兽医传染病实验教学指导书

1、兽医传染病学实验教学指导书实验内容（16学时）实验一 鸡新城疫血凝（HA）及血凝抑制（HI）试验（4学时）目的要求：1.掌握血凝试验（HA）与血凝抑制试验（HAI）的基本方法； 2.了解HA与HI在新城疫病毒及其它病毒诊断和鉴定中的应用。实验仪器及试剂：八通道微量移液器、单通道微量移液器、96孔V形微量血凝板、恒温箱等。待检病毒:鸡新城疫病毒鸡胚尿囊液；待检血清：抗鸡新城疫病病毒阳性血清；生理盐水、1%鸡红细胞、96孔V形微量血凝板、加样器等。实验原理：许多病毒表面具血凝素，具有凝集某些动物或人红细胞的特性，称为血凝现象，可用于鉴定病毒。血凝现象可以被特异性抗体所抑制，称为血凝抑制现象，利用这

2、种特性可进行血清学试验，称为血凝抑制试验。实验步骤及注意事项：一、血凝试验（HA） 取96孔板，按以下步骤操作：1、第一排1-12孔各加生理盐水25l，第二排1-12孔加生理盐水25l为红细胞对照；2、吸25l病毒液于第一排第1孔，混匀后取25l至第2孔，依次稀释至第12孔，弃去25l，各孔经倍比稀释后稀释度依次为2-12-12。3、第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%鸡红细胞25l，微型震荡器震荡2min混匀。4、室温静置10-30 min，观察结果（见下表）。5、结果判定：红细胞对照组红细胞完全沉降，以试验排中能使等量红细胞发生完全凝集的病毒最高稀释倍数，作为病毒的血凝价，即HI效价

3、，用2n表示。二、血凝抑制试验（HI）二、血凝抑制试验（HI）（1）根据HA测定的效价，计算配制4个血凝单位（4 HAU）抗原；（2）反应板中，第1孔至第11孔中每孔加入25l PBS；在第12孔中加入50l PBS；（3）第1孔中加入25l血清，反应板上将血清横向25l的对倍稀释至第10孔，弃去25l；（4）在第1孔至第11孔中，每孔加入25l的4 HAU抗原，室温下（2025）静置30分钟或28 4560分钟；（5）每孔加入25l 1%（V/V）鸡红细胞悬液，轻晃混匀后，室温（2025）静置2040分钟或28 4560分钟，当对照孔的红细胞显著成纽扣状时判定结果。（6）结果判定 以完全抑制

4、4HAU抗原的最高血清稀释倍数为该血清的HI抗体效价，用2n表示。复习题与作业： 1. 试举例哪些病毒（不少于三个）对红细胞具有凝集现象？ 2. 撰写实验报告，并对实验结果进行分析总结。实验二 猪瘟病毒的PCR鉴定（6 学时）目的要求：1. 掌握RT-PCR技术的基本原理； 2. 掌握猪瘟病毒RNA提取的操作要点。 3. 学会凝胶电泳操作基本方法。 实验仪器及试剂：猪瘟阳性病料、猪瘟病毒RT-PCR诊断试剂盒、无水乙醇、微量移液器、DL2000Marker、核酸染料试剂 、三角瓶、琼脂糖、一次性EP手套、烧杯、量筒等。实验原理：利用诊断试剂盒中提供的吸附柱提取猪瘟病毒RNA为模板，在反转录酶的

5、作用下，以引物为起点合成与RNA 模板互补的cDNA链；然后在DNA 聚合酶的作用下，经高温变性、低温退火和中温延伸的多次循环，使特异DNA 片段的拷贝数放大数百万倍。将扩增的DNA 片段进行电泳、染色后，在紫外灯下，肉眼可见DNA 片段的扩增带，并以电泳结果初步判断感染情况。实验步骤及注意事项：1. 样品采集：病死或扑杀的猪，取扁桃体、淋巴结等组织病变部与健康部交界处组织；待检活猪，用注射器取血5 mL，28 保存。（要求送检病料新鲜，严禁反复冻融。）2.样品处理：2.1 组织样品的处理：称取组织0.1g于研磨器中磨碎，再加1mL生理盐水继续磨至无块状物；然后将样品转至1.5 mL灭菌离心管

6、中，8000 rpm离心2 min，取200 µL上清于1.5 mL 灭菌离心管中。2.2 全血样品的处理：待血凝后取200 µL血清于1.5 mL 灭菌离心管中。2.3 阳性对照的处理：取阳性对照 200 µL于1.5 mL 灭菌离心管中。2.4 阴性对照的处理：取阴性对照200 µL于1.5 mL 灭菌离心管中。3. 病毒RNA的提取3.1 取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入600µL裂解液，充分颠倒混匀810次，室温静置10min 。3.2 加入600µL异丙醇，上下颠倒混匀5次。3.3 吸取650µL混合液

7、转入吸附柱，12,000 rpm离心45s，弃去收集管中液体，套回收集管。3.4 重复步骤3.3。3.4 向吸附柱中加入600µL洗涤液，12,000 rpm 离心45s，弃去收集管中液体，套回收集管。3.5 重复步骤3.43.6 空柱12,000 rpm 离心2 min。3.7 将吸附柱移入新的无RNA酶的1.5 mL离心管中，在膜中央加入25µL洗脱液，室温静置1min，12,000 rpm 离心45s，获得总RNA。4. 进行RT-PCR反应4.1 反应体系：每份总体积20µL，分别取16.8 µL RT-PCR反应液A（用前混匀）、1.2

8、1;L RT-PCR反应液B（用前混匀）和2µL模板RNA（阳性对照管加入1µL阳性对照RNA和1µL阳性模板添加液），混匀。做好标记。4.2 反应程序：在PCR仪上运行以下程序：42 45 min，95 3 min ；95 30 s 、58 30 s 、72 30 s，35个循环；72 延伸10 min。5. 电泳5.1 制胶：用50倍稀释的TAE电泳缓冲液配制1%琼脂糖凝胶。5.2 电泳：待胶凝固后，取10µL PCR扩增产物点样于琼脂糖凝胶孔中，以5V/cm的电压于50 倍稀释的TAE 电泳缓冲液中电泳。5.3 染色：取50 倍稀释的TAE 电泳缓

9、冲液30mL，加入10µL染色液，混匀后将胶浸泡30min，于凝胶成像系统下观察结果。结果判定： 阳性对照出现198 bp扩增带，阴性对照无带出现（引物带除外）时，实验结果成立。被检样品出现198bp扩增带为猪瘟病毒野毒株阳性，否则为阴性。注意事项： 1. 注意防止试剂盒组分受污染。使用前将塑料袋内试剂瞬离15s，使液体全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液体时移液器吸头尽量在液体表面层吸取。 2严格按试剂盒说明书操作可以获得最好的结果。操作过程中移液、定时等全部过程必须精确。 3RNA提取过程中，应戴口罩、勤换手套，尽量缩短操作时间。 4所有接触病料的物品均应合理处理，以免污染实验室。复

10、习题与作业：1. 撰写实验报告，并将电泳结果附后。2. 在提取RNA的过程中，有哪些注意事项？实验三 细菌的革兰氏染色及光镜观察（4学时）目的要求：1. 学会并掌握微生物的制片技术； 2. 学会革兰氏染色的方法； 3. 在显微镜下观察细菌的基本形态。 实验仪器及试剂：显微镜、镊子、玻璃搁架 、接种环、擦镜纸、香柏油、载玻片、 酒精灯10个、 接种环、吸水纸、革兰氏染液：草酸铵结晶紫、蒸馏水、碘液、乙醇、番红等。实验原理： 根据细菌细胞壁的化学组成与结构不同，不同的细菌对染料的反应不同。革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+

11、表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。实验步骤及注意事项：1. 涂片 先滴一滴无菌水于载玻片中央用无菌接种环

12、从培养好的细菌中挑取少许细菌，与载玻片上的无菌水混合均匀，涂成一薄层。2. 干燥 涂片后可自然干燥，也可在酒精灯火焰高处略微加热，使之迅速干燥。3. 固定 高温固定，手持载玻片一端，标本面向上，在酒精灯火焰外侧迅速来回移动34次。杀死细菌，使细菌粘附在载玻片上。同时还可以改变细菌通透性，增强染色效果。4. 革兰氏染色(1)初染：将固定好的涂片加结晶紫1min；(2)用缓冲水冲去染料；(3)媒染：加碘液媒染1min；(4)用缓冲水冲去碘液并吸干；(5)脱色：酒精（95%）脱色处理，一般3060s；(6)用缓冲水洗去(7)复染：加蕃红复染30s；(8)用缓冲水洗去；(9)吸干、镜检。先用低倍镜，后

13、用油镜观察，作图。5. 油镜下观察细菌形态并绘图。 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色的结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解，都常呈阴性反应。复习题与作业：1. 绘图油镜下的细菌形态。2. 作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？实验四 猪蓝耳病毒抗体ELISA检测（4 学时）目的要求：1.掌握ELISA技术的基本原理 2.掌握猪蓝耳病毒抗体ELISA检测的操作要点。 3.学会对ELISA 检测结果进行判定。实验仪器及试剂：酶标仪、恒温箱、高速离心机、

14、冰箱、猪蓝耳病毒ELISA抗体检测试剂盒、单通道微量移液器、八通道微量移液器、量筒、V型加液槽等。实验原理：它利用酶标记物同抗原抗体复合物的免疫反应与酶的催化放大作用相结合，既保持了酶催化反应的敏感性，又保持了抗原抗体反应的特异性，因而极大的提高了灵敏度。同时它又是一种非均相免疫分析，即在反应中的每一步都有洗涤过程，从而去除了未反应物质和干扰物质。间接法(Indirect ELISA)原理：将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原，洗涤除去未结合的抗原及杂质；加抗体形成固相抗原抗体复合物，经洗涤后，在固相载体上留下特异性抗体，其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗

15、去；加酶标抗抗体，与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶，洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量；加底物显示，颜色深度代表标本中受检抗体的量（见下图）。实验步骤：1. 配制洗涤液：使用前，浓缩的洗涤液应恢复至室温（25左右），并摇动使沉淀的盐溶解（最好在37水中加热510分钟），然后用蒸馏水或去离子水作20倍稀释（例如：每板用20ml浓缩液加上380ml水），稀释好的洗涤液28可以存放7天。2. 样品和对照稀释：2.1 样品稀释：在血清稀释板中按1:40的体积稀释待检血清样品（195l样品稀释液中加5l待检血清样品）。2.2 对照稀释：在血清稀释板中按1:4分别稀释阳性对照

16、和阴性对照（180l样品稀释液中加60l对照血清）。3. 加检测样本： 3.1 取抗原包被板，每孔加入稀释好的洗涤液200l，静置3分钟倒掉液体，并在吸水纸上拍干，共计洗板2次。再分别将稀释好的待检血清和对照各取100l加入到抗原包被板孔中，待检样品做1孔，阴性对照和阳性对照各设2孔，每孔100l。轻轻振匀孔中样品（勿溢出），置37温育30分钟。 3.2 甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液200l，静置3分钟倒掉，再在吸水纸上拍干，共计洗涤5次。3.3 每孔加羊抗猪酶标二抗100l，置37温育30分钟。3.4 洗涤5次, 方法同2。切记每次在干净吸水纸上拍干。3.5 每孔先加底物液A一滴

17、（约50l）、再加底物液B一滴，混匀，室温(1825)避光显色10分钟。3.6 每孔加终止液一滴(50l)，10分钟内测定结果（测定前在震荡器上轻轻震动一下）。注意事项：1. 试剂盒使用前各试剂应平衡至室温，使用后放回28。 2. 不同批号试剂盒的试剂组分不得混用，使用试剂时应防止试剂污染。3. 底物液B不要暴露于强光，避免接触氧化剂。4. 未使用的抗原包被板切记不要撕开上面的封口膜。5. 待检血清样品数量较多时，应先使用血清稀释板稀释完所有要检测血清，再将稀释好的血清转移到检测板，使反应时间一致。6. 浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水稀释，如果发现有结晶加热使其溶解后再使用。 结果判定：在酶标仪上测各孔OD450nm值。试验成立的条件