酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵3

1、酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵吴英玲 10197020 10 生物创新班摘要： 酵母菌喜欢酸性环境，可利用乳酸豆芽葡萄糖培养基富集培 养酵母菌，然后在 YPG培养基上用划线法分离纯化出酵母菌。将分 离的酵母菌转接于 YPG斜面培养基上培养，待长好后置于冰箱内 4 下保存。用 TTC显色剂及杜氏小管观察法筛选出发酵能力高的 酵母菌。并通过菌落形态、细胞形态、生化分析及分子生物学手段 进行微生物鉴定。采用 PVA-海藻酸钠固定化技术固定酵母细胞进行 酒精发酵。关键词： 酵母菌 分离鉴定 固定化 酒精发酵Abstract: Yeast like acid environment, the use

2、 of lactic acid glucose medium enrichment culture yeast, bean sprouts and purification by marking method on the YPG culture medium of yeast will transfer separation of the yeast in the YPG cant medium cultivation, staying long placed in the refrigerator after use the TTC chromogenic agent, save and

3、duchenne tubular observation screen high fermentation ability by colony morphology of yeast cell morphological and biochemical analysis and molecular biology means to identify the microorganisms using PVA - sodium alginate immobilized technology fixed yeast cells for ethanol fermentation 。前言酵母菌( yea

4、st )是一类单细胞真菌。一般呈圆形、卵圆形、 圆柱形，其菌落呈乳白色或红色，表面湿润、粘稠，易被挑起。酵 母菌多数为腐生，专性或兼性好氧，广泛生长在偏酸性的潮湿的含 糖环境中，例如水果、蔬菜、蜜饯的内部和表面以及在果园土壤中 最为常见。酵母菌在有氧环境下将葡萄糖转化为水和二氧化碳，主 要用于馒头、面包等食品发酵；在工业上，酿酒酵母 ( Saccharomyces cerevisiae )将葡萄糖、果糖、甘露糖等单糖吸入细胞内，在无氧的条件下，经过体内酶的作用，把单糖分解为二 氧化碳和酒精。此作用即酒精发酵。C6H12O6（葡萄糖） 2 C2H5OH（酒精）+2 CO2在酿酒酵母酒精发酵的生产

5、和应用中，由于细胞破碎和酶纯化 等操作往往导致酶活性和稳定性都受影响，从而降低产酒精效率。 而利用细胞固定化可以很好的解决这一问题。微生物细胞固定化方 法主要有三种：载体结合法，交联法和包埋法，其中固定包埋法是 目前比较理想的方法。包埋法就是将微生物细胞均匀地包埋在多孔 的水不溶性的紧密结构中，细胞中的酶处于活化状态，因而活性 高，活力耐久。目前，利用聚乙烯醇（ PVA）海藻酸盐是包埋法中 比较高效的一种，这种方法以 PVA-海藻酸钠作为混合溶胶，将酵母 细胞固定起来进行酒精发酵，不仅可以使细胞浓度增加，而且可以 多次使用，减少了酵母培养增殖所消耗的糖分；操作简单、过程迅 速、颗粒不粘连、颗粒

6、强度大大提高，且增加了颗粒的生物活性和 稳定性，因此可实现连续化生产，提高酒精生产效率。1. 材料与方法1.1 材料1.1.1 材料与试剂成熟葡萄皮、酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂、豆芽、去离子水、 PVA 、海藻酸钠、 CaCl2、红糖、异丙醇、乙醇、液氮、 Taq酶、 dNTPs、引物、酵母膏，葡萄糖， （NH4） 2SO4，K2HPO4?3H2O， MgSO4?7H2O、H2SO4 ，1% K2Cr2O7 ，10% NaOH等1.1.2 培养基乳酸豆芽葡萄糖培养液：豆芽（ 60 g ）、葡萄糖（ 6 g）, pH 值4.5 。YPG培养基（ 500 ml ）：酵母膏（ 5 g ）、蛋白胨（

7、 10 g）、葡萄 糖（10 g ）、琼脂（ 10 g ）、pH值6.5 6.8TTC 上层培养基： TTC 0.05 g 、葡萄糖 0.5 g 、琼脂 1.5 g 、水l00 ml 。酒精发酵培养液：红糖 100 g， (NH4) 2SO4 2.0 g ，KH2PO4 1.0 g ， pH自然，去离子水定容至 1000 ml。1.1.3 实验器材酒精计、试管、杜氏小管、移液枪、滴管、显微镜、三角瓶、 烘箱、烧杯、 PCR仪，电泳仪、接种环、电磁炉、报纸、橡皮筋 等、玻璃棒、三角瓶、培养皿、试管、吸管、移液枪、漏斗、纱 布、瓷缸、刮铲、载玻片、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、载玻片、盖 玻片1.2 实

8、验方法1.2.1 酵母菌的分离与培养取葡萄皮于 90 ml 无菌水，放置于摇床 150 rpm，摇晃 5 min ，取 出后稍静置。用无菌枪头吸取上清液 1 ml接入9 ml的乳酸豆芽葡萄 糖培养液中，置 2830烘箱中培养 48小时。富集后用碘液染色后 镜检。然后用接种环在事先灭菌的 YPG固体划线并置于 2830 再 培养48 h ，得到酵母初筛单菌落，观察菌落，用碘液简单染色镜 检。1.2.2 发酵菌株的筛选向划线分离的 YPG培养基上倒入 TTC上层培养基， 30 下保温 (阴暗处)2 3 h 。比较各菌株间的颜色深浅，颜色深的菌株呼吸酶 活力强，有较强的产酒精能力。选取平板中对应的颜

9、色较深的 10株 菌，作为二级筛的出发菌株。选取上述显色较深的酵母菌落，挑取一接种环接入乳酸豆芽葡 萄糖培养液中，同时试管内倒置一杜氏小管，培养 24 h 后，观察杜 氏管中产气情况。打开棉塞，嗅闻是否有酒精气味。记录产气及酒 精气味情况，并与显色情况进行比较。1.2.3 发酵菌株的鉴定进行形态学鉴定： A菌落形态观察，按普通微生物实验指导书 观察所分离的真菌菌落特征。 B. 细胞形态学观察，按普通微生物实 验指导书简单制片法观察，先低倍镜，后高倍镜观察。分子生物学鉴定：主要对核糖体小亚基 16SrRNA进行 PCR扩增鉴 定，挑取形态学观察符合酵母特征的菌落作为扩增模版进行 PCR， PCR

10、体系 (25ul) 为：表一 PCR 反应体系ddH2O34.610×PCR buffer ( withoutlMgCl2)5 lMgCl2 (25 mM)4 ldNTP(10 mM)1 l5'primer(10 mM)2 l3'primer(10 mM)2 lTemplate ( 50 -500 ng/l )1 lTaq DNA polymerase(5U/ l)0.4 lTotal50 l94预变性 5 min个循环94变性30 sec52退火30 sec 4072延伸60 sec72延伸5 min4保温(到达此温度时停止 PCR扩增，将 PCR管取出)将符合要求

11、的样品，按公司测序订单要求填写。测序结果登陆 NCBI网站，进行在线比对分析。1.2.4 酿酒酵母细胞 PVA-海藻酸钠固定化技术菌种活化：挑取酵母菌斜面菌种一环，接 1环斜面菌苔于装有 20mL培养基的 150mL三角瓶中活化，置于恒温摇床内， 150r/min 培养 24 h，25 培养 30 h 。再将其用 0.85%生理盐水制成菌悬液，酵母 数控制在 108个/ml 。固定化：聚乙烯醇 PVA-海藻酸钠混合胶于无菌烧杯中加热融 化，冷却至 45 左右。酵母菌液（预热至 35 左右）与聚乙烯醇 PVA-海藻酸钠按 1: 4 比例（ v/v ）混合均匀后，制备固定化细胞。 用注射头直径为

12、2 ml 注射器以恒定速度滴到 250 ml 三角中，瓶中 预先盛有 50 ml 的含 2 % CaCl2溶液使形成凝胶珠。然后取 60 粒凝 胶珠加入 150 ml 无菌葡萄糖培养液中，置 25 下发酵 4d，测定其 酒精含量。2. 结果与分析2.1 发酵菌株初筛结果将葡萄皮中的酵母菌进行富集培养后酵母菌生长迅速，在液体 培养基中比霉菌生长得快。不同组材料来源不同，结果显示葡萄皮 中的酵母菌数量较多。故而在酒精发酵中，酵母菌选择的来源非常 重要。在 YPG培养基上用划线法分离纯化出酵母菌， 48h 后观察菌 落。图一菌落呈乳白色，表面湿润、粘稠，易被挑起。图二为高倍 镜下观察到的酵母菌，箭头

13、处明显观察到酵母菌的出芽生殖方式， 几乎呈链状。图三为平板划线后分离单菌落。图 发酵菌株初筛结果2.2 TTC 法筛选酵母及酵母产气情况TTC（2，3，5 一氯化苯基四氮哇 ）是一种显色剂，它对酵母的 代谢产物发生呈色反应，通过它可以判断酵母中呼吸酶活力的大 小，在 YPG培养基上覆盖 TTC上层培养基培养后出现深红色菌落， 说明该菌株产酒精能力较强。酵母进行酒精发酵过程会产生CO2，根据杜氏小管中产气多少可以间接判断酵母发酵能力的强弱。再进一 步挑取红色较深的菌落进行产气检验发现杜氏小关中气体较多，进 一步说明所筛选的菌株具有较强的发酵能力，可以进行后续操作。 图四 TTC法筛选正面图，图五

14、为 TTC法筛选反面，图六产气检验结 果。由第四管看出， CO2仍在不断产生气体，故而在后续操作中用此 管中的酵母菌进行操作。图 TTC 法筛选酵母及酵母产气情况表二 酵母菌落显色深浅与杜氏小管中产气多少之间的关系管号颜色产气量1号粉红+2号红+3号粉红+4号深红+2.3 分子生物学鉴定挑取发酵能力较强的菌落进行菌落 PCR，电泳结果如图七，条 带约为 450bp，可以进行测序。测序结果登陆 NCBI网站，进行在线 比对分析。该序列与编码 Irpex lacteus isolate T2b(Han,G.,Feng,X. and Tian,X )的 18S rRNA基因的部分序列有 57%的相似

15、 度。图八和图九为序列比对结果。 ( 此处仅展示分子生物学鉴定方法 )图 菌落 PCR结果图 序列比对结果2.4 酿酒酵母细胞 PVA-海藻酸钠固定化打开固定化细胞发酵的三角瓶，与未加凝胶珠的瓶子对比，嗅 闻有酒香气，上层溶液有浑浊，凝胶珠形状是完好无损。与其他组 实验结果进行比较，从而选出酒精浓度最高一组，进行旋转蒸发获 得高浓度酒精。3. 讨论与反思 （1）本实验采用平板分离酵母菌时，培养时间不应该过长，因为长 时间培养增加了染霉菌的可能性（图三），并且若需得到纯度较高 的酵母菌则需进一步进行平板划线分离酵母菌菌株。因此控制霉菌 生长很重要，可采取多步平板划线的方式克服此难关。（2）富集培

16、养后需对溶液中酵母进行死活统计，从而初步判断此次 富集的酵母菌的生存能力是否满足工业酵母生存能力。死活统计的 方法有 0.l% 美蓝染色液染色法，活酵母菌可使美蓝还原，从而使菌 体不着色。（ 3）表一中总结出 TTC染色后，菌落颜色深浅和产气量的关系，颜 色越深，产气量越多，故在后期酒精发酵时应挑取菌落颜色深的， 提高酒精产量。（4）微生物鉴定时需要采取不同的方法进行生物学鉴定，形态学鉴 定时有可能出现杂菌，导致观察失误。分子学鉴定也可能产生假阳 性，故在鉴定时不同方法之间要相互验证，使结果更具有说服力。（5）固定化培养酵母进行酒精发酵时，凝胶珠中细胞浓度增加，而 且可以多次使用，减少了酵母培养增殖所消耗的糖分；操作简单、 过程迅速、颗粒不粘连、颗粒强度大大提高，且增加了颗粒的生物 活性和稳定性，因此可实现连续化生产，提高酒精生产效率。但在 凝胶珠中，代谢物的积累可能影响酵母的生长繁殖和产酒精量，本 人推测这可能与凝胶珠的大小有关系，故针对此处设计实验。实验设计：1. PVA-海藻酸钠融化 45，加