实时荧光定量PCR技术

1、2021-11-161实时荧光定量PCR技术暨南大学医学院中心实验室廖继东2021-11-162主要内容 实时荧光定量实时荧光定量PCR的基本原理的基本原理 Chromo4介绍介绍 实时荧光定量实时荧光定量PCR实验程序的建立实验程序的建立 实时荧光定量实时荧光定量PCR的应用的应用2021-11-163主要内容 实时荧光定量实时荧光定量PCR的基本原理的基本原理 Chromo4介绍介绍 实时荧光定量实时荧光定量PCR实验程序的建立实验程序的建立 实时荧光定量实时荧光定量PCR的应用的应用2021-11-164PCR: polymerase chain reaction多聚酶链式反应英文词首字

2、母的缩写，是一种体外选择性扩增DNA或RNA片段的方法。其基本原理是依据DNA双螺旋结构及其半保留复制特性，用人工合成的小片段2021-11-165寡核甘酸引物与经高温（变性温度）变性形成的单链DNA模板，在特定温度（复性温度）下产生序列特异性互补结合，在适当温度（延伸温度）条件下，由DNA多聚酶催化使已经结合的寡核甘酸引物沿模板序列延伸产生与模板序列2021-11-166完全互补的新的DNA单链。 PCR技术自1985年由美国PE公司的Mullis等发明并推出市场应用以来，实现了小片段DNA的体外快速扩增，为各种因DNA序列的变异、缺失以及由此导致的遗传缺陷和相关疾病的研究和临床诊断提供了强

3、有2021-11-167力的手段，为各种病原体包括微生物、细菌、病毒等所致疾病的快速确诊提供了技术条件，极大地促进和加速了整个生命科学研究的进程。2021-11-168 在PCR反应中，理论上扩增产物的量与起始样本中模板的含量成正比。但受多种因素的影响，其精确定量模板的可信度明显不足。为克服上述不足，人们设计出包括内标、竞争、酶联、尿苷酶降解等多种定量方法。2021-11-169 在不同的PCR反应管中加入已知量的内标模板和引物，内标模板可由基因工程合成或采用已知量的标准品。在样品模板扩增的同时，内标模板也被扩增。二者的扩增产物可通过电泳或其它方法分离，以内标为对照进行样本模板定量。2021-

4、11-1610 将含有一个新内切酶位点的外源性模板加入PCR反应管中，待测样品模板与外源性模板用同一对引物进行扩增，经内切酶消化竞争性模板的产物成为两个片段，通过电泳等分离检测，根据已知模板的量推测未知模板的起始拷贝数。2021-11-1611 利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固定在固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素抗体辣根过氧化物酶结合物，检测酶底物显色情况，通过内标标准曲线实现定量检测的目的。2021-11-1612 作为扩增系统的阳性对照； 作为未知样本定量的参比标准； 通过竞争性作为矫正扩增系统内部的 扩增效率，使其具有可比性。1.（参照物按其性质不同可分为内标和

5、外标）2021-11-1613内标基因的选择 原则：内标基因在不同组织或者处理前后表原则：内标基因在不同组织或者处理前后表达量不变达量不变 内标基因的选择内标基因的选择 一般选取一般选取GAPDHGAPDH、 -actin-actin等看家基因等看家基因(GAPDH:Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, 3磷酸甘油醛脱氢酶)2021-11-16141.定量的准确度：传统PCR定量方法的共同特点是针对PCR扩增的最终产物进行分析。因受酶活性、扩增效率、尤其是平台效应等诸多因素的影响，检测重现性极差，无法直接从终产物量推算出起始模板的精确含量。2021

6、-11-16152.假阳性污染：传统PCR定量方法均依赖于各种不同类型的PCR后处理过程，这些过程极易使数量巨大的PCR扩增产物飞散到实验室的环境中，造成待检样本的污染，导致假阳性结果的上升。2021-11-1616 在PCR反应体系中引入，对每一扩增反应的累积情况进行记录实现对定量及定性的分析。其特点为全封闭（污染少）、高精确、高灵敏。2021-11-1617对PCR扩增反应的进行定量及定性分析。 通过引入或，对PCR扩增反应过程中每一轮循环的累积进行检测，从而实现对的及定性分析。实时，荧光，定量实时，荧光，定量2021-11-1618S1 S2 M2021-11-1619荧光共振能量转移荧

7、光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer,FRET）：）：在两个不同的荧光基在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团（团中，如果一个荧光基团（供体供体）的发射光谱与）的发射光谱与另一基团（另一基团（受体受体）的激发光谱有一定的重叠，当）的激发光谱有一定的重叠，当两个基团之间的距离足够近（小于两个基团之间的距离足够近（小于100100）时，以）时，以供体供体基团的激发波长进行基团的激发波长进行激发激发，可获得由，可获得由受体受体基基团团发射发射的荧光的荧光。2021-11-1620荧光共振能量转移荧光共振能量转移即：在供体基团的激发状态下由一对

8、偶极即：在供体基团的激发状态下由一对偶极子介导的子介导的能量能量直接直接转移转移给了受体。在此过程给了受体。在此过程中中没有没有光子光子的的参与参与，是非辐射性的能量转移，是非辐射性的能量转移过程，转移效率与供受体两个基团之间距过程，转移效率与供受体两个基团之间距离的离的6 6次幂倒数成正比例。次幂倒数成正比例。2021-11-1621FRET产生条件产生条件1.存在荧光供体和受体，存在荧光供体和受体，而且供体的发色光谱与而且供体的发色光谱与受体的激发光谱有重叠受体的激发光谱有重叠 常用的常用的FRET组合：组合： CFP-YFPCFP-YFP/CFP-dsRED/CFP-dsRED/BFP-

9、GFPBFP-GFP/ / GFP-dsRED/YFP-dsRED/ GFP-dsRED/YFP-dsRED/ Cy3-Cy5/Alexa488-Alexa555/ Cy3-Cy5/Alexa488-Alexa555/ Alexa488-Cy3/FITC-TRITC/ Alexa488-Cy3/FITC-TRITC/ YFP-TRITC/YFP- Cy3 YFP-TRITC/YFP- Cy32021-11-1622 2 供体和受体的距供体和受体的距离足够近：离足够近：1-10nm （110nm为分子内为分子内/间互作的距离：间互作的距离： 如蛋白质构象转如蛋白质构象转 变、酶催变、酶催化反化反

10、 应等。）应等。） 超显微观察超显微观察 3 合适偶极方向合适偶极方向 4 足够荧光寿命足够荧光寿命无FRETFRETFRET产生条件产生条件2021-11-1623荧光域值线荧光域值线（fluorescence threshold line）：）：背景背景荧光与荧荧光与荧光信号的分界值，光信号的分界值，可以通过标准曲可以通过标准曲线或经验来设定，常设定为初始线或经验来设定，常设定为初始3-7个循环荧光值标准差的个循环荧光值标准差的10倍。倍。2021-11-1624Threshold line C(t) value ： 是在是在PCR扩增过程中，各反应管的扩增过程中，各反应管的荧光信号与荧光

11、域值线的交叉点所对应的荧光信号与荧光域值线的交叉点所对应的循循环次数环次数（指数扩增的开始阶段指数扩增的开始阶段）。）。2021-11-1625q每个模板的每个模板的CtCt值与该值与该模板的起始拷贝数的模板的起始拷贝数的对数值存在线性关系。对数值存在线性关系。起始拷贝数越多，起始拷贝数越多，CtCt值越小。值越小。q用已知起始拷贝数的用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲标准品可作出标准曲线，由此可对样本中线，由此可对样本中目标基因的含量进行目标基因的含量进行精确计算精确计算。2021-11-1626unknown104103Unknown contains 3108 copies2021-1

12、1-1627实时荧光定量实时荧光定量PCR方法利用循环阈方法利用循环阈值（值（CtCt）的概念，在指数扩增的开始）的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该差尚未放大，因此该CtCt值具有极好的值具有极好的重复性。重复性。 2021-11-1628 相同模板在同一台相同模板在同一台PCR仪上相同条件仪上相同条件下重复下重复96次扩增的扩增曲线图次扩增的扩增曲线图 终点处检测产物量不恒定；终点处检测产物量不恒定；Ct值则极值则极具重现性具重现性 2021-11-1629可检测10 100个细胞中个拷贝数量的基因2021-11-163

13、0(6-9个数量级) 可以在一次实验中同时检测定量高表达和低表达基因 荧光探针使荧光探针使PCRPCR产物检测特异性进一步提高产物检测特异性进一步提高无PCR后处理 *几乎没有污染机会2021-11-16312021-11-16322021-11-16332021-11-16342021-11-16352021-11-16362021-11-16372021-11-16382021-11-1639 结合到双链DNA的小沟部位 染料只有和双链DNA结合后才发荧光。GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA2021-11-1640Bound SYBR Green IU

14、nbound SYBR Green IPCR2021-11-16412021-11-1642Temperature increasesFluorescencedecreasesTm2021-11-1643-dIdTTm2021-11-1644优化的读板温度优化的读板温度 - 高于非特异产物的高于非特异产物的Tm值值 - 低于目标产物的低于目标产物的Tm值值AmpliconNon-specificproducts2021-11-1645不同读板温度对实验结果的影响：802021-11-1646不同读板温度对实验结果的影响：862021-11-1647SYBR Green ISYBR Green

15、I反应体系的设计反应体系的设计反应体系的组成：反应体系的组成：传统传统PCRPCR反应体系反应体系+ SYBR Green I+ SYBR Green I1. SG1. SG浓度：浓度：终浓度终浓度1:5,0001:5,0001:100,0001:100,000，一般为一般为1:10,0001:70,0001:10,0001:70,0002021-11-1648 2. Primer2. Primer浓度：浓度： 设计原则同普通设计原则同普通PCRPCR 终浓度终浓度50nM50nM300nM300nM 固定摸板浓度的梯度实验固定摸板浓度的梯度实验 不加摸板的对照实验（不加摸板的对照实验（NTC

16、NTC） 有无非特异信号有无非特异信号SYBR Green ISYBR Green I反应体系的设计反应体系的设计2021-11-1649 熔解曲线的分析熔解曲线的分析是否单峰是否单峰 建议使用建议使用HPLC纯化的引物纯化的引物3. MgCl2浓度浓度 降低降低MgCl2浓度以减少非特异性产物浓度以减少非特异性产物 最低可至最低可至1.5nM同时做梯度实验和同时做梯度实验和NTC对照对照SYBR Green ISYBR Green I反应体系的设计反应体系的设计2021-11-1650 4. 反应温度和时间参数：反应温度和时间参数： 反应温度参考所用酶的种类；反应温度参考所用酶的种类； 退火

17、温度使用温度梯度功能优化；退火温度使用温度梯度功能优化；反应时间与常规反应时间与常规PCR类似；类似；扩增片断一般为扩增片断一般为200300bp。SYBR Green ISYBR Green I反应体系的设计反应体系的设计2021-11-1651SYBR Green ISYBR Green I的特点和不足的特点和不足 不涉及特异的探针，方法设计不涉及特异的探针，方法设计简单简单，特异特异性差性差； 荧光强度依赖于体系中所有的荧光强度依赖于体系中所有的dsDNAdsDNA分子，分子，不能区分引物二聚体、非特异性扩增片断等；不能区分引物二聚体、非特异性扩增片断等；1.1.通过绘制溶解曲线可较好地

18、保证特异性。通过绘制溶解曲线可较好地保证特异性。 2021-11-1652探针探针荧光素荧光素淬灭剂淬灭剂水解型杂交探针水解型杂交探针2021-11-1653q目标特异性探针q5 为荧光素， 3 为淬灭剂5 荧光素3淬灭剂与目标序列互补2021-11-1654RQReporterQuencherRQIntact probe - reporter quenched by FRETFRRQDuring PCR, probe hybridizes to target sequenceRQProbe is partially displaced during extensionRQProbe clea

19、ved by 5- 3 nuclease activity of polymeraseRQFree reporter exhibits unquenched fluorescence2021-11-1655Taqman探针反应体系的设计引物、探针设计原则：优先选择探针的序列；Tm值应比引物的Tm值高810度（6870）；GC含量：3080；长度不应超过30碱基，18-30bp, optimal 20 ；5端不应是G，G有可能会淬灭荧光素。 2021-11-1656Taqman探针反应体系的设计选择合适的模板链，使探针的选择合适的模板链，使探针的CsGs；扩增片断不超过扩增片断不超过400bp，

20、通常为，通常为80150bp。避免相同碱基连续出现，特别是四个或四个避免相同碱基连续出现，特别是四个或四个以上以上Gs连续出现；连续出现；引物应尽量靠近探针；引物应尽量靠近探针；引物的引物的Tm值为值为5960度，长度约度，长度约20碱基；碱基；避免引物、探针之间的二级结构。避免引物、探针之间的二级结构。2021-11-1657引物、探针浓度的优化引物、探针浓度的优化 目标：最高的信号/背景比，最小的Ct值 引物浓度：50nM900nM 探针浓度：50nM250nM 通过多次实验确定各自的浓度和比例Taqman探针反应体系的设计2021-11-1658Taqman探针的不足采用荧光淬灭及双末端

21、标记，淬灭难以彻底，本底较高；采用酶外切活性，受酶性能影响；探针标记成本较高。改进：用不发光的淬灭荧光分子取代TAMRA2021-11-1659发夹型杂交探针发夹型杂交探针2021-11-1660茎由互补配对的序列组成茎由互补配对的序列组成环与目标序列完全配对环与目标序列完全配对茎茎荧光素荧光素淬灭剂淬灭剂环环2021-11-1661Target-loop interaction more stable than stem-stemTACCGGGGGTTACGAACG GTAATTTTTGCCCCCAAAAQRTarget2021-11-1662q对目标序列有很高的特异性；对目标序列有很高的特

22、异性；q是用于是用于SNPSNP检测的最灵敏的试剂之一；检测的最灵敏的试剂之一；q采用非荧光染料作为淬灭分子，荧光采用非荧光染料作为淬灭分子，荧光本底低；本底低；q不能完全与模板结合，稳定性差；不能完全与模板结合，稳定性差；q探针合成标记较复杂。探针合成标记较复杂。2021-11-1663引物引物/ /探针设计和评估相关的免费网站探针设计和评估相关的免费网站 1引物引物/探针的设计探针的设计 Primer 3 (Whitehead Institute, MIT)/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi GeneFisher (

23、Bielefeld University)h t t p : / / b i b i s e r v. t e c h f a k . u n i - b i e l e f e l d . d e / c g i -bin/gf_submit?mode=STARTUP&qid=na&sample=dna 2021-11-1664 1引物引物/探针的设计探针的设计 Fast PCR (Biocenter, University of Helsinki)http:/www.biocenter.helsinki.fi/bi/bare-1_html/oligos.htm PerlPr

24、imer (Owen Marshall)http:/ Primer Design Assistant (Division of Biostatistics and Bioinformatics, National Health Research Institutes).tw/primer/ 引物引物/ /探针设计和评估相关的免费网站探针设计和评估相关的免费网站2021-11-16652.2.反转录反转录 (RT) PCR (RT) PCR 引物设计引物设计 ExonPrimer (Technische Universitt, Mnchen)http:/ihg

25、.gsf.de/ihg/ExonPrimer.html AutoPrimer (Deutsches Krebsforschungszentrum)http:/www.autoprime.de/ 3.引物特异性的验证 Blast (NCBI)/BLAST/ 引物引物/ /探针设计和评估相关的免费网站探针设计和评估相关的免费网站2021-11-16664引物引物/探针特性的评估探针特性的评估 OligoAnalyzer (IDT)http:/ Oligo Analysis & Plotting Tool (Operon/Qiagen)ht

26、tp:/ NetPrimer (Premier Biosoft)http:/ /探针设计和评估相关的免费网站探针设计和评估相关的免费网站2021-11-1667 Gene Walker (Cybergene)http:/www.cybergene.se/primerdesign/genewalker/genewalker11.html Oligonucleotide Analyzer (RNAture) http:/ Oligonucleotide Properties Calculator (Northwestern University)http:/www.basic.northweste

27、/biotools/oligocalc.html mfold (Michael Zuker, Rensselaer Polytechnic Institute)/applications/mfold/old/dna/ 引物引物/ /探针设计和评估相关的免费网站探针设计和评估相关的免费网站2021-11-16685 5扩增子二级结构的评估扩增子二级结构的评估 mfold (Michael Zuker, Rensselaer Polytechnic Institute)/applicat

28、ions/mfold/old/dna/ 引物引物/ /探针设计和评估相关的免费网站探针设计和评估相关的免费网站2021-11-1669 实时荧光定量实时荧光定量PCR的原理的原理 实时荧光定量实时荧光定量PCR的应用的应用 Chromo 4介绍介绍 2021-11-1670实时荧光定量PCR技术的应用 病原体检测；病原体检测；肿瘤研究；肿瘤研究；基因表达研究；基因表达研究；免疫组份分析；免疫组份分析；基因突变及多态性的研究基因突变及多态性的研究2021-11-1671实时荧光定量PCR技术的应用 病原体检测：病原体检测：检测患者血清中肝炎病毒浓度为临床药物检测患者血清中肝炎病毒浓度为临床药物治

29、疗和疗效观察提供依据；治疗和疗效观察提供依据；检测检测HIV的量预测发病时间；的量预测发病时间；选择治疗药物：干扰素对肝炎病毒高拷贝选择治疗药物：干扰素对肝炎病毒高拷贝者不敏感，对低拷贝者敏感。者不敏感，对低拷贝者敏感。2021-11-1672实时荧光定量PCR技术的应用 肿瘤研究：肿瘤研究：癌基因及其相关基因的定量检测可进行癌基因及其相关基因的定量检测可进行肿瘤的早期诊断、分型、分期和预后判肿瘤的早期诊断、分型、分期和预后判断；断；检测治疗中和治疗后微量残余恶性细胞检测治疗中和治疗后微量残余恶性细胞存在的数量，作为治疗效果和估计复发存在的数量，作为治疗效果和估计复发危险性的依据。危险性的依据

30、。2021-11-1673基因差异表达研究 标准曲线法 使用标准曲线来确定基因表达上的差异 相对定量法(2Ct法) 不使用标准曲线，直接分析得到基因差异表达的倍数关系2021-11-1674标准曲线法步骤：1.通过标准曲线分别测出目标基因和内标基因的量2.均一化校正（Normalization)3.比较不同样品间目标基因表达差异2021-11-1675相对定量法前提目标基因和看家基因的扩增效率一致，且接近100。步骤步骤 通过实时荧光曲线得到目标基因和看家基因的Ct值 均一化校准 Ct=Ct目标基因Ct看家基因 Ctn= Ctn Ct0（不同时间、不同组织) 基因差异表达的倍数2Ct2021-

31、11-1676基因突变及多态性-SNP检测2021-11-1677 使用TaqMan 探针 (双色法) 溶解曲线 (单色法) 序列特异PCR (单色法)2021-11-1678FRFQGVQTCSNP G/AFQGVQTForward primerReverse primerAllele-specific probeAllele-specific probe用用TaqManTaqMan探针进行基因型分析探针进行基因型分析2021-11-1679QF5 GCQ5 3 CGFQV5 3 CTQ5 3 Hybridization of TaqMan ProbeDigestion of probe -

32、 fluorescenceNO digestion of probe - NO fluorescenceTVQGFQMatch for Allele 1Reduced Efficiency of Probe HybridizationMismatch for Allele 1Polymerase2021-11-1680q从病人血液样品中提取 DNA q基因型分类：qA/A (Allele 1)qG/G (Allele 2)qG/A (Heterozygote)CFQTVQ2021-11-1681 Allele 1 controlVICFAM2021-11-1682 Allele 2 contr

33、olVICFAM2021-11-1683 Heterozygote controlFAMVIC2021-11-1684SampleFAMVICGenotype121.8022.70G/A2N/A20.00A/A321.2022.70G/A4N/A21.10A/A5N/A21.40A/A6N/A20.67A/A2021-11-1685T5PCR primers with SNP site at 3 endC5 末端不匹配会导致PCR效率上有大约1000倍的差异，由此导致产物积累会有10个cycles延迟 末端匹配与否，与反应终产物量的多少没有必然联系 PCR #1PCR #22021-11-16

34、86MatchMismatch2021-11-1687Amplicon 1Amplicon 2GCHigher Tmdistinct thermal profileLower Tmdistinct thermal profile2021-11-16882021-11-1689TaqMan MicroRNA 分析方法加长靶基因的反转录荧光定量PCR2021-11-1690miRNAs的研究 MicroRNAs 是一种内源性长度在个碱基左右的RNA分子，它在动植物中具有重要的基因调控作用，它们通过与 mRNAs结合抑制翻译或造成 mRNAs 被酶解切割而起作用 目前在各种生命体中发现的miRNAs

35、类型共有约 700种以上,通过实验验证或经数据库和软件推测 其中人源的约有种 高丰度存在：平均每个细胞中约有50,000个拷贝2021-11-1691为什么miRNAs非常重要 ? MicroRNAs 是一类新的基因调控因子 某些miRNAs控制了动植物的发育 理解miRNA 的功能将帮助现在流行的siRNA 实验结果：RNA干扰基因沉默 MicroRNAs 有可能成为新型的疾病标志物 MicroRNAs 可能具有重要临床应用价值2021-11-1692现有的miRNA检测方法 克隆法Cloning 杂交法Northern Blot Ribonuclease Protection-based PAGE电泳法 基因芯片法Microarray-based miRNA profiling 上列各种方法均未被证实是有效，准确并且是高度重现的：不少小RNA间只有一个碱基的不同2021-11-1693miRNAStep 1:Stem-loop RTStep 2:Real-time PCRFQOligos required per miRNASp