色谱分析总复习

1、一、名词解释1capacity fact：容量因子，也称分配容量或容量比，用k表示。其定义为：一定温度与压力下两相达平衡后，溶质在固定相和流动相中分配量（质量或摩尔数）之比. 2分配系数：K,一定温度与压力下两相达平衡后，组分在固定相和流动相中浓度的比值;3extra-column effect：柱外效应，即除柱内多种因素产生的色谱峰扩张外，其它产生峰扩张的因素之和：进样系统，系统连接管，检测器及其它柱外因素引起的峰扩张。4gradient elution：梯度洗脱，在HPLC分析中，控制流动相组成或洗脱强度随时间的改变而改变，以使极性差异较大的多个组分均能分离,同时谱峰间隔较均匀，分析时间尽

2、量短。5HPSEC：高效体积排阻色谱法,即以多孔性填料为固定相，依据样品组分分子体积大小的差别进行分离的液相色谱方法。常用于肽和蛋白质的分子量分布测定及多步分离纯化程序中。其填料一般有硅胶基质和合成高聚物基质以及高交联多糖型凝胶三种。6ODS：十八烷基键合硅胶，又称C18. 典型的反相色谱柱，表面键和的基团为非极性羟基，适于分离弱极性，中等极性，较强极性及可电离的酸碱性有机物。7基线：在正常操作条件下，仅有流动相通过检测器系统时所产生的连续的响应信号，一般是一条直线; 8峰面积：色谱曲线与基线间所包围的面积; 9半峰宽：亦称半宽度,半峰宽度,指色谱峰高一半处的宽度10标准偏差：正态分布曲线x=

3、±1时（拐点）的峰宽之半。正常峰宽的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。小，分散程度小、峰形瘦、柱效高；反之，大，峰形胖、柱效低。 11死时间t0:流动相流过色谱柱所需时间(不保留组分流过色谱柱所需时间) 12调整保留时间:tR=tR-t0，指扣除死时间后的保留时间。13保留时间tR进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。 14相对保留值:(用或表示,也称分离因子)两个组分调整保留值之比=tR2/tR1=VR2/ VR2; 15分离度: 相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值，也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。16色谱柱效：每米柱长

4、具有的理论塔板数定义为色谱柱效，它是衡量色谱柱分离效能高低的一种量度。1.在进行HPLC分析时，为防止分析柱污染，应采取哪些措施？1）加一个保护柱（预柱），其固定相性质应与分离柱一样或相近。2）样品要尽量净化，如沉淀蛋白，去除色素和无机盐等。3). 样品分析结束后,应及时用适当溶剂清洗色谱柱.2.乙醇的沸点为78.3，丁酮的沸点为79.6，在气相色谱柱上是否一定是乙醇先出峰，丁酮后出峰，为什么？不一定.因为保留值除与样品组分的沸点有关外，还与样品及固定相的极性有关。乙醇（bp 78）和丁酮（bp 80）二个组分在非极性柱上，因为组分出峰的顺序由蒸汽压决定，沸点高的保留时间长，所以乙醇先出峰，丁

5、酮后出峰；在极性柱上，沸点和分子之间作用力同时作用，在强极性柱上分子间的作用力其主要作用，按极性大小出峰，乙醇的极性比丁酮大，所以丁酮先出峰，乙醇后出峰。4.电喷雾离子化的原理是什么?离子化过程分哪三步？原理：在喷针针头与施加电压的电极之间形成强电场，该电场使液滴带电，带电的溶液在电场的作用下向带相反电荷的电极运动，并形成带电的液滴。由于小液滴的分散比表面积增大，在电场中迅速蒸发，结果是带点液滴表面单位面积的场强极高，从而产生液滴的“爆裂”。重复此过程，最终产生分子离子。ESI离子化可分为一下三个步骤：1）形成带电液滴：在ESI高压电极处施以正的高电压，小液滴从毛细管高速喷出而带有过量的正电荷

6、，从而产生电化学反应，通过溶剂组分氧化而去掉负离子或通过毛细管自身的氧化而增加正离子，当在ESI高电压极处施以负的高压，小液滴从毛细管高速喷出而带有过量的负电荷；2）溶剂蒸发和小液滴破裂：随着溶剂蒸发，液滴半径缩小，液滴表面电荷斥力增大，达到一定半径时，克服表面张力而裂解，重复此过程形成非常小的液滴；3）形成气相离子：对于半径<=10nm液滴，电荷的斥力作用导致离子从液滴表面蒸发而不是液滴的分裂9、HPLC与GC比较，其特点？分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些物质只占有机物总数的20%；HPLC可以分析较高沸点、较高分子量的、稳定或不稳定化合物，这类物质占有机

7、物总数的80%。流动相的作用：GC采用的流动相为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，与组分之间基本没有作用；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合，可供选择的条件自由度较大。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过流动相组成来控制和改进分离。操作温度：GC需高温；HPLC常常在室温下进行。10、UVD紫外,FLD荧光,RID示差折光,ELSD蒸发光散射-这些检测器哪些是通用型的检测器？哪些是选择性检测器？哪些可与梯度洗脱兼容？哪些不兼容？UVD紫外: 由于不是所有化合物都有UV吸收，因此不是通用检测器;与梯度洗脱兼容FLD荧光:

8、 许多有机化合物，特别是芳香族化合物、被一定强度和波长的紫外光照射激发后，发射出较激发光波长要长的荧光。ELSD蒸发光散射：适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的且挥发性较小的样品组分的检测。 RID示差折光：是一种通用型检测器,只要被测组分与流动相的折光率有差别就可使用。与梯度洗脱不兼容,价格较高。RID，ELSD是通用型检测器。UVD,FLD,是选择性检测器。UVD, FLD, ELSD与梯度洗脱兼容。RID与梯度洗脱不兼容。11、气相色谱分析中样品的衍生化处理的目的及作用?待试样品在适当条件下与所选试剂作用使其转化成为满足色谱分析要求的衍生物后再进行色谱分析。目的：（1）增加试样的挥发性

9、和稳定性，从而扩大气相色谱的应用范围（2）改善分离效果，改进组分吸咐特性。（3）帮助未知物定性，增加检测灵敏度和增加定量可靠性12、请简述气相色谱法分析油脂的脂肪酸组成样品前处理过程?取约35滴植物油样品于20ml试管中，加入0.5mol/L的NaOH甲醇溶液2ml，60水浴中加热至油珠完全溶解（约30min），冷却后加入25%BF3甲醇溶液2ml，60水浴酯化20min，冷却后加入2ml正已烷，振摇，加入2ml饱和NaCl溶液振摇，离心取上层有机相于一只干燥试管中并加入少量无水硫酸钠以除去微量的水，供分析使用。13、什么样的反相柱不会发生“疏水塌陷”？对于硅胶基质填料上的反相键合相-内嵌极性

10、基团的反相键合相，极性基团增加了表面水的浓度即改善与水的浸润性；如果硅胶表面未湿润，那么有效的色谱表面积会减少95%，被分析物的保留时间会显著降低，即“疏水塌陷”。保留时间与填料表面积及配体（内嵌极性基团）有关。注意：几乎所有的表面积都在孔内！14、流动相脱气的目的？有哪几种脱气方式？流动相脱气的目的 使色谱泵的输液准确：输液量均匀准确，并且脉动减小；保留时间及色谱峰面积的重现性提高 提高检测的性能： 防止气泡引起的尖峰；基线稳定，信噪比增加；溶剂的紫外吸收本底降低 保护色谱柱：减少死体积；防止填料的氧化在线脱气装置用于脱去溶解在流动相中的气体，流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。脱气不好时有

11、气泡，导致流动相流速不稳定，造成基线漂移，噪音增加。除在线脱气装置外，目前也有采用离线超声脱气、真空脱气、氦气脱气等方式。 五应用题1.离子抑制色谱技术在食品分析中应用较广，请举出一实例说明其技术的原理，并写出色谱条件和样品处理方法。红葡萄酒中酚类化合物样品预处理：将25L红葡萄酒样品通过聚酰胺柱（259×17mmi.d.）,用5Polgamid-6(Serva)装填，并先用pH2.5的酸性水平衡），以100L蒸馏水淋洗，再用150L30的甲醇（酸化至PH2.5）洗脱，洗脱液真空浓缩至5L左右，并用15甲醇定容至10L。色谱柱：ODS柱（125mm×4mmI.D.,），室温

12、流动相：体积比为85:15的水甲醇（用HClO3调PH2.5）流 速：1.0ml/min 检 测：UV-280nm 样 品：红葡萄酒原理: 多酚、有机酸。pH2-3,酸性条件下，电离受到抑制，保留值增大，就可以得到分离，不在酸性条件下，阴离子状态不保留，流出色谱柱，就不能分离。2. 请简述检测果酒或黄酒中的中性酚和酸性酚的样品处理方法和色谱条件(选用什么色谱柱和流动相及检测器?检测波长大致多少nm。 预处理: (1) 去除大分子,蛋白,用乙醇沉淀(2)中性酚或酸性酚:中性条件下用液液萃取(乙醚,乙酸乙酯萃取) 。酸性条件下,也可用乙醚,乙酸乙酯. 或固相萃取法.色谱条件：C18柱 流动相：乙腈

13、:水:三氟乙酸 紫外检测器 检测波长270-280nm 称取一定量的酚类物质，溶于少量水，在棕色容量瓶中定容至10 mL，浓度分别为：儿茶素52.0 mg/L，绿原酸40.0 mg/L，咖啡酸44.0 mg/L，表儿茶素44.0 mg/L，香豆酸60.0 mg/L，阿魏酸44.0 mg/L，摇匀，放入冰箱4°C避光储存备用。配制标准溶液时，采用逐级稀释法配成一系列浓度的混合标准溶液。 取25 mL原料用1 mol/L NaOH溶液调pH值至7.0，加入25 mL乙酸乙酯，用混合摇床震荡10 min，然后转移到分液漏斗中分离，水相再用25 mL乙酸乙酯萃取1次，合并酯相为中性酚。水相再

14、用6 mol/L 的HCl溶液调pH值至2.0，再分别用25 mL乙酸乙酯萃取2次，合并酯相为酸性酚。将中性酚和酸性酚合并后浓缩至干，残渣溶于水中，并在棕色容量瓶中定容至25 mL，用0.22 m滤膜过滤，滤液于冰箱4储存待测。 色谱柱：Eclipse XDB C8 (150 mm×4.6 mm id，5 m)，流动相：A为甲醇；B为1乙酸水溶液 (V/V)；梯度洗脱程序：溶剂A在40 min 内由5上升到 30，然后变为100，并维持 5 min，最后再返回到初始状态。柱温：30；流速：1.0 mL/min光电二极管阵列检测器；检测波长：280 nm；进样量：20 L。3.请设计出

15、测定某一多糖样品的分子量分布或单糖组成的色谱分析方法（包括样品处理方法和色谱条件）。高效液相色谱法测定果汁的糖类组分含量1）、标准溶液系列配制分别准确称取各种糖标准品100mg左右于10ml容量瓶中，用超纯水溶解定容摇匀后，即得10mg/左右的标准溶液，再以此逐级稀释成8mg/m, 6mg/m, 4mg/m, 2mg/m,1mg/m的标准溶液系列，均经0.45m微孔膜过滤，滤液供进样用。2）、样品处理准确量取3ml果汁至10ml容量瓶中用无水乙醇定容至刻度，离心后取上清液在热水浴条件下用氮气将乙醇吹去，再用水定容，并用0.45um有机相微孔膜过滤，滤液颜色若较深，再用Sep-Pak C18固相

16、萃取小柱处理去除色素等杂质，处理后的样液上机测定。3）、上机测定色谱柱：Sugarpak1,6.5mmid×300mm流动相：纯水检测器灵酸敏度：4柱温：85流速：0.4ml/min进样体积：10L4.分析多糖或多肽的分子量分布应采用何种色谱分离模式?请简述该色谱模式的基本原理.高效凝胶过滤色谱（HPGFC）分析基本原理：按分子体积大小洗脱，凝胶色谱柱的选择主要取决于被分离样品的性质和糖组分分子量大小，以凝胶过滤色谱分析多糖的流动相一般为盐溶液。用多个不同分子量的标准品作分子校正曲线(分子量对数对保留时间或保留体积作图，一般为线性)，其分子量测定结果是一相对值，不是绝对分子量。 6、

17、计算题 : 若在一个色谱图上,测得tr=5.37cm,tm=0.52cm,w=1.32cm,假定柱长为1m,计算:(1)理论塔板数和有效理论塔板数.（2）塔板高度及有效塔板高度（3）分配比 （1）265，216（2）3.77mm,4.63mm（3）9.3注：N=5.54( )2=16( )2 根据色谱柱长L和理论塔板数N，可求出每个塔板高度 H=L/N Neff=16( )2 =5.54 ( )2 TR=TR-TM Heff= k=(tr-tm/)tm7、三聚氰胺的化学结构如下，请据此结构特点和本课程所学知识，选择一种可用于三聚氰胺检测的HPLC分离模式，并说明理由。答：从结构式可以看出三聚氰

18、胺是非极性有机化合物，呈弱碱性，容易结合H+形成带正电的阳离子，在以水-甲醇或水-乙腈为流动相的反相柱（C18）上保留时间比较短，由于杂质的影响还会出现严重的拖尾现象。若在流动相中加入庚烷磺酸钠试剂，则可以与样品中的阳离子形成离子对，使其成为电中性分子，利于延长样品的保留时间，分离效果会得到提高。因而可选择分离模式为反相离子对色谱对其进行分离。8、对于单糖和低聚糖的HPLC测定，有多种柱系统（包括色谱柱和流动相）可供选择，请简述其中两种柱系统的组成，并说明其分离机制（即分离模式）分离柱流动相分离模式氨基键合相C18耐碱性柱环糊精键合相石墨化碳柱乙腈水或乙腈甲醇水稀NaOH溶液（Ph11）乙腈-

19、水（0.1%甲酸）215%乙醇，含1mmol/lNaOH正相分配反相色谱正相色谱吸附，反相分配阳离子交换柱（Ca2+、Ag+、Pb2+、K+型或或H+型）水或稀酸（pH2）空间排阻，配位交换15、HPLC主要分为哪几种类型？答：正相色谱、反相色谱、凝胶色谱、离子凝胶色谱、手性色谱、亲和色谱按分离机理可以将HPLC分为五类：分配色谱基于被分离组分在两相中的分配系数不同(根据固定相和流动相相对极性的差别,又可分为正相色谱和反相色谱)；吸附色谱基于被分离组分对活性的固定相表面吸附力的不同；离子交换色谱利用不同离子与固定相上的相反电荷离子间作用力大小的不同进行分离；体积排阻色谱利用固定相孔径的不同，把

20、被分离的组分按分子大小分开的一种色谱分离方法；亲和色谱依据生物分子与固定相上键合的配位体之间存在的特异性亲和作用能力的差别，而实现对具有生物活性的物质进行分离16、简述正相色谱和反向色谱的特点（包括：固定相和流动相的相对极性，不同极性化合物的出峰顺序，流动相极性大小与洗脱强度的关系）。答：正相色谱：固定相极性较强，流动相极性较弱；样品极性越强出峰越晚；流动相极性越强，洗脱强度越大反向色谱：固定相极性较弱，流动相极性较强；样品极性越强出峰越早；流动相极性越强，洗脱强度越小。17、对于HPLC,影响分离度的k、N三要素分别与哪些色谱条件有关?²k´ 与流动相组成(主要是溶剂比例

21、、pH等)、固定相的性质和用量及柱温有关。²由流动相组成(特别是有机溶剂种类和pH值等)、固定相的性质及柱温等因素决定。²N（或H）由板高方程各项参数决定，一般随色谱柱长、填料粒径、填充均匀度、流速和温度等操作条件的变化而变。18请简述气相色谱气路系统中的“隔膜吹扫气”和“尾吹气”的作用。答：隔膜吹扫气是通过进样器隔垫下面将隔垫(即密封垫)因高温产生的挥发物带去机外所用的气体,可以防止对分析结果的影响，可以减少峰的拖尾，但流量太大时，峰面积会变小。尾吹气是从色谱柱出口直接进入检测器的一路气体，又叫补充气或辅助气。其作用是减少FID入口至检测器的死体积，缩短气体的停留时间，从

22、而消除检测器的死体积的柱外效应。3.何谓反相离子对色谱？影响其保留值的因素主要有哪些？离子对试剂的链长和有机溶剂的比例如何影响保留值？答：反向离子对色谱是将与被分析离子带相反电荷的离子(配对离子或反离子)加到流动相中，与溶质离子结合形成弱极性离子对，此离子对在流动相中不易离解而迅速转移到键合相中，进而在固定相和流动相间进行分配，最终实现分离的一种反向色谱模式。如三聚氰胺的分离，三聚氰胺是弱碱性有机物，在溶液中主要以阳离子存在，在以水-甲醇或水-乙腈为流动相的反相柱（C18）上保留时间比较短，由于杂质的影响还会出现严重的拖尾现象。若在流动相中加入庚烷磺酸钠试剂，则可以与样品中的阳离子形成离子对，

23、使其成为电中性分子，这样样品的保留时间会增大，分离效果会得到提高。影响因素：1)介质：反相过程常用的介质上以水为主体的缓冲溶液，其中pH值影响最大，PH则更加阴离子的保留增加，阳离子则相反。另外，缓冲液中离子类型和浓度也是重要选择性参数。 2)对离子浓度：增加反离子的浓度可增加保留，但这种关系并非是线性的3)有机改性剂：以水为主体的流动相中通常增加极性有机溶剂，如甲醇，乙腈等做改进剂，有机溶剂的加入改善了缔和分子在两相中的分配4)温度：它影响容量因子和离子化平衡的PK值离子对试剂的链长越短，其稳定性就越差。链长不同，形成离子对的能力不同。有机溶剂的加入会影响原有缓冲溶液的PH值，另外对肽的离子

24、化程度和缔和分子在两相中的分配起改善作用。比例，影响离子对的强度。5. 理论塔板数和有效理论塔板数的计算公式？两者的区别？ 两者的区别：由于在色谱柱中存在着死体积（在组分的保留时间中包括了死时间），因此，从分配平衡理论计算出来的理论塔板数n并不能完全反映柱效，利用扣除死体积（或扣除死时间）后的调整保留体积（时间）计算的有效理论塔板数neff能更真实地反映柱效。6、速率理论方程 ，其中H,A,B,及u各表示什么意思？H塔板高度;A涡流扩散项，指固定相填充不均匀引起的扩散;B-纵向分子扩散项，分子沿色谱柱轴向扩散引起的色谱谱带展宽;C-传质阻力项，指组分在流动相和固定相之间传质的阻力，由于溶质分子

25、与固定相、流动相分子间相互作用，阻碍溶质分子快速传递实现分布平衡，导致有限传质速率的分子间作用力称为传质阻力，固定相传质阻力+流动相传质阻力; u流动相流动的线速度.7、B = 2 r Dm，其中Dm表示什么？在GC还是HPLC中可以忽略B？为什么？Dm组分在流动相中的扩散系数。HPLC中可以忽略，纵向分子扩散显著存在于GC中.由于组分在液相中的扩散系数只有气体中的1/105，因此在液相色谱中B可以忽略。(该扩散是由浓度梯度造成的。组分从柱入口加入，其浓度分布的构型呈“塞子”状。随着流动相向前推进，由于存在浓度梯度，“塞子”必然自发地向前和向后扩散，造成谱带展宽)8、在UPLC超高效液相色谱（

26、Ultra Performance LC）中，为什么高流速仍能得到很高的柱效？ 从van Deemter曲线可以看出，u对纵向扩散项（B/u）和传质阻力项(Cu)的影响不一致，H先随u的增加而降低，达到最小值后随着u的增加而增加。由于UPLC系统采用1.7m颗粒，即颗粒度非常小，理论塔板高达不会随着线性流速的增加而明显增加，柱长可以比用5m颗粒时缩短3倍而保持柱效不变，而且使分离在高3倍的流速下进行，结果使分离过程快了多倍而分离度保持不变。9、何为反相离子抑制色谱的分离模式？举例说明。答：在反相色谱法中，通过调节流动相的pH值，抑制样品组分的解离，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸、

27、弱碱的目的，这种技术称为离子抑制色谱法。以葡萄酒中酚类物质的测定为例，由于酚类物质均有弱酸性，极性较强，在水和甲醇中有较大溶解度。因此，在甲醇/水为流动相并且pH=7时，多数组份保留时间很短，无法完全分离。若采用离子抑制色谱法可较好的分离。样品处理：将25mL红葡萄酒样品通过聚酰胺柱（259mm×17mmid,用5Polgamid-6(Serva)装填，并先用pH2.5的酸性水平衡），以100L蒸馏水淋洗，再用150mL30的甲醇（酸化至PH2.5）洗脱，洗脱液真空浓缩至5L左右，并用15甲醇定容至10L。 色谱柱：ODS柱（125mm×4mmiD）流动相：体积比为85:1

28、5的水甲醇（用HClO3调PH2.5）流速为1L/min；检测波长为280nm。10.液相色谱分析鸡精中的肌苷酸和鸟苷酸含量采用反相高效液相色谱，按分子极性大小，使鸡精中各种组分同时得到分离，利用紫外检测器测定肌苷酸钠和鸟苷酸钠组分含量。1).标准溶液系列配制分别准确称取肌苷酸钠和鸟苷酸钠标准品20mg左右于100ml容量瓶中，用超纯水溶解定容摇匀后，即得0.2mg/左右的标准溶液，再以此逐级稀释成0.1mg/m, 0.05mg/m, 0.01mg/m, 0.005mg/m,0.001mg/m的标准溶液系列，均经0.45m微孔膜过滤，滤液供进样用。2).样品处理准确称取200mg左右鸡精至10

29、ml容量瓶中用3ml水溶解，然后用无水乙醇定容至刻度，充分摇匀，静置，过滤后取3ml滤液用N2吹至0.5ml以下，再用水定容至3ml，摇匀后用0.45um有机相微孔膜过滤，滤液再用 C18固相萃取小柱处理去除色素等弱极性杂质，处理后的样液上机测定。3).色谱条件色谱柱：Diamosil C18, 4.6mmid×250mm，5um流动相：甲醇：0.05H3PO4溶液 5：95检测：254nm，DAD柱温：30流速：1.0ml/min进样体积：5L4).上机测定4.1标准曲线制作将不同浓度的系列标准品分别上机进样分析，以峰面积为横坐标（x），浓度为纵坐标（y）作线性回归，得到肌苷酸钠和

30、鸟苷酸钠的标准曲线方程、相关系数及线性范围。4.2样品测定将三个平行样品溶液分别进样，每个样均重复进样3次取其峰面积平均值代入标准曲线方程或单点校正计算含量。11.请简述分析果汁中葡萄糖、果糖及蔗糖的色谱条件与样品处理方法，并说明样品处理的主要步骤的目的答：色谱条件：色谱柱：Sugarpak1,6.5mmid×300mm 流动相：纯水 检测器灵酸敏度：4 柱温：85 流速：0.4ml/min 进样体积：10L样品处理方法：(1)准确量取3ml果汁至10ml容量瓶中用无水乙醇定容至刻度，目的是提取果汁中的葡萄糖、果糖及蔗糖，沉淀蛋白质和大分子糖。(2)离心，取上清液在热水浴条件下用氮气

31、将乙醇吹去，用水定容至刻度。除去乙醇，以防HPLC分析时影响糖的分离。(3)用0.45um有机相微孔膜过滤，滤液颜色若较深，再用Sep-Pak C18固相萃取小柱处理去除色素等杂质。目的是除去蛋白质和大分子糖沉淀，消除色度对分析的影响。(4)处理后的样液上机测定12、HPLC测定茶多酚中儿茶素含量（实验2）所使用的是什么色谱分离模式？流动相中为何要加酸？对于普通硅胶基质键合相C18柱，pH最低不能小于多少？离子抑制色谱法，选用Zorbax SBC18色谱柱，以甲醇水三氟醋酸（或醋酸）为流动相。在流动相中加入酸，目的是改变流动相的pH值，抑制溶质电离，使溶质在色谱过程中以中性分子保留。对于普通硅

32、胶基质键合相C18柱，pH最低不能小于2。梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等，用于分析组分数目多、性质差异较大的复杂样品。采用梯度洗脱可以缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度，但是常常引起基线漂移和降低重现性。 梯度洗脱有两种实现方式：低压梯度（外梯度）和高压梯度（内梯度）。 两种溶剂组成的梯度洗脱可按任意程度混合，即有多种洗脱曲线：线性梯度、凹形梯度、凸形梯度和阶梯形梯度。线性梯度最常用，尤其适合于在反相柱上进行梯度洗脱。 在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此带来一些特殊问题，必须充分重视： 要注意溶剂的互溶性

33、，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。有些溶剂在一定比例内混溶，超出范围后就不互溶，使用时更要引起注意。当有机溶剂和缓冲液混合时，还可能析出盐的晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。 梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证良好的重现性。进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰，因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头后会被强溶剂洗脱下来。用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止混合时产生气泡。 混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出现压力的变化。例如甲醇和水粘度都较小，当二者以相近比例混合时粘度增大很多，此时的柱压大约是甲醇或水为流动相时的两倍。因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过

34、输液泵或色谱柱能承受的最大压力。 每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始状态。需让1030倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡。1. 色谱法按分离原理分类, 可分为吸附色谱，分配色谱，排阻色谱和离子交换色谱。2. 所采用流动相的密度与液体接近, 粘度又与气体接近的色谱方法称超临界流体色谱法。3. 1956年范德姆特提出色谱速率理论方程。其方程简式表示为HABuCu 4. 分离非极性组分, 可选择非极性固定液, 组分分子与固定液分子之间的作用力主要为色散力5. 目前常用的色谱柱有填充柱和空心毛细管柱两种。6.根据范氏方程，试简要分析要实现色谱快速分析

35、应注意哪些操作条件？ 答:要兼顾到提高柱效和加快分析速度两个方面。提高载气流速可加快分析速度，抑制分子扩散 (B/u)，但将使传质阻力增加 ( Cg+ Cs) 为此，可采用降低固定液用量，减少液层厚度 df，同时应用轻质载气提高 Dg来减少气相传质阻力等措施。因此，结论是：选用轻质载气，减少固定液用量，提高载气流速。7.试预测下列操作对色谱峰形的影响, 并简要说明原因。 (1) 进样时间超过 10 s (2) 气化温度太低，以致试样不能瞬间气化 (3) 加大载气流速很多 (4) 柱长增加一倍 答: 1. 谱峰变宽,柱外分子扩散加剧。 2. 谱峰变宽，柱外分子扩散加剧。 3. 峰形变窄，保留时间

36、缩短。 4. 峰形变宽,增加0.4倍，保留时间增加。8.试预测下列实验条件对色谱峰宽的影响, 并简要说明原因. (1) 柱温增加(2) 相比减小(3) 分配比增加(4) 试样量减小很多 答: (1) 峰宽减小，因为分配系数减小。 (2) 峰宽增加，传质阻力增加。 (3) 峰宽增加，传质阻力增加。 (4) 峰宽减小，柱外初始带宽减小。第一章1.由俄国植物学家茨维特创立的色谱法, 应该是属于(4)液-固色谱 2.什么叫气-固色谱法? 气-固色谱法是流动相为气体, 固定相为固体吸附剂。分离原理是利用组分与固体吸剂的吸附与脱附能力不同进行分离。可适用于气体及低沸点烃类3.什么叫气-液色谱法? 气-液色

37、谱法是流动相为气体, 固定相为液体。分离原理是利用组分与固定液的溶解挥发能力不同进行分离。可适用于在固定液中有一定溶解度的试样。4.试比较气相色谱法与高效液相色谱法的优缺点。HPLC法不受试样挥发度和热稳定性的限制, 更适合于分析生物大分子、离子型化合物、热不稳定的天然产物和其它高分子化合物。另外HPLC的流动相不仅有使试样沿柱向前移动的作用, 且可与被测组分分子发生相互作用, 使选择条件增加一个。 但相对而言, GC法分析速度较快, 方法灵敏度较高、方便且耗资较低。第二章1.色谱图上的色谱峰流出曲线可说明什么问题？ 解：可说明（1）根据色谱峰的数目，可判断样品中所含组分的最少个数。（2）根据

38、峰的保留值进行定性分析。（3）根据峰的面积或高度进行定量分析。（4）根据峰的保留值和区域宽度，判断色谱柱的分离效能。（5）根据两峰间的距离，可评价固定相及流动相选择是否合适。2. 反映色谱柱柱型特性的参数是：C.相比 3.什么叫死时间？用什么样的样品测定？ 解： 不被固定相吸附或溶解的组分，从进样开始到柱后出现最大值所需要的时间。通常对于热导池检测器用空气作为测试样品，对于氢火焰离子化检测器，常用甲烷（CH4）作为测试样4.对某一组分来说，一定柱长下，色谱峰的宽或窄主要决定于组分在色谱柱中的B. 扩散速度5.指出下列哪些参数改变会引起相对保留值增加？为什么？C.降低柱温6.色谱法按固定相的固定

39、方式分类, 除柱色谱法以外, 还有纸色谱和薄层色谱。7.某一色谱柱从理论上计算得到的理论塔板数n 很大，塔板高度H很小，但实际上分离效果却很差，试分析原因。 解：n是通过保留值来计算的，没有考虑到死时间的影响，实际上tm对峰的影响很大，特别是K3时，扣除死时间算出的neff，有效塔板高度Heff很大，因而实际分离效能很差。 第三章1.为什么要测定定量校正因子？ 解：由于组分的峰面积不等于其重量或百分含量，也就是说，在同一类型的检测器上，重量或浓度相同的不同种物质产生的信号是不一样的；在不同类型的检测器上，同一种物质产生的信号也是不一样的，因此，为了使产生的响应信号能定量代表物质的含量，就要测定

40、校正因子。 2.测苯二甲酸混合物中间苯二甲酸含量，称取样品0.3578g,内标物癸二酸0.1029g，将样品及内标物甲酯化后进行气相色谱分析，测得间苯二甲酸二甲酯的峰面积为23.7单位，癸二酸二甲酯的峰面积为24.5单位，已知这两种酯的重量校正因子分别为0.77和1.00，求间苯二甲酸的含量 解：查出癸二酸分子量为202，癸二酸二甲酯为230，间苯二甲酸分子量为166，间苯二甲酸甲酯分子量为194。 先计算间苯二甲酸二甲酯的量（m1）：第四章1.在气相色谱分析中为了测定下面组分，宜选用哪种检测器？为什么？（1）蔬菜中含氯农药残留量；（2）测定有机溶剂中微量水；（3）痕量苯和二甲苯的异构体；（4

41、）碑酒中微量硫化物 解（1）蔬菜中含氯农药残留量选用电子捕获检测器，因为根据检测机理电子捕获检测器对含有电负性化合物有高的灵敏度。残留农药是含有电负性化合物，选用电子捕获检测器检测。（2）有机溶剂中的微量水选用热导池检测器检测，因为热导池检测器是通用型检测器，只要有导热能力的组分均可测定，故可测定微量水。而气相色谱其它几种检测器如氢焰、电子捕获、火焰光度检测器根据检测机理均不能测定水。（3）痕量苯和二甲苯的异构体可用氢火焰离子化检测器，因为氢火焰离子化检测器对含C、H元素的有机化物有高的响应信号，特别适合。（4）啤酒中微量硫化物选用火焰光度检测器，因为火焰光度检测器是只对硫、磷有响应信号，且灵

42、敏度特高，故为首选。 2.相对保留值和保留指数都是表示某组分的相对保留能力的大小，二者不同的是什么？解：相对保留值和保留指数二者不同的是，相对保留值以任意选定的单个化合物作为参比标准，而保留指数则以正构烷烃系列作为参比标准，把物质的保留行为用两个紧靠近它的两个正构烷烃来标定。3.已知苯的沸点为80.1，环已烷的沸点为80.8，采用非极性固定液能分离开吗？采用中等极性或更强极性的固定液能分离开吗？为什么？解：苯和环已烷的沸点很相近，若采用非极性固定液（SE30，液体石腊）是很难将它们分离的。但苯比环已烷容易极化，如果用中等极性的邻苯二甲酸二壬酯固定液（DNP），使苯产生诱导偶极，此时苯的保留时间

43、是环已烷的1.5倍，能将苯与环已烷很好分离。苯后出峰，若选用强极性的b，b氧二丙腈固定液，则苯的保留时间是环已烷的6.3倍，很容易分离。4.对于永久性气体的分离为什么常采用气固色谱？答：尽管气液色谱应用面广，但是H2、O2、N2、Ar2等永久性气体在气液色谱柱上，不能得到分离，由于它们在固定液上的溶解度都极小，使分配系数几乎一样，没有差别，即固定液对永久性气体无选择性，而固体吸附剂对永久性气体有好的吸附能力，使得永久性气体组分在气固色谱中有较大的分配系数，彼此可分离5.推荐两种分离脂肪酸甲酯的固定相，丁二酸二乙二醇聚酯（DEGS）和丁二酸新戊二醇聚酯（NGPS），对于分离饱和与不饱和脂肪酸甲酯

44、，哪一种固定液更好呢？ 固定液 x´ y´ z´ u´ s´ DEGS 496 746 590 837 835 NPGS 272 469 366 559 472答：对于饱和与不饱和脂肪酸甲酯的分离，我们必须考虑有高的z´值使其对酯基有好的保留外，还要从不饱和度的分离考虑柱子的选择，要选择x´值高的固定液，因为x´值是表示芳烃和烯烃物质在固定液上的滞留程度， x´值越高，说明烯烃物质在该固定液上的滞留时间长，从上面两组数据可看出，DEGS的x´与z´均比NPGS高得多，因而选用DEGS固

45、定液，分离效果更好些。6.试对下列试样设计气相色谱分析操作条件：（1）丙酮中微量水的测定；（2）超纯氮中微量氧的测定；（3）蔬菜中含有机磷农药的测定；（4）微量苯、甲苯、二甲苯异构体的测定。答：（1）采用气固色谱法，高分子多孔微球（GDX）为固定相，氢气为流动相，热导池检测器。（2）采用气固色谱法，5A分子筛为固定相，氢气为流动相，热导池检测器。（3）采用气液色谱法，OV210为固定相，氮气为流动相，火焰光度检测器。（4）采用气液色谱法，邻苯二甲酸二壬酯有机皂土为固定相，氮气为流动相，氢火焰离子化检测器。 7.对色谱固定液有何要求？固定液有哪些分类法？答：1. 选择性好，对各组分的分配系数有较

46、大的差别。 2. 在使用条件下蒸气压低，否则固定液流失引起噪声及柱寿命短、保留值重现性差。 3. 操作温度下呈液态，粘度小，凝固点低。 4. 热稳定性和化学稳定性好。在高温下不分解，不与载体发生化学反应。 5. 对载体具有一定的浸润能力，能形成均匀的液膜。 固定液的分类方法主要有，按固定液的相对极性、按固定液的特征常数及按固定液的化学结构和所含官能团等分类方法。第五章1.采用相同固定液的毛细管柱和填充柱上分离同一样品，欲达到相同的分离度，为什么毛细管柱比填充柱要求更高的理论塔板数？解：毛细管柱与填充柱的本质差别之一是毛细管柱的相比远高于填充柱的相比，填充柱的相比值b一般是440，而毛细管柱在5

47、01500之间，所以，当ris、K´一定时，在一定温度下，分离相同的物质，达到相同的分离度，毛细管柱所需的理论塔板数比填充柱多。 第六章1.高效液相色谱是如何实现高效、快速、灵敏的？答：气相色谱理论和技术上的成就为液相色谱的发展创造条件，从它的高效、高速和高灵敏度得到启发，采用510mm微粒固定相以提高柱效，采用高压泵加快液体流动相的流速；设计高灵敏度、死体积小的紫外、荧光等检测器，提高检测灵敏度，克服经典液相色谱的缺点，从而达到高效、快速、灵敏。2.什么叫离子色谱？解：在低交换容量的分离柱上，分离样品离子，而在高效换容量的抑制柱上，通过化学反应，把具有高电导的流动相转变为低电导的流

48、动相，这样就可以在电导检测器上对被分离样品离子进行高灵敏度的检测。这种采用分离柱、抑制柱和电导相结合的离子交换色谱称为离子色谱。3.为了测定邻氨基苯酚中微量杂质苯胺，现有下列固定相：硅胶、ODS键合相，下列流动相：水甲醇、异丙醚已烷，应先用哪种固定相、流动相？为什么？解：邻氨基苯酚中微量杂质苯胺测定，为了良好分离，应让苯胺先出峰，由于苯胺的极性小于邻氨基苯酚，因此采用正相色谱法，应选硅胶为固定相，异丙醚已烷为流动相。4.何谓梯度淋洗，适用于哪些样品的分析？与程序升温有什么不同？ 解：梯度淋洗就是在分离过程中，让流动相的组成、极性、pH值等按一定程序连续变化。使样品中各组分能在最佳的K´下出峰。使保留时间短、拥挤不堪、甚至重叠的组分，保