豚鼠气道平滑肌的急性分离及KATP通道单通道电流的记录

1、豚鼠气道平滑肌的急性分离及KATP通道单通道电流的记录【摘要】 目的：建立急性分离豚鼠气道平滑肌的方法，并初步分析ATP敏感钾通道(KATP通道)单通道电流的性质。方法：急性分离出豚鼠34级支气管，并用链霉蛋白酶E分散气道平滑肌细胞，应用膜片钳技术的内面向外式记录方法，研究气道平滑肌KATP通道单通道电学性质。结果：成功记录到电导为112.4±5.14 pS的、可被优降糖所阻断的KATP通道单通道电流。钳制电压在0-60 mV之间，通道电流无整流现象，且未见时间依赖性失活。结论：建立了急性分离豚鼠气道平滑肌的方法，并成功记录KATP通道单通道电流，为进一步研究气道平滑肌KATP通道在

2、呼吸道疾病中的作用提供了基础。 【关键词】 气道平滑肌; 急性分离; ATP敏感钾通道; 单通道电流气道平滑肌的主要作用是调节气道的紧张度和口径1。气道平滑肌收缩是呼吸系统疾病中气道阻力增高的主要原因之一。多种ATP敏感钾通道(ATPsensitive potassium channel, 简称KATP通道)开放剂，如吡那地尔(pinacidil)2、克罗卡林(cromakalim)3，可以使气道平滑肌松弛，并且这种作用能被KATP通道特异性阻断剂优降糖所阻断。因此，KATP通道在调节气道平滑肌的舒张和收缩中起着重要作用，但其单通道电学性质一直未能阐明。本研究利用改进的气道平滑肌分离方法分离细

3、胞，并用膜片钳技术研究了气道平滑肌KATP通道的单通道性质，为进一步研究KATP通道在呼吸道疾病中的作用提供了基础。2 / 141 材料和方法1.1 支气管平滑肌细胞急性分离气管组织制备和保持：取健康豚鼠(雌雄不分)，体重300400 g，用3%的戊巴比妥钠盐4 ml/kg腹腔麻醉后，取出气管和肺组织，立即置于4 用95%O2+5%CO2饱和的HPSS液(成分(mmol/L)：NaCl 126，KCl 5，HEPES 10，CaCl2 2，MgSO4 2，DGlucose 10,pH7.3(NaOH)中。分离两侧肺组织中的34级支气管。去除上皮细胞和外侧面的结缔组织和肺组织后，放入含10 ml

4、 HPSS液的浴槽底部平衡。内含青霉素(20 U/L)和链霉素(20 g/ml)。温度保持在32 ，通以95%O2+5%CO2混合气。分离支气管平滑肌细胞： 取3 ml HPSS液和4.5 mg链霉蛋白酶E(Pronase E)放入10 ml离心管中，将切成1 mm2的支气管组织放入底部，上方通以混合气，温度37 ，pH7.4。消化3040 min后洗去残余酶。在HPSS液中，用针头将气管组织分离成丝状，在常温下分别用尖端抛光处理的直径为300 m和150 m的Pasteur吸管连续吹打，使组织分散，细胞游离。取上部细胞悬液，置于HPSS液中，放在4 冰箱保存，供6 h内使用。整个消化过程需通

5、以95%O2+5%CO2混合气。实验时，取细胞悬液加到培养皿内的盖玻片上，此盖玻片事先涂有0.1%的多聚赖氨酸。静置10 min后，加入2ml HPSS液洗去盖玻片上多余的组织碎片和未附着在盖玻片上的细胞。镜下观察细胞形态。通道记录仅选用细胞膜完整、有立体感、胞体呈梭形的细胞。1.2 单离子通道记录与分析采用膜片钳技术的内面向外式。浴槽液成分为(mmol/L)：KCl 140，CaCl2 1，NaCN 2，HEPES 10。电极液成分为(mmol/L)：KCl 140，CaCl2 2，MgCl21，TTX0.001，CdCl20.3，HEPES 10。加入TTX和CdCl2的目的在于分别阻断电

6、压依赖性Na+和Ca2+通道。通过通道可被优降糖(10 mol/L)所阻断，确定为ATP敏感钾通道。在实验之前，所有溶液的pH值均调到7.2，并用0.22 m的醋酸纤维微孔滤膜过滤，以除去灰尘颗粒和细菌。实验在室温下进行(2127 )。记录用微电极尖端直径约为0.51 m，内灌电极液后，电阻为816 M。内插乏极化氯化银电极与膜片钳放大器探头相连。单通道电流用膜片钳放大器(CEZ2200，日本光电)放大，放大器探头反馈电阻为10 G，低通滤波器滤波频率为3 kHz，用四道磁带录音机(RMG5204，Kohden)记录资料。将记录在磁带上的电信号，经带有TL1125接口的125 kHz Labm

7、aster DMA数据采集系统和pCLAMP 5.5.1版电信号采集程序(Axon Instrument，美国)资料输入计算机，用pCLAMP分析程序Fetchan测量通道电流幅度和时程。将测量获得的资料转入pCLAMP的Pstat程序作统计处理。1.3 资料分析数据均用均数±标准差表示。参数比较是在应用方差齐性检验后，用t检验进行分析，P<0.05为差异显著。2 结果2.1 单通道电流实验中，浴槽液和电极液均使用高钾液(K+浓度为140 mmol/L)。因此，当细胞内面向外式记录形成后，膜内侧面对浴槽液，此时K+平衡电位Ek为0 mV，电极下膜片的跨膜电位Vm=-Vp

8、。当Vp=0 mV时，未能记录到任何通道活动;若在此基础上去极化，便可记录到外向通道电流。电流幅度在同一钳制电压下基本相同，呈时间不等的方波。其幅度分布直方图呈对称的单峰状，能很好地进行正态分布拟合。表1显示的是不同钳制电压下单通道电流幅度的算术均数与正态拟合值的对比情况，其P值均大于0.2，表明两者无明显差异。说明通道电流为单通道电流。另外，无论开放时程长短，通道电流幅度基本一致。表1 单通道电流幅度算术均值与拟合均值的比较2.2 单通道电导外向电流随去极化程度增大，表现为幅度增高。以Vp(mV)为横坐标，相应的通道外向电流幅值(pA)为纵坐标，可见在0-60 mV范围内，各点基本排列在一倾

9、斜的直线上，说明通道无整流。应用直线回归画出最佳拟合直线(图1，R=0.999，P<0.05)，此即电流电压关系曲线(IV Curve)，电导值由该曲线斜率所决定。该通道的电导为112.4±5.14 pS(n=6)。IV曲线与X轴相交处的电压值即为翻转电位，本组通道翻转电位为1.1 mV，与理论值0 mV极为接近。(数据显示的是其中一例细胞记录的结果)图1 KATP 通道内面向外式记录的电流电压关系曲线2.3 通道激活与去极化时间关系在记录到的所有通道活动中，无论膜去极化程度大小，60 s内通道的电导、开放概率均无明显变化，长者甚至在90 min内通道活动仍无明显变化。

10、3 讨论本实验从急性分离的单个豚鼠气道平滑肌细胞上记录到的单通道电流，在钳位电压一定时，电流幅度均一，呈均匀的正态分布，是单通道电流。由于电极液中含有钙通道阻断剂CdCl2，阻断了电压依赖性钙通道;有TTX，阻断了Na+通道，由此排除了钠通道与钙通道电流的干扰;通道电流在去极化时为外向电流，且幅度随去极化加大而增大;内面向外式记录膜内外钾离子浓度相等时，通道翻转电位为0 mV，与实验状态下的钾离子平衡电位一致，说明通道对K+选择性通透。再结合KATP通道特异性阻断剂优降糖对通道电流的阻断作用，确定该通道为KATP通道。本实验参照文献中的方法4，并针对豚鼠气道平滑肌的特点进行了改良，成功对豚鼠气

11、道平滑肌急性分离，获得了适用于膜片钳研究的单个气道平滑肌细胞。由于在完整细胞上，胞内ATP可抑制通道的活动，因此在完整细胞上难以记录到KATP通道的单通道活动。实验中，我们采用了浴槽内加入NaCN的方法抑制细胞代谢，并使用膜片钳内面向外式记录方式，最大限度地去除了胞内ATP的影响，成功记录到KATP通道的活动，并对其单通道电学性质进行了初步研究。在本实验的过程中也发现，正常豚鼠气道平滑肌上能记录到的KATP通道活动较少。究其原因，可能是由于平滑肌细胞KATP通道密度很低(如肺动脉平滑肌KATP通道电流噪音分析表明单个细胞只有300400个通道，即大约每10 m2一个通道5)，记录到单通道的概率

12、较低。KATP通道具有多样性或异质性，单通道电导的变化很大。平滑肌KATP通道大致可分为小到中电导(在平衡钾液中电导值1550 pS)和大电导(在平衡钾液中电导值130 pS以上)两类6。本研究发现豚鼠气道平滑肌KATP通道电导较大，为112.4±5.14 pS。通道电导的不同，可能与通道组织来源和实验条件及记录方式不同所致。一般来说，KATP通道开放可使细胞膜超极化、引起电压依赖性Ca2+通道的关闭，激动剂诱导的三磷酸肌醇(IP3)合成减少，收缩器对Ca2+敏感性降低，进而松弛气道平滑肌及血管平滑肌6。在以往的实验中，人们观察到某些钾通道开放剂(如吡那地尔、克罗卡林)在气道平滑肌上

13、可产生松弛作用，并且这种作用可被优降糖所阻断，因此推断KATP通道在气道平滑肌上起着重要的作用2,3。但对气道平滑肌的KATP通道的单通道性质一直不是很清楚。本研究填补了相应空白，为进一步研究KATP通道在呼吸道疾病中的作用提供了基础。【参考文献】 1Mitchell HW. Airway smooth muscle contractionperspectives on past, present and future. Pulm Pharmacol Ther, 2009,22(5): 363369.2 Sutovska M. Nosalova G, Franova S. The role o

14、f potassium ion channels in cough and other reflexes of the airways. J Physiol Pharmacol, 2007, 58 Suppl 5(Pt 2): 673683.3 Miyata S, Shibata O, Saito M, et al. Effects of ATPsensitive potassium channel openers on the contractile and phosphatidylinositol responses of the rat trachea. J Anesth, 2002,16(4): 279283.4 Smirnov SV, Robertson TP, Ward JP, et al. Chronic hypoxia is associated with reduced delayed rectifier K+ current in rat pulmonary artery muscle cells. Am J Physiol, 1994,266(1 Pt 2): H365370.5 Clapp LH, Gurney AM, Standen NB, et al. Properties of the ATPsensitive K+ current acti