SDSAGE蛋白电泳方法

1、SDS-PAGE一. 实验原理SDS 是一种阴离子表面活性剂，在蛋白质溶液里加入 SDS 和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白 质分子中的二硫键还原， SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白 质-SDS 复合物。在一定条件下，SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 1.4:1。由于十二烷基磺酸根 带负电，使各种蛋白质的 SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的 电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。SDS 与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质-SDS 复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪 茄烟形的长椭

2、圆棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样，约为 1.8nm ，而长轴则随蛋白 质的 Mr 成正比的变化。基于上述原因，蛋白质 -SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白 质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度有关， 也就是蛋白质 Mr 的函数。二. 试剂器材30%凝胶贮液(100mL):称取试剂Acr 29.2g和Bis 0.8g置于100mL烧杯中， 向烧杯中加入约60mL双蒸 水，充分搅拌溶解后加双蒸水定容至 100mL，置于棕色瓶内 4C贮存，每过 1-2 个月应重新配制；注意:丙稀酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收， 其作用有积累性，配制时应戴手套和口罩等。分

3、离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-HCI，pH 8.8，100mL):称取 Tris 18.2g 溶于约 80mL 双蒸水，用 6mol/L 的HCI 调整 pH 值至 8.8,加双蒸水定容到 100mL，4C贮存；堆积胶缓冲液(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8，100mL):称取 Tris 6.00 容于约 80mL 双蒸水，用 1mol/L 的HCl 调整 pH 值至 6.8,加双蒸水定容到 100mL，4C贮存；电泳缓冲液(1L):称取试剂 Tris 3.03g 和甘氨酸 14.40 置于 500mL 烧杯中， 向烧杯中加入约 400mL 双蒸 水充分溶解，再加入 10

4、%SDS 溶液 1.0mL，以双蒸水定容至 1L 伯然 pH 值为 8.3,无需再调)，4C贮 存，可重复使用 5-6 次；2 劝卩样缓冲液(10mL):取下列试剂置于 10mL 塑料离心管中0.5mol/L Tris-HCl 缓冲液(pH6.8)2.0mL10%SDS 溶 液4.0mL甘油2.0mL巯基乙醇2.0mL分离胶缓冲液（mL）10.0溴酚蓝0.02g混匀后 1mL 分装，-70C可贮存 6 个月；10%AP:称取（NH4）2SO31.0 g,溶于 10.0mL 双蒸水中，分装成每份 1mL, -20C贮存；TEMED :分装成每份 1mL，4C避光贮存；水饱和正丁醇 （100mL）

5、:在玻璃瓶中加入 50mL 双蒸水和 50mL 正丁醇， 振摇。 上层相即水饱和正丁 醇，室温下可长期保存。染色液（100mL）:称取考马斯亮蓝 R-250 0.25g 加入双蒸水 40.0mL、甲醇 50.0mL 和乙酸 10.0mL,搅拌溶解后滤纸过滤除去不溶颗粒；脱色液（1L）:分别取甲醇 50mL 和乙酸 75mL，加双蒸水 875mL 稀释。其他器材：容量瓶（1L、100ml、10ml）、烧杯、离心管（15ml、1.5ml）、移液器、移液器吸头、干燥器、涡旋振荡器和废液缸等。分离胶配方（100mL，4 块胶）贮液分离胶中丙烯酰胺的终浓度(%)8.09.010.011.012.013.

6、014.015.016.017.018.0凝胶贮液（mL）26.6730.0033.3336.6740.0043.3346.6750.0053.3356.6760.00分离胶缓冲液（mL）25双蒸水（mL）46.5343.2039.8736.5333.2029.8726.5323.2019.8716.5313.2010%SDS (mL)1.010%AP (mL)0.75TEMED (mL)0.05 （抽气后添加）堆积胶配方（40mL，4 块胶）堆积胶中丙烯酰胺的终浓度（）贮液3.04.05.0凝胶贮液(mL)4.005.366.66将凝胶浸泡在染色液中，置于摇床上染色4hr，染色液可回收重复利

7、用双蒸水(mL)25.3624.0022.7010%SDS(mL)0.410%AP(mL)0.2TEMED(mL)0.04 (抽气后添加)三操作步骤样品处理：在密封的螺盖微量离心管中， 用 2X加样缓冲液按 1:1 稀释蛋白质样品溶液， 于 100C煮沸 3- 5min，分子质量标准品也经上述处理。凝胶制备：将玻璃板用蒸馏水清洗干净，再用 75%的酒精去脂，干燥后固定在灌胶支架上；配制 12%的分离胶，加入 TEMED 前抽真空 10min 以除去丙烯酰胺溶液中的空气；加入TEMED 后轻轻振荡混匀，迅速注入安装好的玻璃板的间隙中，给堆积胶留出约1cm 的空间。在丙烯酰胺溶液上覆盖一层水饱和的

8、正丁醇，以防止空气扩散到凝胶中抑制聚合作用，并保证凝胶 表面水平；在室温条件下，凝胶应在 30min-50min 内聚合完成。凝胶聚合后凝胶和上层液相之间 可见折射率的变化；倒掉覆盖层并用蒸馏水清洗凝胶顶部数次，并用滤纸条吸净残留的蒸馏水，注意勿破坏凝胶 表面；制备堆积胶并迅速注入分离胶上，立即插入干净的梳子，不要混入气泡，以一定的角度将 梳子插入堆积胶能减少气泡的产生。堆积胶聚合后小心移去梳子，避免破坏加样孔，用蒸馏水小 心清洗加样孔，以除去未聚合的丙烯酰胺。加样：将凝胶固定在电泳装置上，电泳上槽内加入电泳缓冲液没过加样孔，并检查有无渗漏。倾斜整个装置以赶走凝胶下面可能留有的气泡；按预定顺序

9、加样，每孔加入20 L,在对照孔中加入分子质量标准品 6-7 L，如有空置的加样孔，加入等体积的 1X加样缓冲液。电泳：将电泳装置与电源相连，正极接下槽、负极接上槽进行电泳，样品在堆积胶阶段电压为80V，而在分离胶阶段电压调整为 120V。直到溴酚蓝到达分离胶的底部后，关闭电源，断开电 极。从电泳装置上卸下玻璃板，用小铲子剥下凝胶后切除一角以标注凝胶方位。染色：脱色：染色结束后，将凝胶浸泡在脱色液中，置于摇床上脱色过夜，其间更换脱色液3 次.记录：将显示蛋白条带的凝胶用凝胶成像仪拍照，记录试验结果，并根据分子质量标准品计算目标 蛋白的分子量。四.注意事项：SDS 与蛋白质的结合按质量成比例，蛋白质含量不可以超标，否则SDS 结合量不足。用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时，必须同时作标准曲线，并且SDS-PAGE 测定分子量有 10%误差。有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（a-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在巯基乙醇和SDS 的作用下解离成亚基或多条单肽链。因此，对于这一类蛋白质， SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 测定的只是它们的