根据核酸探针标记物的种类分别进行放射 自显影或利用酶检测系统进行不同显色处理。细胞或组织的原位杂交切片在显示后均可进行半定量的测定，如放射自显影可利用人工或计 算机辅助的图彖分析检测仪(computerassisted image analysis)检测银粒的数量和分布的差异。非放射性核酸探针杂交的细胞或组织可利用酶检测系统显色，然后利用显微分光光 度计或图象分析仪对不同类型数量的核酸显色强度进行检测。但做半定量测定必须注意严 格控制实验的同一条件，切片的厚度和核酸的保存量如取材至固定的间隔时间等。如为放射 自

17、显影，核乳胶膜的厚度与稀释度等必须保持一致。(六) 对照实验和结果的判断对照试验的设置须根据核酸探针和靶核昔酸的种类和现有的可能条件去选定，常用的对照试 验有下列几种。1将cdna或crna探针进行预杂交(吸收试验)。2与非特异性(载体)序列和不相关探针杂交(置换试验)o3 将切片应用rna酶或dna酶进行预处理后杂交。应用同义rna探针(sense probe)进行杂 交。4 以不加核酸探针杂交液进行杂交(空白试验)o5 组织对照用已知确定为阳性或阴性组织进行杂交对照。6 应用未标记探针做杂交进行对照。第三节 原位dna和dna分子杂交方法dna探针在病毒的检测等领域中得到广泛的应用。杂交时

18、需先在高温8095°c短时处理，使dna探针及细胞内靶dna变性，解离成单链，迅速 置于冰上冷却。然后置于3742°c杂交过夜。(一) 地高辛(dig)标记dna探针在石蜡切片检测病毒dna的方法1组织切片的预处理(1) 固定：组织以10%中性福尔马林液或bouins液固定，常规石蜡包埋，切片厚46 um,粘 附于涂有粘附剂的玻片上，入烤箱6080°c 6、8 h,使切片更紧粘贴于玻片。(2) 脱蜡：二甲苯 10 minx2,自 100%乙醇 i 和ii, 95%, 90%, 70%, 50%, 30%各 5 min。入pbs(含 5 mmol/l mgcl 2,

19、 ph7 374) 5 minx2o(3) 入 02 mmol/l hc1 20 min 以去除蛋白。(4) 50°c 2 x ssc,含 5 mmol/l edta 溶液中 30 min。蛋白酶 k(1 ug/ml 溶于 01 mol/l pbs 中)，37°c 20、25 min。(6) 02 mol/l甘氨酸液：室温10 min,屮止蛋白酶反应。(7) 4%多聚甲醛(pbs新鲜配制)，室温20 min°(8) pbs/5 mmol/l mgcl 2 漂洗 10 minx2。(9) 脱水，自低浓度到高浓度至无水乙醇各3 min,空气干燥。2 预杂交封闭非特异性

20、杂交位点，加预杂交液20 u1/每张切片，42°c水浴半小时。3 杂交加杂交液1020 u1/每张切片，加盖硅化盖片，将切片置于95°c 10min,使探针及病毒dna 变性，然后迅速置于冰上1 min,再将切片置于盛有2xssc湿盒内，42°c过夜(1618 h)。4 杂交后漂洗(d2xssc液内振动移除盖片。(2) 2xssc 55°c 10 minx2o(3) 05xssc 50°c 5 minx20(4) 缓冲液ii (含05%封阻试剂,用缓冲液i溶解)37°c 30 mine(5) 缓冲液 i (100 mmol/l tri

21、s i1c1, 150 mmol/l nacl pi17 5)15 min,室温。(6) 酶标地髙辛抗体(1 : 5 000,应用缓冲液i解释)37°c 30 min。(7) 缓冲液i 15 minx2,室温。(8) 缓冲液iii (100 nunol/l trishc1, 100 mmol/l nacl, 50 mmol/l mgcl 2, ph9 5)室温，2 min05 显色(1) 显色液配制：在缓冲液iii 1ml中加入45 ul四氮卩坐蓝(nbt), 35 u 1 x 磷酸盐(5澳 4 氯 3口引喙磷酸盐(bcip)配成。30 »1/每张切片，置暗处显色(30 m

22、in到2 h。 定时抽查切片，镜检其显色情况。(2) 缓冲液iv(10 niniol/l tris iic1, 1 mmol/l edta, pl 180) 10 min 终止反应，用核固红 或甲绿复染5 min,二甲苯透明，dpx封固，镜检。6结果杂交阳性信号呈紫兰色，细胞核呈红或绿色。(二) 生物素标记i1pv dna探针在石蜡切片上检测i1pv dna的方法。1 玻片的预处理组织细胞原位核酸杂交主要在载玻片上进行，因此玻片的处理至关重要。载玻片(或盖玻片) -般要经过lnmiol/lhcl溶液或重珞酸钾硫酸溶液的浸泡，取出后充分用自来水冲洗，用双 蒸水洗三遍，然后置于60°c烤

23、箱中烤干。将烤干的玻片分别插在染色架中，置250°c烤箱 中烘烤4h,目的是去除玻片上残留的核酸酶。为了防止组织或细胞在杂交过程中脱落，原位核酸杂交所需的玻片必需进行硅化处理。把经 过25ctc烘烤过的玻片用2% 3 氨丙基三乙氧基硅烷(apes)丙酮液处理玻片，有助于组织和 载玻片的粘附。apes对甲醛固定的组织粘附效果好，可使组织与载玻片发生共价结合。玻片硅化方法：(1)室温下将高温处理过的载玻片用2% apes丙酮液浸泡3 min； (2)用丙酮 洗去多余的apes； (3)用depc处理的蒸憎水或高压消毒的蒸韬水清洗玻片1、2次；(4)40°c 烤干玻片，防污保存在

24、干燥器皿屮待用。整个处理过程均要戴消毒手套进行操作。2 组织切片常用的原位杂交标本有石蜡切片、冰冻切片和细胞培养标本。无论是哪一类的标本，在制备 时都要尽量避免rnase污染。操作时要戴手套，要用75%的酒精擦洗工作面和切片刀、银子 等。石蜡切片时，展片要用高压消毒处理过的蒸僻水，裱片后把切片置60°c烤箱屮烤片广3 h。置室温下保存备用。新鲜组织切片最好先用固定剂固定(如用4% 多聚甲醛或冷丙酮固定10 min),吹干后-70°c保存或在70%酒精屮4°c保存，培养细胞标本 的处理方法与冰冻切片法相似。3 杂交前处理忖的在于提高组织的通透性，以防止dm探针与细胞

25、、组织之间的非特异结合，以增强杂交 信号，减少背景着色。(1) 脱蜡石蜡切片必需充分脱蜡，因为石蜡未脱净会影响探针的穿透力，因而脱蜡用的二甲苯尽可能新鲜。常规石蜡切片用二甲苯脱蜡3次，每次5 min;脱蜡后用逐级梯度酒精(100%、95%. 90%、80%. 70%)清洗，然后用蒸憎水洗3 min,必须用高压处理过的蒸镭水。(2) 蛋白酶处理蛋白酶的消化能使固定后被遮掩的靶核酸暴露，以增加探针与靶核酸结合的机会。常用的蛋 白酶有蛋白酶k (proteinase k) 链霉蛋白酶(pronase)和胃蛋白酶(pepsin) 蛋白酶bp等。 蛋白酶的浓度及消化时间,视组织种类、固定类型、切片厚度而

26、定，一般使用1 ug/ml蛋白酶 k(用含 50 mmol/l edta 的 pii8 0, 0 1 mol/l tris i1c1 缓冲液配制)，也可用 0 01% 蛋白酶bp(ffl ph8 ope配制)37°c孵育l(t30niin。蛋白酶具有消化包i韦i靶dna的蛋白质的 作用，促进探针渗透，从而提高杂交信号。但过度的蛋白酶消化会引起细胞形态结构的破坏及 靶核酸的减少，也会导致标本从载玻片上的脱落。4 杂交反应(1) 变性和杂交进行杂交反应时，探针和靶核酸都必须是单链。如果用双链cdna探针检测，则探针和靶核酸都必须先解链，也就是变性。将生物素标记的双链探针杂交液滴在待检组织

27、上，然后加 盖经250°c高温处理过的盖玻片，勿产生气泡，并在盖玻片周边用石蜡油封边(日的是防止探 针和杂交液在杂交过程中蒸发)，将含有探针的载玻片放入已经加热煮沸(95100°c)的水浴箱 的密封盒中(容器底部预先加入适量的蒸徭水)变性510 mine探针和靶dna同时变性，变性 的单链探针与靶dna随即进行杂交反应。如果用单链探针与靶dna进行杂交，虽然探针本身并 不需要变性，但也可将探针加在组织标本上，用上述方法使靶dna变性。变性完毕将切片放在 冰块上迅速降温2 min,然后将切片移入湿盒内置37°c培养箱杂交60 min0如有条件也可 用原位杂交仪进行变

28、性和杂交，先调整好原位杂交仪的变性、杂交时间和温度,将玻片放入杂 交仪内进行变性杂交，当杂交仪升温至95°c时即可进行变性，变性后温度迅速下降到37°c时 即可进行杂交反应。(2) 杂交后漂洗其目的是去除未参与杂交体形成的过剩探针，消除与组织或细胞之间的非特界性结合的探针, 降低背景染色，增加信/噪比。将杂交玻片从湿盒(或杂交仪)中取出，用2xssc将盖玻片洗脱,2xssc 30°c洗2次，每次15 min;lxssc 42°c洗 2 次，每次 15 min;0 5xssc 37°c洗 2 次，每次 15 min, tbs 缓冲液洗 2 次。注

29、意在漂洗过程中切不要使切片干燥。(3) 杂交信号的检测探针与靶核昔酸结合形成杂交体,对其检测的方法因探针的标记物不同而异，一般与免疫组化 方法类似，当带有酶的抗半抗原抗体(或者抗生物素蛋白)通过搭桥(或直接)与探针连接后，催 化底物混合液屮的底物发生反应,使其产生有色沉淀物即为阳性反应。现在大多数的研究都是 釆用碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶与抗半抗原抗体(或抗生物素蛋白)连接进行检测。在切片 组织上滴加碱性磷酸酶标记的链菌素(streptavidin alkaline phosphatase conjugated)溶 液，室温孵育2040 min, tbs缓冲液洗3次x5 min,加入bcip/

30、nbt室温暗处显色1030 min, tbs缓冲液洗,0 1%核固红复染切片5 min,蒸馅水冲洗，酒精脱水，屮性树胶封片。(4) 杂交结果dna原位核酸分子杂交阳性反应为靶基因存在的部位，一般在细胞核内，呈紫蓝色颗粒状，若 靶基因数量多或显色时间长，则整个细胞核呈浓染蓝色，阴性细胞核呈红色。(5) 对照试验 阳性对照:用已知含靶核酸序列的组织作对照。 阴性对照:用已知不含待测靶核酸序列的组织作对照。 用免疫组化检测方法来确定杂交信号的分布。 省略标记探针。 dna酶消化靶dna对照。ehj13 (6)非特异性染色非特异性染色可能会来自探针、组织内源性酶、组织细胞、显色系统等;探针特异性不高以

31、 及组织细胞内某些成分与显示系统中的抗体成分非特界结合也可造成非特异性染色。组织细 胞内源性酶是原位杂交中非特界性着色的重要原因，目前最常用的酶是过氧化物酶和碱性磷 酸酶，这两种酶都广泛存在丁组织细胞中，因此用这些酶时应有消除内源性酶的相应步骤。如 过氧化物酶用3% h 20 2处理510 min; 10%冰醋酸处理组切片10 min,或在底物显色液 中加入1 mmol/l左旋咪卩坐可防止内源性碱性磷酸酶的染色。nbt/bcip显示碱性磷酸酶时如 果在光照下显色也会增强非特异性染色。必须根据检测系统不同的标记酶作不同的内源酶处理。第四节rna原位核酸杂交方法一、基本原理rna原位核酸杂交(rn

32、a n ucleic acid hybridization in situ)又称rna原位杂交组织化学 (rna in situ hybridization histochemistry)或 rna 原位杂交6, 7, 25 (rna in situ hybri dization rish）。该技术是指运用crna或寡核昔酸等探针检测细胞和组织内rna表达的一 种原位杂交技术。英基本原理是：在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的rna 核昔酸片段，按核酸杂交屮碱基配对原则，与待测细胞或组织屮相应的基因片段相结合（杂 交），所形成的杂交体（hybrids）经显色反应后在光学显微镜或电子

33、显微镜下观察其细胞内相 应的mrna、rrna和trna分子。rna原位杂交技术经不断改进，其应用的领域已远超出dna 原位杂交技术。尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析，已成为最有效的分 子病理学技术，同时在分析低丰度和罕见的mrna表达方面已展示了分子生物学的一重要方 向。rna原位杂交不同于dna原位杂交主要有：（1）使用的探针不同：rna原位杂交中多采用 rna或寡核昔酸探针，因此避免了应用双链dna探针在杂交反应中存在的两条链之间的复性 和第二条链的竞争性杂交问题。crna-rna之间形成的杂交体要比dna-dna. cdna-rna杂交体 性能稳定，在杂交反应后可用rn

34、a酶洗脱，以除去未结合的探针，因此特异性更强。（2）检测 的目的不同：rna原位杂交检测和分析的主要为内源性基因，包括细胞内固有基因、异常基 因和变异基因。以正确反映组织与细胞之间相互关系及功能和代谢状态、探索疾病发病机理、 观察治疗的疗效和评估疾病的预后等。其次为对外源性基因检测，以获得病毒和细菌类型等 病原学诊断。而dna原位杂交主要为外源性基因检测。（3）有较高的灵敏度：在检出细胞和组 织内在低拷贝核昔酸时，rna原位杂交能获得较好定位，而dna原位杂交则难以信任。但rna 原位杂交也存在某些不足之处，为使rna原位杂交标准化和克服其不足之处必须注意以下几 点：（1）不同探针种类的选择、

35、制备和标记要适合靶核酸和组织的特点；（2）有效制止组织和 细胞内rna降解；（3）实验流程中严防r7a酶污染；（4）对杂交信号有效的放大和显色技巧； 阳性结果判别，不仅需要有阳性和阴性标本对照，有条件的更需要观测northern杂交和免 疫组化对同一组织的冰冻切片和石蜡切片中，基因及其产物两者表达之间联系。（6）在实验流 程的各个技术环节中熟练运用技术控制是保证rna原位杂交成功的必要条件。近几年来rxa 原位杂交已得到稳步发展。主要表现在：非同位素标记的探针制备和标记技术的进步、杂交 信号放大的应用、组织预处理的改进、rna原位杂交和免疫组化双重检测技术和激光共聚焦 显微镜在多重rna原位杂

36、交屮应用等。从理论上讲，rna原位杂交已趋成熟和完善，关键是 在实际应用中能否被人们所受接并应用到各学科的研究中，促进人们对各类基因识别和表达 规律的认识。二、rna原位杂交屮的探针（一）探针的种类rna探针是指带有标记的能与组织内相对应的核昔酸序列互补结合的一段单链cdna或crna 分子。根据在rna杂交中所使用的探针依其來源可分为三种：即特异性cdna、crna探针和人 工合成寡核昔酸探针。1. 单链cdna探针：由于cdna屮不存在内含子及其它高度重复序列，又克服了双链cdna 探针在杂交反应中两条链之间复性的缺点，从而提高了杂交反应的敏感性。但由于单链cdna 探针的制备比较困难，在

37、rna原位杂交中已很少见有应用。2. crna探针：是以cdwa为模板，通过体外转录而获得的。因为它是一种单链探针，因此也 避免了应用双链cdna探针做杂交反应时存在的两条之间的复性问题。crna与rna之间形成 的朵交体要比cdna-rna杂交体稳定。crna-rna z间形成的杂交体不受rna酶的影响。因 此杂交反应后可用rna酶处理，以除去未结合的探针。由于crna探针具有以上这些优点,crna 探针的杂交饱和水平又比双链dna探针高出8倍，因此在原位杂交中应用广泛。crna探针的 缺点是：探针的制备过程比较复杂，需要较好的分子生物学实验设备，它对rna酶敏感，易 受破坏，操作中要谨防r

38、na酶污染。3. 寡核葫酸探针：人工合成的寡核昔探针是以核昔酸为原料，通过dna合成仪合成，避免了 真核细胞中存在的高度重复序列帯来的不利影响。由于大多数寡核昔酸序列较短，不需要纯 化，组织穿透性极好。根据目的基因的特异性序列设计的探针，特异性较强。合成的寡核昔 酸探针的缺点是：探针长度必须适宜，探针太长可造成内部错误配对杂交，探针太短可形成 非特异性结合。它与mrna形成的朵交体不如crna-rna 交体稳定，再则探针较短，所携带 的标记物少，敏感性较低。依标记物不同，探针又可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。前者主要包括3h 、35c、32p和125等，不同的同位素探针其穿透力，

39、定位和半衰期各不相同，无一种同位 素探针具有穿透力强、定位好和半衰期长所有优点。市于半衰斯短，性能不稳定，污染坏境 和危害健康等原因，在rna原位朵交中应用同位素标记探针已日趋减少，而非同位素标记探 针在近年来得到迅速发展，其标记物主要有生物素、地高辛、酶和荧光标记等。其中地高辛 标记的cdna、rna和寡核昔酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克服了生物素标记 的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点，其应用越來越广泛。（二）探针的标记在rna原位杂交屮，不仅要选择适当的探针，而且还要使探针得到有效的标记。探针标记法 有酶反应法和化学反应法。1. 酶反应法：用于ra探针的酶反应

40、法主要为末端标记法与体外转录法。末端标记法是将标 记物导入线型dna或rna的5,端或3'端的一种标记法，末端标记适用于合成寡核昔酸探针的 标记，用末端标记制备的探针一般携带的标记分子较少。2. 体外转录法：体外转录法是一种制备与克隆片段序列相同的单链rna探针的方法。进行体 外转录时，先将靶核昔酸序列克隆到含噬菌体转录启动子的载体川，然后在rna聚合酶的作 用下，以dna为模板，以含有标记的三磷酸昔为原料，对启动子下游的序列进行转录，而启 动子本身并不被转录。体外转录常用噬菌体转录启动子，如沙门氏菌噬菌体和大肠杆菌噬菌 体t3、t70当两个不同的噬菌体转录启动子结合在载体多克隆位点的

41、两侧，用适当的限制性 内切酶在插入序列的下游将质粒线性化。sp6噬菌体的rna聚合酶对sp6启动子序列具有尚 度的亲和性，从而启动下游的转录，在4种三磷酸核糖核昔和相应的噬菌体rna聚合酶存在 的条件下，即转录成rna。如反应物中含有标记的三磷酸核糖核昔，所有的r7a就被标记。 依标记物为同位素和非同位素，近年來非同位素标记探针已有了极大的近步。常用非同位素 标记技术有生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶和荧光素。非同位素标记法又可分 为直接标记法和间接标记法。直接标记法是将标记物直接结合到探针上，当探针与组织内相 应靶核苛酸结合后，即可显色观察。这类标记探针必须符合标记物在杂交过程中不丢

42、失，乂 不影响杂交反应为条件。大量已发表的文献表明，由于检出杂交信号受到多种因素制抑，只 能限于靶rna丰富的细胞或组织中，rna杂交対低拷贝的基因检测不理想。近年來间接标记 法得到较快发展，先将标记物结合在探针上，通过特异性抗体识别，市特异性抗体结合多种 酶，对检测的杂交信号作有放大，这一类标记法已展示极好的发展前景。（三）探针的纯化某些标记探针必须经纯化后方可使用。这是因为在探针标记过程中，反应液中仍存在一些未 被结合到探针屮去的剩余d"tp等小分子。为将掺入并结合到cdna. crna和标记寡核昔酸与 游离的标记寡核昔酸分开，常使用乙醇沉淀法或酚/氯仿抽提法进行纯化。乙醇沉淀法

43、的原理 是：dna可被乙醇沉淀，而未掺入dna的dntp则保留在上清液中，市此反复乙醇沉淀能将两 者分开。核酸溶液屮去除蛋白质的酚/氯仿抽提法的原理是：交替使用酚、氯仿这两种不同的 蛋白质变性剂，以增加去除蛋白质杂质的效杲。因为酚虽能有效地变性蛋白质，但它不能完 全抑制rna酶的活性，而且酚能溶解10-15%的水，从而溶解一部分ploy（a）rna0为克服这 两方面的局限，混合使用酚与氯仿，对于rna提取，显得更加重要，氯仿还能加速有机相与 液相分层，去除植物色素和蔗糖。(四) 杂交前准备1. 载玻片和盖玻片的处理为有效防止外源性rna酶的污染，杂交用的载玻片和盖玻片可按以下步骤处理。将载玻片

44、和 盖玻片分别浸泡在5%洁消精(苏洲吴县化工二厂)屮12小时，用35°c-40°c温水屮冲洗 30min,再用双蒸水漂洗3次，每次5min,室温下干燥切片后，在180°c烤箱内烘烤46小 吋，盖玻片可按近期内所需量，用铝箔纸包裹后烘烤后存放。为防止组织或细胞标本在杂交过程中漂起或脱落，载玻片应涂以粘附剂，大的冰冻或石蜡切 片建议用明胶粘附剂，活检或较小的标本建议用多聚左旋赖氨酸或硅烷粘附剂。2. 明胶涂片制备取10克明胶(merck) 于1000毫升40°c50°c双蒸水中，待明胶完全溶解后加入4毫升 25%硫酸珞钾溶液(chromium po

45、tassium sulfate cps),使cps的终浓度为0.1%。将烘烤 后的载玻片浸泡在明胶溶液中lomin,在室温下干燥玻片。再将载玻片浸泡在含有1%多聚 甲醛，pi17.4的pbs溶液中lomin；在室温下干燥玻片后再将载玻片浸泡在含有1 %多聚甲 醛，ph7.4的pbs中lomin,在室温下干燥玻片。60°c烤箱内过夜备用。3. 多聚左旋赖氨酸涂片的制备取2-4mg多聚左旋赖氨酸(sigma),分子量在300000以上，溶于51消毒去离子水中。经旋 涡器反复搅拌，吸取20 30卩1滴加到玻片一侧，再収另一张载玻片复合，将赖氨酸溶液均 匀涂抹在裱组织切片处，并将涂有粘附剂的

46、一面用钻笔标出，室温下干燥切片后，在60°c烤 箱内过夜备用。4. 硅烷涂片的制备取5毫升氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxys订ane apes) (sigma)溶于250ml 丙酮内。将烘烤后的载玻片浸泡硅烷溶液屮60min,用双蒸水漂洗2次，每次lomin干燥玻片 后，60c烤箱内过夜备用。注意事项：载玻片的粘附剂及涂片制备，以组织切片或细胞不脫落，不干扰杂交信号，低背 景，经济及制备方便为原则，在制备过程中，需戴一次性手套及口罩，防止手指皮肤上的rn a酶的污染。多聚左旋赖氨酸溶液的溶度可按实际应用效果调整，并应注意有效期限，制备 载玻片应尽快使

47、用，防止赖氨酸解聚而失效。5. 新鲜标本的储存和冰冻切片制备为rna原位杂交作新鲜标本储存和冰冻切片过程中，应严防rna酶的污染，制备过程中所使 用的容器、刀具等均经高压消毒或清洁后用0. 1%焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate depc)水清洗。为防止r7a迅速降解，标本离体后，先切成1.5x1. 2cm大小，其厚度不超过 0. 2cm,应迅速投入4%多聚甲醛溶液内，置4°c冰箱内2-4小时。再将组织移入30%蔗 糖pbs溶液内，4°c冰箱内过夜。次日可将标本储存于-80°c或-140°c超低温冰箱内保存。 如作冰冻切片，先将组织

48、在-20°c恒冷切片机内停留，待温度回升后，然后在恒冷冰冻切片机 内切成7 m薄片。40°c烤箱内干燥切片2小时后储存在-80°c或-140°c超低温冰箱内备用。6. 标本的固定和石蜡切片的制备石蜡切片作rna原位朵交的，也应严防rna酶的污染、容器、刀具等去除rna酶的过程同冰 冻切片。为防止rna迅速降解，离体后标本应立即有效固定。为保存良好组织结构，有利探 针的穿透力，应选用合适的固定剂。常用的化学固定剂可分为，沉淀固定剂和交联固定剂两 类。前者有乙醇，甲醇和丙酮等，后者有多聚甲醛，甲醛和戊二醛等。经沉淀固定剂固定的 组织通透性较好，利于探针穿入，

49、但过长时间固定，可引起rna降解。其不足之处是：组织 形态结构的保持不如交联固定剂。交联固定剂能较好保存组织'prna和组织形态结构，但固 定吋间过长，也可发生胞浆和胞核内大分子化合物形成交联，影响探针的穿透力，阻碍杂交 体的形成。4%多聚甲醛固定液取4g多聚甲醛和0. 25g甘氨酸分别溶于100ml 0. 01mol/l ph7. 0 pbs溶液,组织在常温下浸 泡于4%多聚甲醛中4小时，每1小时将组织在真空下吸干lomin,再注入新的固定液，共 4次。然后用0. 01mol/l ph7. 0的pbs漂洗2次,每次30mino福尔马林酷酸固定液福尔马林醋酸固定液rfl50%酒精、10

50、%福尔马林和5%醋酸组成。在常温下将组织浸泡4 小时，每1小时在真空下吸干10分钟，再注入新的固定液，共4次，然后用50%酒精漂洗 2次,每次30min。(五) 杂交前探针的选择1. rna探针：r7a探针的长度以50-150碱基为佳，探针易进入细胞，杂交率高，杂交时间短 o长500个碱基的探针杂交时间约需20个小时左右，如超过500个碱基的rna探针则在杂交 前用有限碱基水解法控制其长度。(1) 孵育时间t = lf- lo / k x lo xlf(3 =核酸探针原长度(kb), lf=核酸探针水解后所需长度(kb), k是常数率=0. llkb/min)o(2) 在室温中加入下列试剂终止

51、水解：3mol/i.醋酸钠，6.6p1 (终浓度0. lmol/l),酷酸1. 3 卩1 (终浓度为05%)o(3) 加入下列试剂沉淀探针：7mol/l醋酸钱looul, 100%乙醇750 ml, rna (10mg /nil) 2,置-20°c 2小时后恢复到室温,在1400rpm离心30mino小心将乙醇倒出，待试管内干燥后再用无菌ddh20稀释到10ng/m 1浓度。(5) 最终探针长度可于10%聚丙稀酰胺凝胶在60°c的尿素中电泳检测。2. 探针的长度原位杂交反应屮探针浓度应超过靶序列的浓度，探针浓度必须给予该实验最大信噪比，因为 背景着色度高低与探针浓度有关。最

52、佳探针浓度是最低探针浓度达到靶核酸的最大饱和结合 度为目的。探针浓度按其种类而略有不同，放射性标记crna探针的浓度为0. 5ng/ p 1,而非 放射性标记crna探针的浓度1. ong/ u 1。杂交液的量要适当，每张切片以30-50 u 1为宜。 保持杂交液不流失的关键是，载玻片的清洁处理必须彻底，应用杂交罩等也很必要。3. 杂交的温度和时间设置和调整杂交温度是rna原位杂交的重要环节。杂交温度应低于解链或融解温度(melting temperature tm)20-30°co多数rma原位杂交tm为95°c,由于这一-温度对保存组织形态完 整和组织切片的粘附将产生不

53、利影响，为此在杂交液中常以增加甲酰胺浓度來降低tm值，因 为每增加1%甲酰胺浓度可降低0.72°c。另外杂交体中gc的百分比，杂交体长度以及杂交 液屮na+的浓度也与tm呈正相关。杂交反应的时间可随探针浓度的增加而缩短，杂交时间过短会造成杂交不完全，杂交时间过 长会增加非特异性着色。一般rna原位杂交采用杂交孵育过夜，在黑暗环境下进行，可以避 免光线对甲酰胺的电离作用。三、crna探针检测组织切片屮的rna原位杂交(一) 组织的前处理1. 冰冻切片的制备：(1)离体后组织应切成1.5x1. 2cm,厚度为0. 2cm0 (2)立即投入4%多 聚甲醛溶液中(pbs新配制)，4°

54、;c下固定2-4小时。(3)倒去固定液后，加入30%蔗糖溶液 (pbs新配制)，4°c下过夜，次日将组织块储存在-80°c或-140°c超低温冰箱内。或 将组织块置于-20°c恒冷切片机内切成10 m薄片，粘附于涂有粘附剂的载玻片上置室温下 ,置40°c恒温箱内过夜，或置40°c恒温箱内至少2小时，后将切片放入切片盒在-80°c超 低温冰箱内存放备用。2. 组织的固定和石蜡切片的制备：(1)离体后组织切成不大于1.5x 1.2cm,厚0.2cm。 立即投入4%多聚甲醛溶液内(pbs新配制)，或2.5%戊二醛，在室温下固定3-

55、4小时。(3) 用pbs冲洗，经梯度酒精脱水、二甲苯透明和浸蜡包埋切片。(4)切成5um薄片粘附于涂有 粘附剂的载玻片上，在40°c恒温箱内过夜干燥切片，用新的二甲苯脱蜡2x10min和100%、 95%、70%、各级酒精 1 x5min, ddh20 漂洗 2x5min<>注意事项(1) 切除的新鲜标本应立即作组织固定或低温储存，以免inrna降解。(2) 标本尽可能采多聚甲醛固定及蔗糖浸泡作冰冻切片，这一制备法既能避免mrna降解，又 能保持良好的组织形态。(3) 对外检病例中，采用10%福尔马林固定标木的，为利于mrna检测，固定时间不要超过 36小时，以免引起rn

56、a与蛋白质之间发生交联。(4) 在冰冻切片和石蜡切片制作过程中，所使用的容器、器械都要经高压消毒，或清洁后用0 .1% depc水清洗,再经ddh2o冲洗,避免外源性rna酶污染。(二) rna探针的标记kna探针的制备需将cdna探针克隆到带有rna多聚酶启动子的质粒，然后转录制成rna探针。 用edta缓冲液和depc处理的ddh20将会影响rna多聚酶中的质粒。rna探针的长度应v 500bp, >500bp的探针不易与mrxa形成杂交体。对探针标记、预杂交、杂交和后杂交流程 中使用的容器、ddii20均需经0.1% depc处理，为避免rna酶污染，操作人员必须戴手套和 口罩操作

57、。rna探针的纯化:在杂交探针中加入5ul 10%乙酸(acetic acid), 11 ul 3mol/l醋酸 纳 ph6. 0, 1 u i lomg/ml trna, 1.2u 1 lmol/l mgci2, 300 u 1 冷酒精。在-20°c 孵育 4- 16小吋。在4°c下15min,使rna发生沉淀。真空下干燥rna沉淀物。用depc处理 的ddlbo含标记的rna探针10-50 m g/mlo rna探针的水解：按以下方法减少探针长度为近 200bp,在 microcentrifuge 管内加入 50 u 1 rna 探针标记液,加入 30 u 1 200m

58、mol/l na2c03 和20 u 1 200mmol/l nalico3。将杂交探针置于60°c条件下，按以下方法计算水解时间，t =(lo-lf) / (k. l0. lf) (l0 = rna探针原长度(kb), lf = r"a探针水解后所需长度，k =常数率(k = 0. llkb/min), t =水解时间)。(三) 预杂交(1) 切片用 depc 处理的 pbs ph7.4(140mmol/l nacl , 2. 7mmol kc1, lommol/l na2hp04, 1. 8m mol/l kii2p04)孵育 2x5min,再用 depc 处理的含 l

59、oommol/l 昔氨酸(glycine)pbs 孵育切 片 2x5mino (2)用 depc 处理的含 0. 3% triton x-100 pbs 孵育 15min。(3)用 depc 处理的 pbs 漂洗 2x5mino (4)冰冻切片用 te 缓冲液(loommol/l tris-hci ,50 mmol/l edta ph 8.0) 不含rna酶的1 ug/ml蛋白酶k,在37°c下通透切片30 min。石蜡切片用te缓冲液配制的 不含rna酶的5-20 u g/ml蛋白酶k,在37°c下通透切片30mino (5)在4°c下用depc处理 的4%多聚甲醛pbs溶液作后固定5min0 (6)再用depc处理的pbs冲洗切片2x5min。 切片作酸肝处理，处理液含0.25醋酸肝、0. lmol/l三乙醇胺(triethanolamine tea)ph8.0, 振荡漂洗2x5mino (8)在37°c孵育切片后，杂交缓冲液冲洗(含50%去离子甲酰胺的4 xssc),至少 10 min。注意事项(1) 切片的通透化是rna原位杂交关键步骤，特别对冋顾性资料尤为重要，因固定液种类和固 定吋间的不同，需作最佳通透化条件探索，包括蛋白酶k浓度，孵育吋间20-30mi