水稻类病斑突变体lmm4的鉴定及其基因定位

1、水稻类病斑突变体lmm的鉴定及其基因定位邱结华马宁,蒋汉伟,圣忠华邵高能唐绍清魏祥进,胡培松,(中国水稻研究所/农业部水稻生物学与遗传育种重点实验室/水稻生物学国家重点实验室,杭州;杭州师范大学生命与环境科学学院,杭州;通讯联系人,Email:weixiangjincaascn;hupeisongcaascn)IdentificationandGeneMappingofaLesionMimicMutantlmminRiceQIUJiehua,MANing,JIANGHanwei,SHENGZhonghua,SHAOGaoneng,TANGShaoqing,WEIXiangjin,HUPeiso

2、ng,(StateKeyLaboratoryofRiceBiology,KeyLaboratoryofRiceBiologyandBreedingofMinistryofAgriculture,ChinaNationalRiceResearchInstitute,Hangzhou,China;CollegeofLifeandEnvironmentalSciences,HangzhouNormalUniversity,Hangzhou,China;Correspondingauthor,Email:weixiangjincaascn;hupeisongcaascn)QIUJiehua,MANin

3、g,JIANGHanwei,etalIdentificationandgenemappingofalesionmimicmutantlmminriceChinJRiceSci,():Abstract:ThelesionmimicmutantlmmwasidentifiedfromanEMSinducedNipponbaremutantlibraryBrownlesionswerefirstobservedonthetipoflmmleavesattheinitialtilleringstage,andspreadedgraduallydownwardtothewholeleafbladeand

4、eventheleafsheathComparedwiththewildtype,thechlorophyllandthenetphotosyntheticrateoflmmweresignificantlyreducedTheplantheight,paniclelength,seedsettingrate,grainweightwerealsodecreasedsignificantlyTheshadingassayshowedthatthelesionsonlmmleaveswereinducedbynaturallightThehistologicalstainingassayindi

5、catedthatthelesionsonlmmleaveswerecausedbyprogrammedcelldeathandhydrogenperoxideaccumulatedinlmmleavesThelmmdisplayedhigherresistancetoblastraceCandGwhencomparedwiththewildtypeInaddition,pathogenesisrelatedgenePOC,PAL,PBZ,PRwerefoundtobeupregulatedinlmmGeneticanalysissuggestedthatthephenotypeoflmmwa

6、scontrolledbyasinglerecessivenuclearlocusBasedamapbasedcloningstrategy,thelmmwasnarroweddowntoakbregionbetweenIndandIndnearthecentromereofchromosomeKeywords:lesionmimicmutant;blastresistance;genemapping;rice邱结华,马宁,蒋汉伟,等水稻类病斑突变体lmm的鉴定及其基因定位中国水稻科学,():摘要:在EMS诱变的日本晴突变体库中,筛选到一个类病斑突变体.该突变体类病斑出现于分蘖始期,而后慢慢扩

7、散至叶鞘、茎秆,最后至整个植株,属于扩散型类病斑突变体.相比野生型,突变体的lmm的株高明显降低,有效穗数减少,穗长缩短,结实率、每穗实粒数、千粒重均显著降低.遮光处理实验表明,突变体lmm类病斑的产生受自然光诱导.突变体lmm的光合色素含量和净光合速率明显低于野生型.电子显微镜观察发现突变体类病斑部位叶肉细胞中的叶绿体结构发育异常.台盼蓝染色实验表明突变体类病斑部有大量的死亡细胞.二氨基联苯胺染色实验表明类病斑部位有过氧化氢沉积.稻瘟病抗性鉴定结果表明,与野生型相比,突变体lmm对C和G等稻瘟病菌生理小种的抗性明显增强.实时PCR分析证明在突变体lmm中防卫反应相关基因POC、PAL、PBZ

8、、PR的表达量显著提高.遗传分析表明突变体表型符合单隐性核基因控制的遗传规律.lmm定位在第染色体着丝粒附近Ind和Ind之间大约kb的区域内.关键词:类病斑突变体;稻瘟病抗性;基因定位;水稻中图分类号:Q;Q;S文献标识码:A文章编号:()植物类病变(lesionmimicmutant)突变体是指在无明显逆境或病原物侵染时,植物叶片或叶鞘上自发形成大小、形状和颜色各异的斑点的一类突变体.又因为多数类病变突变体形成的斑点与无毒病原物浸染时产生的病斑类似,并且大多数斑点的颜色为褐色,也常被称之为类病斑(lesionsimulatingdisease)突变体.类病斑突变体的表型多与病原菌侵染后的超

9、敏反应(hypersensitiveresponse,HR)症状类似,而且许多类病变突变体对某些植物病原物表现出了一定的抗性.因此,对这类突收稿日期:;修改稿收到日期:.基金项目:国家自然科学基金资助项目(,);国家计划资助项目(AAA,AA).中国水稻科学(ChinJRiceSci),():http:/wwwricescicnDOI:/jissn变体的研究可以为水稻抗病防御体系和细胞程序性死亡机制的研究提供借鉴,同时可以为水稻抗性育种提供有用的种质资源.水稻类病斑突变体的研究已有大量报道,到目前为止,已经发现了多个类病斑突变体.其中,绝大部分呈单隐性核基因遗传规律,少部分表现为双隐性核基因或

10、显性核基因遗传规律,但被克隆的类病斑基因却为数不多.在水稻中第一个被克隆的类病斑基因是SPL,该基因编码一个热激转录因子,spl突变体在该基因非常保守的DNA结合域发生突变,从而导致其斑点叶表型的发生.随后不同研究者利用图位克隆、同源基因克隆、TDNA序列标签等方法克隆与分离了Spl、Spl、Spl、OsLSD、OsPtia、OsNPR、OsSSI、OsACDR、RLIN、RLS等多个水稻类病斑性状相关基因.这些已经克隆基因的突变体表现出不同类型、不同程度的类病斑表型,部分突变体还表现出比其野生型更好的稻瘟病、白叶枯病抗性.如水稻类病斑突变体lsd对毒性稻瘟病菌小种的抗性明显增强;而水稻突变体

11、npr和acdr对白叶枯病的抗性提高,.水稻类病斑突变体spl、spl、ttm、spl和ssi同时对稻瘟病和白叶枯病产生抗性.同时,类病斑基因大多直接调控或间接影响水稻的防卫反应与细胞程序性死亡过程.类病斑基因的克隆与功能研究表明类病变过程非常复杂,涉及到许多生化代谢过程.因此,挖掘更多的类病斑突变体,克隆更多的相关基因,并开展详细的功能研究,有助于全面了解类病变发生机制,同时为研究水稻细胞程序性死亡和抗病机制提供借鉴.本研究以粳稻品种日本晴EMS诱变产生的一个稳定遗传的类病斑突变体lmm为材料,详细描述了该突变体的形态学特征、生理学特性,并对该突变基因进行了精细定位,以期为该基因的克隆、功能

12、研究及应用提供理论依据.材料与方法实验材料从日本晴EMS诱变突变体库中筛选到一个类病斑突变体lmm,经多代自交后类病斑性状在海南和杭州都能稳定遗传.以lmm与籼稻品种南京和培矮杂交衍生的F及F群体对lmm进行遗传分析,利用lmm与南京、培矮衍生的F群体对突变体基因进行分子定位.所有材料均于正季种植于中国水稻研究所富阳试验基地,田间管理同大田生产.遮光处理在大田自然条件下,用宽度约cm的锡箔纸对突变体lmm分蘖时期的叶片进行包裹遮光,分别对未发和已发生类病斑的叶片遮光一周;然后对遮光处揭掉锡箔纸恢复光照,跟踪观察类病斑变化.叶绿素含量的测定分别取大田自然条件下突变体lmm及其野生型分蘖期、抽穗期

13、和成熟期的叶片进行叶绿素含量测定.将g待测样品剪成mm的小片浸泡于mL乙醇,黑暗条件下放置于的冰箱中,浸提h左右.利用分光光度计测量乙醇溶液的吸光值,每组取份样品,每份样品重复测量次.按Lichtenthaler等修正的Arnon法计算叶片叶绿素含量.光合作用相关指标的测定使用Li型便携式光合测定仪,于始穗期晴天上午:分别测定突变体lmm及其野生型叶片的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)和胞间CO浓度(Ci).突变体和野生型各测定片具代表性的剑叶,光合测定仪使用红蓝光源,光量子密度mol/(ms),流速mol/s.叶绿体结构电镜观察分别取分蘖期野生型正常叶片与突变体lmm发

14、生类病斑叶片,置于戊二醛固定液中,抽真空使固定液完全渗入叶片中,电镜样品制备参照吕典华等的方法,样品制备好后利用HITACHI型透射电子显微镜对叶肉细胞中叶绿体的显微结构进行观察.叶片死亡细胞检测参照Yin等的方法分别取分蘖期有类病斑表型的突变叶片以及相应位置的野生型正常叶片用台盼蓝染色,使用体视镜(LeicaDM)观察突变体和野生型叶片中染色情况并拍照.叶片HO沉积检测参照ThordalChristensen等的方法检测突变体叶片中是否有HO的积累.中国水稻科学(ChinJRiceSci)第卷第期(年月)突变体抗性鉴定为了了解类病斑突变体lmm对稻瘟病的抗性,将lmm和野生型品种浸种、催芽后

15、,按顺序分别播种在××的有孔、装有细土的塑料盘中,每盆播个,每个供试品种播粒粒,设个重复,接种前d施氮肥,保持嫩绿;在秧苗叶期接种;选择A、A等致病性较强和致病频率较高个菌株对lmm及其野生型秧苗喷雾接种,病菌浓度约为×个孢子/mL.接种量以所有叶片上布满孢子液为限,覆盖黑色湿布保湿h,然后取出,定时喷雾保湿.d后当感病对照品种丽江新团黑谷病级达级以上时进行调查.基因定位从突变体lmm与南京衍生F群体中首先挑选出株表型为类病斑的分离单株用于lmm的连锁分析.利用本实验室均匀分布于条染色体的对公共引物对亲本进行筛多态分析,所用引物来自Matsumoto等采用的公共序

16、列.初步确定目标基因所在的染色体位置.然后在与目标基因连锁标记附近进一步开发了对存在多态的SSR标记或Indel标记(表),以株表现出类病斑表型的分离单株对突变体基因lmm进行进一步定位.为了更精细定位lmm突变体基因,同时利用突变体与培矮衍生的F群体中表现突变体性状的个分离个体对突变体基因进一步精细定位.亲本和定位群体F的植株基因组的DNA采用SDS法提取,L的PCR体系包括DNAL,×PCR缓冲液L,正反向引物(mol/L)各L,dNTPs(mol/L)L,Taq酶L,加ddHO补足L.PCR程序如下:下预变性min;下s,下s,下s,个循环;最后在下延伸min.PCR产物在非变

17、性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳,电泳结束后银染显色并读胶.防卫反应相关标记基因的表达分析采用Trizol法提取突变体和野生型植株分蘖期叶片总RNA.以经过DNase处理过的总RNA为模板,采用ReverTraAceFskkit(TOYOBO)反转录合成cDNA第链.然后利用实时荧光定量PCR方法分析各基因在突变体和野生型中的表达量.内参基因为Actin(GenBank登录号为X).实时荧光定量PCR反应体系(L)包含cDNA模板L,×SYBRqPCRMix(TOYOBO)L,前后引物(mol/L)各L,ddHOL.每个样品个重复.PCR扩增程序如下:下s;下s,下s,下s,个循环.以CT

18、计算各基因相对表达量.用于检测防卫反应相关标记基因的表达引物见表.结果与分析突变体lmm的表型在大田自然条件下,突变体lmm苗期叶片与表定位突变体基因lmm所用的引物序列TablePrimersequenceusedforlmmmapping标记Marker前引物Forwardprimer后引物ReverseprimerQTTCCATGGCACACAAGCCCTGTGCACGAACTTCCAAAGQTGGCGCAATATCTCTCTCATTCCTGCCACTTGTGTGTTGTTCTGCQCGAGGGGATTCGATCGACATCCCTTCACACTGCTCCACQGGCGTAAAGGTTTT

19、GCATGTATGATGCCATGAAGGTCAGCQCGTAAACACGAGCACACAAAGGACACACAACAGCTGCTCACTGGIndATGTCCTAATTTTCACCCAGATTTCCATAGCAGACTTATTTCAGIndGCCTAGTGGTGGAAGCATTTAAACCGGCAGGTCTGAIndTGGTTACAATAGTGCCTCACACATAATTGCTAGTAGTTAGAGIndAGTTTCTGGGTTAGGGATGTTATGAGGGTGCTGTTGGIndAAAGTCAAACGTGGACAAGCACTGGCAATTCGCTCAIndCCAAAAGTCAACCTGG

20、AACACAAATTAAATTAGGCATGIndAAATCCGAAGCGCCACTATTGATGCGGCACATCCTAQQ是SSR标记;IndInd是插入缺失标记.QtoQareSSRmarkers;IndtoIndareinsertdeletemarkers邱结华等:一个水稻类病斑突变体lmm的鉴定及其基因定位A野生型(左)和突变体lmm(右)分蘖期的植株表型;B野生型(左)和突变体lmm(右)的分蘖期叶片;C野生型(左)和突变体lmm(右)成熟期的植株表型;D野生型(左)和突变体lmm(右)的成熟期叶片.A,Phenotypeofwildtype(left)andthelmm(righ

21、t)duringthetilleringstage;B,Leafphenotypeofwildtype(left)andthelmm(right)duringthetilleringstage;C,Phenotypeofwildtype(left)andthelmm(right)duringthematuritystage;D,Leafphenotypeofwildtype(left)andthelmm(right)duringthematuritystage图类病斑突变体lmm的表型FigPhenotypesoflmmmutant其野生型一致,并没有类病斑,但是在分蘖期后期lmm植株上部叶片

22、从叶尖开始出现红褐色类病斑(图AB).随着水稻的生长,类病斑的数量逐渐增加并向整片叶片扩张,同时单个类病斑的面积也会不断变大(图CD),因此,突变体lmm属于扩散型类病斑突变体.另外,相比野生型突变体,lmm植株较为矮小,株高明显降低,结实率显著降低,每穗实粒数、千粒重均减少.相对于野生型,表防卫反应标记基因表达分析引物TableTheprimersforRTPCRofpathogenesisrelatedmarkergenes基因Gene前引物Forwardprimer后引物Reverseprimer登录号AccessionNoPRGTAAACAGGTCCACGGTCCATACCCCAGTG

23、ACAACTGACAAGGCAAAUPBZCGGGCACCATCTACACCAGCCATAGTAGCCATCCACDPALGGCATCCAGGGCGGCTTCTTCGGTCTTGCTTCGGCTTCATCAGXPOCTTCAACAACGGCAGCACGGACAATGGAACAAGAAACAGAGCAAGGCAAATCAFPOXAGTGCCAGAACTTCAGGGACAGGATCTACAACAACGAACGCATCCCGTCATACTACTCCAFActinCATGCTATCCCTCGTCTCGACCTCGCACTTCATGATGGAGTTGTATX表突变体和野生型的主要农艺性状TableThe

24、agronomictraitsoflmmandwildtype(WT)材料Material株高Plantheight/cm结实率Seedsettingrate/千粒重grainweight/g每穗实粒数Nooffilledgrainsperpanicle野生型WT±±±±突变体lmm±±±±,分别表示野生型与突变体在和水平下差异显著.,significantdifferencebetweenwildtypeandthemutantatandlevels,respectively;Mean±SD(n)中国水

25、稻科学(ChinJRiceSci)第卷第期(年月)表突变体lmm与野生型始穗期剑叶的光合特性TablePhotosyntheticcharactersoflmmmutantandwildtype(WT)atheadingstage材料Material净光合速率(Pn)Netphotosyntheticrate气孔导度(Gs)Stomatalconductance蒸腾速率(Tr)Transpirationrate胞间CO浓度(Ci)IntercellularCOconcentration野生型WT±±±±突变体lmm±±±&#

26、177;,分别表示野生型与突变体在和水平下差异显著.,significantdifferencebetweenwildtypeandthemutantatandlevels,respectivelyMean±SD(n)A,日本睛;B,遮光前lmm;C,未发生斑点部位遮光d后;D,遮光部位恢复光照d后;E,已发生斑点部位遮光d后.A,Nipponbare;B,Leafoflmmbeforeshading;C,Leafwithoutlesionaftershadingfordays;D,Leafshadedfordaysthenundernormallightfordays;E,Leaf

27、withlesionaftershadingfordays图遮光对突变体lmm叶片的影响FigEffectsofShadingonlmmleaveslmm表现一定的早衰现象(图A,表).突变体lmm类病斑发生受光照诱导对突变体lmm只在叶尖出现少量类病斑的叶片未产生类病斑部位用锡箔纸遮光一周后发现,整张叶片其他部位都产生了明显的类病斑,但是遮光处并没有类病斑产生(图AC);恢复光照一周后,原本没有类病斑的遮光处产生了明显的类病斑(图D);同时,对已经产生的类病斑的叶片进行遮光,一周后发现已产生的类病斑并不会消失,但是其他部位类病斑扩散严重,遮光处没有扩散(图E).该结果表明突变体lmm的类病斑

28、发生受自然光照诱导,适当的遮光可以阻止或减轻类病斑的发生或扩散.光合色素含量及光合速率分析对大田自然环境下分蘖期、抽穗期和成熟期三个时期野生型和突变体lmm叶片叶绿素、类胡萝卜素含量进行测定,结果表明,在分蘖期(类病斑起始期),突变体和野生型各色素指标差异不大,但在抽穗期(类病斑已形成),lmm的叶绿素、类胡萝卜素含量明显低于野生型,到成熟期,突变体的各色素含量都极显著低于野生型(图).表明lmm的突变导致了水稻叶绿素、类胡萝卜素含量的降低.为进一步了解lmm类病斑的发生是否影响了其光合作用,我们在田间测量了齐穗期的突变体和野生型的各个光合作用指标(表),结果表明lmm的净光合速率、气孔导度和

29、蒸腾速率显著低于野生型,而胞间CO浓度则显著高于野生型,这表明lmm的突变影响到了水稻叶片的光合作用.叶绿体显微结构观察分别对突变体lmm有类病斑表型的叶片和野生型的叶片进行叶绿体结构的电镜观察.结果显示野生型叶肉细胞叶绿体数目较多,基质较浓厚,基粒片层垛叠较厚,排列紧密,具有较多的淀粉粒(图AB).突变体lmm叶肉细胞内的叶绿体数目较少,叶绿体中的内囊体退化成小泡状,并且具有较多的嗜饿小体,较少的淀粉粒(图CD).该结果表明突变体lmm叶片由于类病斑的产生导致了叶肉细胞中的叶绿体结构的发育异常.突变体lmm叶片发生细胞程序性死亡和HO的沉积利用台盼蓝染色方法对突变体lmm及其野生型叶片中死亡

30、细胞进行检测,结果显示野生型叶片没有深蓝色染色,说明野生型叶片基本上没有细胞死亡(图AB);但是突变体叶片染色后整体呈淡蓝色,类病斑发生处对应着严重的深蓝色斑点,说明斑点部位有大量的细胞死亡,而在大块深蓝色染色间隙也出现了深蓝色的小点,说明类病斑正在扩展中(图CD).该结果表明lmm叶片类病斑的形成和发展可能是一个细胞程序性死亡的过程.邱结华等:一个水稻类病斑突变体lmm的鉴定及其基因定位,分别表示野生型与突变体在和水平下差异显著.,representsignificantdifferencebetweenwildtypeandthemutantatandlevels,respectively

31、图突变体lmm和野生型不同生育期叶片光合色素含量分析FigPigmentcontentinleavesoflmmandwildtype(WT)duringdifferentgrowthstages植物细胞程序性死亡时常产生活性氧的沉积.利用二氨基联苯对突变型和野生型叶片进行染色,结果显示野生型中基本没有HO沉积的红褐色斑点(图EF),突变体lmm有大量的HO沉积红褐色小斑点产生(图GH),表明lmm突变体类病斑发生可导致水稻叶片细胞活性氧的积累.突变体lmm对稻瘟病的抗性利用个稻瘟病菌株分别喷雾接种突变体lmm及其野生型进行苗期稻瘟病抗性检测,接种d后当感病对照品种病情指数达级以上时调查,突变

32、体lmm对B、B、B、C、G稻瘟病菌生理小种的抗性相对野生型明显下降,但对C、G、C、D、E、C、D、G稻瘟病生理小种抗性增强,特别是突变体lmm对C和G稻瘟病生理小种表现为高抗(图).防卫反应标记基因的表达分析利用荧光定量PCR技术分析了防卫反应标记基因PeroxidaseC(POC)、Phenylalanineammonialyase(PAL)、Probenazoleinducedprotein(PBZ)、Pathogenesisrelatedclass(PR)、Peroxidase(POX)在突变体lmm及其野生型中的表达情况,结果显示,POC、PAL、PBZ、PR在lmm中的表达量显著

33、或极显著高于野生型(图).说明突变体lmm的类病斑产生激发了水稻中与抗性相关的一些防卫反应基因的表达.突变体的遗传分析与分子定位突变体lmm分别与籼稻品种培矮和南京配制的F家系均类似于其野生型,没有类病斑发生,相对应的两个F群体中均发生正常植株和类病斑表型植株分离,分离比例符合分离比()(表),表明突变体lmm类病斑性状符合单隐性核基因控制的遗传规律.从突变体lmm与南京衍生的F群体中挑选出株表现为类病斑的分离单株将目标基因初步定位在第染中国水稻科学(ChinJRiceSci)第卷第期(年月)A,B野生型的叶肉细胞和叶绿体结构;C,D突变体的叶肉细胞和叶绿体结构.N细胞核;CP叶绿体;SG淀粉

34、粒;OG嗜锇小体;TM内囊体膜.A,B,Ultrastructuresofchloroplastsinthemesophyllcellofwildtype;C,D,UltrastructuresofchloroplastsinthemesophyllcelloflmmN,Nucleus;CP,Chloroplast;SG,Starchgranule;OG,Osmiophilicplastoglobuli;TM,Thylakoidmenbranes图野生型和突变体lmm叶肉细胞核叶绿体显微结构FigUltrastructuresofchloroplastsinthemesophyllcellof

35、wildtypeandlmmAD为台盼蓝染色;EH为二氨基联苯染色.A、C、E和G为染色前;B、D、F和H为染色后A,B,E,F为野生型叶片;C,D,G,H为突变体叶片.D图箭头指示的是细胞死亡着色斑;H图箭头指示的是过氧化氢沉积点.AD,Ttrypanbluestainingoftheblade;EH,DiaminobenzidinedyeingofthebladeA,C,EandG,Thebladebeforestaining;B,D,FandH,ThebladeafterstainingA,B,E,FarebladesofWT;C,D,G,HarebladesoflmmThearrowi

36、nDindicatecelldeathstainspot;ThearrowinHindicatetheaccumulatedHOstainspot图lmm突变体的组织化学分析FigHistochemicalanalysisofthemutantlmm色体着丝粒附近的SSR标记Q和Q之间(图A).为了进一步精细定位lmm基因,在Q和Q之间进一步开发对有多态性的SSR标记和对有多态的Indel标记,利用个表型为类病斑的F分离单株,最终将该基因定位在ind和ind之间大约kb的区域内(图BC),该区域横跨OSJNBaC、OSJNBbK、OSJNBbB、OSJNBbA这四个BAC(图D).讨论目前,在

37、水稻中已经发现了大量的类病斑突变体.这类突变体除了在无明显逆境或病原物侵染时,叶片或叶鞘上自发地形成大小、形状和颜色各异的类似病原物侵染时发生的病斑外,通常还伴随着其他各种农艺性状的改变.如突变体spl不但表现出类病斑的表型,而且在开花后该突变体植株的叶片会迅速衰老,最后在成熟期死亡,表现出严重的早衰现象.RLS基因的突变也会加速植株的衰老,表现出早衰的现象.Takahashi等鉴定的OsPtia基因突变后植株表现出严重的矮化现象.邱结华等:一个水稻类病斑突变体lmm的鉴定及其基因定位表lmm的遗传分析TableGeneticanalysisofthelmm杂交组合Hybridcombinat

38、ion正常表型植株数Noofnormalplants突变表型植株数Noofmutantplants卡方值()ChisquareP值Pvalue南京Nanjing/lmm培矮Peiai/lmm图突变体lmm稻瘟病抗性鉴定FigResistanceidentificationoflmmandwildtype(WT)toriceblastPOC过氧化氢C基因;PAL苯丙氨酸氨裂解酶;PBZ噻菌灵诱导蛋白基因;PR病程相关基因;POX过氧化氢基因.,分别表示野生型与突变体在和水平下差异显著.POC,PeroxidaseC;PAL,Phenylalanineammonialyase;PBZ,Proben

39、azoleinducedprotein;PR,Pathogenesisrelatedclass;POX,Peroxidase,representsignificantdifferencebetweenwildtypeandthemutantatandlevels,respectively图防卫反应基因定量表达分析FigExpressionanalysisofdiseaseresistancegenesFeng等年鉴定的HM突变体株高、分蘖数、穗长、每穗粒数、结实率和千粒重都显著低于其野生型.本研究鉴定的类病斑突变体lmm从分蘖期开始产生类病斑,之后类病斑的数量逐渐增加,单个类病斑的面积也会不断

40、变大,直至整个植株覆盖严重的类病斑,因此lmm属于典型的扩散型类病斑突变体.除此之外,相对于野生型,突变体lmm的株高明显降低,有效穗数减少,穗长缩短,结实率、每穗实粒数、千粒重均显著降低.因此lmm基因表现出对水稻正常生长发育具有“一因多效”的重要作用.类病斑突变体出现类病变坏死突变的原因非常复杂,主要受基因突变的控制外,同时也存在许多环境诱发因素,如光、温度、湿度等.水稻类病斑突变体spl在高温()和紫外线的诱导下产生斑点.拟南芥lin突变体类病变表型则受长日照诱导产生.Noutoshi等发现slh突变体的类病斑表型受低湿度诱导产生.本研究中的突变体lmm类病斑表型的产生受自然光照的诱导,

41、对未发生类病斑的叶片遮光处理可以阻止类病斑形成,对已发类病斑的叶片遮光则可以阻止病斑组织的扩中国水稻科学(ChinJRiceSci)第卷第期(年月)A突变体基因lmm与SSR标记Q、Q连锁;B利用个F分离单株将lmm定位在Q与Q之间;C利用个F分离单株将lmm定位与Ind和Ind约kb的区间;D目标区域覆盖个BAC.A,lmmwaslinkagedwithSSRmarkersQandQ;B,lmmwaslocatedbetweenQandQbasedonseparatedFplants;C,lmmwaslocateddownkbregionbetweenIndandIndbasedonsepa

42、ratedFplants;D,lmmtargetregioncontainingfourBAC图lmm突变体基因的精细定位FigFinemappingoflmm大(图).由于类病斑突变体类病斑的产生与植物受病原物侵染发病而产生组织坏死类似,而早前研究发现许多的类病斑突变体对某些植物病原物表现出了比野生型更好的抗性.如水稻spl、spl和spl突变体对稻瘟病病菌和白叶枯病菌的抗性有所提高,;王建军等发现lrd和lrd对白叶枯病菌具有广谱型抗性.而本研究发现我们鉴定的lmm突变体也表现出对多个稻瘟病生理小种具有一定的抗性,尤其对C和G两个生理小种的抗性明显增强(图).类病斑突变体对病原物表现出一定

43、的抗性,有可能是因为影响了一些防卫反应标记基因表达.如水稻类病斑突变体Oslsd具有明显的稻瘟病抗性,其植株内的防卫反应标记基因PR和PBZ表达显著提高;突变体ttm同时对稻瘟病和白叶枯病表现出抗性,其体内防卫反应标记基因PRb、PR、PRa和PAL的表达量都增加.在本研究中,突变体lmm中防卫反应标记基因POC、PAL、PBZ、PR的表达也出现了明显上调(图).因此,类病斑突变体的类病斑产生机理的研究也对植物抗病机理及细胞程序性死亡等相关研究具有重要借鉴意义.虽然国内外许多学者对植物类病斑产生机制进行了广泛的研究,但是由于类病斑的形成机制十分复杂,同时也受温度、光照等自然条件的影响,类病斑的

44、形成机制目前仍然不是十分清楚,因此还需要更多相关基因的克隆与功能研究.目前在第染色体上共鉴定出个水稻类病斑基因spl、spl和OsPtia.其中spl暂无定位信息,另外两个已经被克隆,其中spl位于第染色体长臂末端;而OsPtia位于第染色体短臂末端.本研究定位到的lmm位于第染色体着丝粒附近,因此lmm是一个新的类病斑基因.本研究关于突变体lmm的生理学、细胞学及分子遗传学研究为lmm基因的克隆与功能研究打下了基础,对于探索水稻类病斑发生机制及抗病反应机制具有重要意义.参考文献:HuG,RichterTE,HulbertSH,etalDiseaselesionmimicrycausedbym

45、utationsintherustresistancegenerpPlantCell,():DanglJL,DietrichRA,RichbergMHDeathdonthavenomercy:CelldeathprogramsinplantmicrobeinteractionsPlantCell,():陈析丰,金杨,马伯军水稻类病变突变体及抗病性的研究进展植物病理学报,():王建军,朱旭东,王林友,等水稻类病变突变体lrd的抗病性与细胞学分析中国水稻科学,():邱结华等:一个水稻类病斑突变体lmm的鉴定及其基因定位QiaoYL,JiangWZ,LeeJH,etalSPLencodesaclat

46、hrinassociatedadaptorproteincomplex,mediumsubunit(APM)andisresponsibleforspottedleafandearlysenescenceinrice(Oryzasativa)NewPhytol,():黄奇娜,杨杨,施勇烽,等水稻斑点叶变异研究进展中国水稻科学,():YamanouchiU,YanoM,LinH,etalAricespottedleafgene,Spl,encodesaheatstresstranscriptionfactorproteinProcNatlAcadSci,():ZengLR,QuSH,Bordeo

47、sA,etalSpottedleaf,anegativeregulatorofplantcelldeathanddefense,encodesaUbox/armadillorepeatproteinendowedwithEubiquitinligaseactivityPlantCell,():WangLJ,PeiZY,TianYC,etalOsLSD,aricezincfingerprotein,regulatesprogrammedcelldeathandcallusdifferentiationMolPlantMicrobeInteract,():YuanYX,ZhongSH,LiQ,et

48、alFunctionalanalysisofriceNPRlikegenesrevealsthatOsNPR/NHisthericeorthologueconferringdiseaseresistancewithenhancedherbivoresusceptibilityPlantBiotechnolJ,():KimJA,ChoK,SinghR,etalRiceOsACDR(Oryzasativaacceleratedcelldeathandresistance)isapotentialpositiveregulatoroffungaldiseaseresistanceMolCell,():MoriM,TomitaC,SugimotoK,etalIsolationandmolecularcharacterizationofaSpottedleafmutantbymodifiedactivationtagginginricePlantMolBiol,():TakahashiA,AgrawalGK,YamazakiM,etalRicePtiane