Notch信号通路在缺血再灌注条件下肠粘膜上皮细胞凋亡中的调控作用--杨桦

1、Notch 信号通路在缺血再灌注条件下肠粘膜上皮细胞凋亡中的调控作用 陈国庆，张治草，程应东、肖卫东，邱远，王文生，杜广胜，古应超，李祥生，杨桦*通讯作者摘要：目的：明确Notch信号通路在肠道缺血再灌注条件下肠粘膜上皮细胞凋亡中的调控作用。方法：建立雄性C57BL/6小鼠的肠道缺血再灌注动物模型，12h后取肠组织标本。TUNEL方法检测肠粘膜上皮细胞的凋亡水平。Realtime-PCR及Western-blot方法检测肠粘膜上皮细胞Notch信号通路各组分的表达变化。建立体外IEC-6细胞的缺氧/复氧细胞模型，通过阻断剂DAPT及siRNA技术明确Notch信号通路在肠粘膜上皮细胞凋亡中的作

2、用。结果：肠缺血再灌注后，小鼠肠粘膜上皮细胞的凋亡水平明显升高，与此同时肠粘膜上皮细胞内Notch信号通路Jagged1、DLL1、Notch2及Hes5的mRNA及蛋白表达水平均明显升高。在体外IEC-6细胞的缺氧/复氧模型中，缺氧/复氧刺激促进了IEC-6细胞的凋亡，而阻断Notch信号通路的表达后，IEC-6细胞的凋亡水平进一步明显升高。结论：在肠道缺血再灌注条件下肠粘膜上皮细胞中的Notch信号通路被激活，发挥抑制肠粘膜上皮细胞凋亡的作用。1.前言肠道的缺血再灌注损伤（Ischemia reperfusion injury, I/R）可导致全身炎症反应综合征、脓毒血症及多脏器功能障碍综

3、合征。肠道是多脏器功能障碍综合征的“发动机”，而肠粘膜屏障功能的损伤被认为是其内在的始发事件1。既往研究已明确，肠道I/R可导致肠粘膜上皮细胞的凋亡，进而引起肠粘膜屏障功能的损伤2-4。信号通路PI3K/AKT，ERK1/2及HIF-1通路均参与了肠道I/R导致的肠粘膜上皮细胞的凋亡5-7。但是肠道I/R条件下肠粘膜上皮细胞凋亡的调控机制仍未完全明确。 既往研究明确，Notch信号通路在肠粘膜上皮稳态的维持中发挥重要调控作用8。在哺乳动物中，Notch信号通路组分有四种Notch受体（Notch1-4）、五种配体（Jagged1、Jagged2、DLL1、DLL3、DLL4）9,10。配体与细

4、胞膜表面的Notch受体相互结合，激活了Notch受体的酶切反应，Notch受体释放酶切后的活性片段NICD进入胞浆，NICD由胞浆进入胞核形成转录激活复合物，并激活相应的目的基因Hes家族及Hey家族基因11。分泌酶参与了Notch受体的酶切反应，抑制分泌酶的活性可抑制Notch受体的激活12。 研究发现，在肝脏的I/R损伤中，Notch2-Hes5信号通路具有抑制I/R损伤导致的肝脏细胞凋亡的作用13。另外，Notch信号通路可抑制损伤导致的心肌细胞、内皮细胞和淋巴细胞的凋亡14-16。Notch信号通路还可抑制I/R损伤导致的神经细胞及间质细胞的凋亡17,18。肠道缺血再灌注损伤后，肠粘

5、膜上皮细胞发生增殖及凋亡反应2-4。在此前的研究中，我们发现肠道I/R损伤可导致肠粘膜上皮Notch信号通路的激活，参与了I/R损伤后肠粘膜上皮细胞的增殖19。然而，Notch信号通路是否参与了肠I/R损伤后肠粘膜上皮细胞的凋亡，尚不明确。本研究拟明确，肠道I/R损伤后Notch信号通路在肠粘膜上皮细胞凋亡中的调控作用。2、材料与方法2.1 实验动物 本研究中使用C57BL/6小鼠、6-8周龄、雄性，购自第三军医大学大坪医院实验动物中心。所有小鼠随机分为2组，对照组（n=7）及I/R实验组（n=7）。肠I/R小鼠模型的建立方法为微创血管夹夹闭肠系膜上动脉20min，之后松开血管夹关闭腹壁切口，

6、12h后处死动物，取空肠组织备用19。2.2 细胞培养 肠粘膜上皮细胞IEC-6购买于美国ATCC公司。IEC-6培养于DMEM培养基，加入10%胎牛血清，100ug/ml链霉素及100IU/ml青霉素。细胞贴壁后继续于常氧条件（20%O2,5%CO2）或缺氧条件下（1%O2，5%CO2）。需要阻断Notch通路激活时，培养基中加入DAPT干预12h，此后流式细胞学技术检测IEC-6细胞的凋亡水平。2.3 Real-time PCR实验 Trizol法提取肠粘膜的总RNA，逆转录为cDNA后保存备用32。在体内实验中，具体引物序列如下：Jagged1，正义链, 5'-CTTGGGTCT

7、GTTGCTTGGTGA-3' 反义链, 5'-ACATTGTTGGTGGTGTTGTCCTC-3' DLL1 正义链, 5'-CGGCTTCTATGGCAAGGTCTG-3' 反义链, 5'-TGTAGCCTCCGTCAGGGTTATCT-3' Notch2 正义链, 5'-GCGAGCACCCATACCTGACA-3' 反义链, 5'-TGGGCTGGTGGTCACATCTG-3' Hes5 正义链, 5'-AAGCTGGAGAAGGCCGACA-3' 反义链, 5'-CAGGA

8、GTAGCCCTCGCTGTAGT-3' GAPDH 正义链, 5'-AGAAGGTGGTGAAGCAGGCA-3' 反义链, 5'-AGGTGGAAGAGTGGGAGTTGC-3'.在体外研究中，具体引物序列如下：Jagged1 正义链, 5'-CGCCGTGCCCTTTGTGGAG-3' 反义链, 5'-GGGCCAGACTGCAGGATAAAC-3' DLL1 正义链, 5'-AGAGGGGCCAACGCTACATGTG-3' 反义链, 5'-GGCGGAGGCTGGTGTTTCTG-3

9、9; Notch2 正义链, 5'-GGGGGGACCTGCTCTGACTAC-3' 反义链, 5'-ACGTGCCGCCATTGAAACAGGAG-3' Hes5 正义链, 5'-GAAGCCGGTGGTGGAGAAG-3' 反义链, 5'-CGGCGAAGGCTTTGCTGTG-3' GAPDH 正义链, 5'-GGGGCCAAAAGGGTCATCATCTC-3' 反义链, 5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'Real-time PCR的具体反应条件为：94°C反应10

10、 min, 94°C持续30s, 60°C持续30s, 72°C持续45s，反应45循环。2.4 Western blot实验 RIPA法提取组织及细胞的总蛋白，bradford法检测蛋白总浓度，保证电泳胶上样总量一致，电泳完成后蛋白转膜至PVDF膜，室温下5%脱脂奶粉封闭1h，4°C冰箱孵育一抗过夜。相关一抗如下：NICD2 (ab-52302, Abcam, 美国), Hes5 (sc-25395, Santa Cruz, 美国), GAPDH (sc-32233, Santa-Cruz,美国)，一抗孵育完成后室温下孵育相应二抗1h，曝光显色，并利用

11、柯达凝胶成像分析系统进行半定量分析（carestream，美国）。2.5 siRNA法干扰细胞Hes5表达 在体外研究中，为了阻断IEC-6细胞内Notch信号通路，我们采用了siRNA干扰技术抑制IEC-6细胞Hes5的表达水平。SiRNA干扰序列购买自广州锐博公司，Hes5相应的siRNA序列如下：siRNA1, 正义链5' GCAUUGAGCAGCUGAAACU dTdT 3' 反义链3' dTdT CGUAACUCGUCGACUUUGA 5' siRNA2, 正义链5' GCAGAUGAAGCUGCUUUAC dTdT 3'反义链 3&#

12、39; dTdT CGUCUACUUCGACGAAAUG 5'。 IEC-6细胞培养于6孔板，铺满板底约50%-60%时进行siRNA干扰实验，干扰siRNA浓度为50nmol，按照操作说明，对照siRNA（si-NC）作为阴性对照组19。干扰6h后，吸除干扰试剂，替换为正常IEC-6细胞培养基，继续培养48h，提取细胞总蛋白进行后续的Western blot实验，或者流式细胞学技术检测IEC-6细胞的凋亡水平变化。2.6 TUNEL法检测上皮细胞的凋亡 肠组织标本固定于4%多聚甲醛，制备5um厚度切片，TUNEL试剂盒（罗氏，德国）检测肠上皮细胞的凋亡水平变化。按照操作说明，室温下切

13、片浸泡于20ug/ml蛋白酶K15min，0.1%浓度TritonX-100孵育8min，PBS冲洗，3%双氧水浸泡切片灭活内源性过氧化物酶，PBS冲洗后切片标本表面滴加50ulTUNEL试剂，37°C孵育60min，PBS冲洗后荧光显微镜下观察显色情况，之后行DAB显色，苏木素复染，光学显微镜下观察阳性染色细胞。 在体外实验中，我们采用流式细胞学技术检测IEC-6细胞的凋亡水平。按照此前的操作方法，IEC-6细胞培养或干预后，行FITC-Annexin V及PI双染，流式细胞仪检测细胞的凋亡水平34。2.7统计学分析 所有数据均为均数±标准差。两组间的均数比较采用Stud

14、ents 检测，多组间的均数比较采用ANOVA检测。所有的统计学分析均采用SPSS13.0完成，p<0.05具有统计学差异。3.结果3.1 肠道缺血再灌注促进了肠粘膜上皮细胞的凋亡 通过阻断肠系膜上动脉20min，我们建立了小鼠的I/R动物模型，12h后取空肠组织备用，TUNEL法检测肠粘膜上皮细胞的凋亡水平。结果显示，肠道I/R明显促进了肠粘膜上皮细胞的凋亡（图1 A/B）。统计分析表明，I/R组肠上皮细胞的凋亡水平是对照组的18.7倍（图1B），阴性对照组无阳性染色细胞（图1A）。图1.肠道I/R损伤促进了肠粘膜上皮细胞的增殖。A.阳性染色细胞（DAB棕色）主要位于肠粘膜上皮（

15、15;200），右侧为左侧矩形框内的放大图片（×400）。B.I/R组肠粘膜上皮细胞凋亡明显增生，*与对照组相比P<0.01。3.2 肠道I/R激活了肠粘膜上皮内的Notch信号通路 既往研究明确，在小鼠肠粘膜上皮细胞内主要表达的Notch信号通路组分包括：4种配体（Jagged1，Jagged2，DLL1，DLL4），4种受体（Notch1-4），4种Hes下游基因（Hes1，Hes5，Hes6，Hes7）20。我们首先采用了Real-time方法筛查Notch信号通路基因的表达水平变化，结果表明I/R促进了肠粘膜上皮Jagged1，DLL1，Notch2及Hes5表达，与对

16、照组相比较，分别升高了2.40倍、1.85倍、1.93倍及3.30倍（图2A，P<0.01）。 接下来，我们检测了相应基因的蛋白表达水平。统计学分析表明，I/R肠粘膜上皮细胞内Hes5及NICD2蛋白表达水平分别是对照组的3.25及2.30倍（图2B/C，P<0.01）图2.肠I/R促进了肠粘膜上皮内Notch信号通路mRNA及蛋白的表达。A.建立I/R小鼠模型，取肠粘膜提取总RNA，行Real-time PCR检测。I/R促进了肠粘膜上皮内Jagged1，DLL1，Notch2，Hes5的mRNA表达水平，*与对照组比较P<0.01。B. Western blot方法检测肠

17、粘膜上皮NICD2及Hes5表达水平。C.半定量分析Western blot结果，I/R促进了肠粘膜上皮NICD2及Hes5表达水平，*与对照组比较P<0.01。3.3 DAPT促进了IEC-6细胞的凋亡 为了明确Notch2信号通路在肠粘膜上皮细胞中的调控作用，我们建立了体外IEC-6细胞的缺氧复氧模型（Hypoxia/Reoxygenation，H/R）21。 首先，我们验证了IEC-6细胞的H/R模型能否模拟体内的肠道I/R动物模型。给予IEC-6细胞H/R刺激后，我们提取了IEC-6的总RNA，Real-time PCR结果表明H/R刺激促进了IEC-6细胞Notch信号通路mR

18、NA的表达。与对照组相比，H/R组IEC-6细胞Jagged1、DLL1、Notch2、Hes5的mRNA分别升高了1.92倍、3.93倍、1.81倍、5.84倍（图3A，P<0.01）。Western blot结果表明H/R刺激促进了IEC-6细胞Notch信号通路蛋白的表达，与对照组相比，H/R组的NICD2及Hes5分别升高了1.65、4.42倍（图3B/C，P<0.01）。上述结果表明，H/R条件下IEC-6细胞可以模拟体内肠道I/R动物模型。 图3.H/R刺激促进了IEC-6细胞Notch信号通路mRNA及蛋白的表达。A.H/R促进了IEC-6细胞Jagged1、DLL1

19、、Notch2、Hes5的mRNA表达，*与对照组比较P<0.01。B/C.H/R促进了IEC-6细胞NICD2、Hes5的蛋白表达，*与对照组比较P<0.01。 DAPT可以特异性抑制分泌酶从而抑制Notch信号通路的激活。本研究中，我们给予IEC-6细胞DAPT干预以观察Notch信号通路表达对肠上皮细胞凋亡的影响。Western blot结果表明DAPT明显抑制了IEC-6细胞内NICD2及Hes5的蛋白表达（图4A/B）。此后，流式细胞学结果表明，H/R刺激促进了IEC-6细胞的早期凋亡和晚期凋亡（图4C），而且在H/R条件下，DAPT进一步促进了IEC-6细胞的凋亡，尤其

20、是早期凋亡（图4C）。上述结果表明，在H/R条件下，抑制Notch信号通路表达可进一步促进肠上皮细胞的凋亡。相反的，在肠I/R条件下，Notch2-Hes5信号通路的激活，具有抑制肠粘膜上皮细胞凋亡的作用。图4.DAPT抑制了Notch信号通路的表达，促进了IEC-6细胞的凋亡。A/B.DAPT(20uM)抑制了IEC-6细胞NICD2/Hes5的表达，半定量分析表明差异具有统计学意义，*与对照组比较P<0.01。C.流式细胞学技术检测IEC-6细胞的凋亡水平，H/R条件下DAPT明显促进了IEC-6细胞的凋亡。FITC-Annexin V+/PI+表示晚期凋亡；FITC-Annexin

21、 V+/PI表示早期凋亡；FITC-Annexin V/PI 表示正常细胞。3.4 siRNA技术抑制Hes5表达促进了IEC-6细胞的凋亡 为了进一步验证Notch信号通路对IEC-6细胞凋亡的影响，我们利用siRNA技术抑制了IEC-6细胞的Hes5表达，观察IEC-6细胞的凋亡水平变化。Western blot结果表明，siRNA技术明显降低了Hes5的表达（图5A/B）。在H/R条件及常氧条件下，siRNA技术抑制Hes5表达，流式细胞学观察IEC-6细胞的凋亡水平变化。结果表明，siRNA技术抑制Hes5表达促进了IEC-6细胞的凋亡；而且在H/R条件下，siRNA技术抑制Hes5表

22、达进一步促进了IEC-6细胞的凋亡，尤其是早期凋亡（图5C）。上述结果表明，在H/R条件下Hes5表达具有抑制肠粘膜上皮细胞凋亡的作用。图5. siRNA技术抑制Hes5表达促进了IEC-6细胞的凋亡。A/B. Western blot结果表明siRNA技术抑制了IEC-6细胞Hes5表达，半定量分析表明差异具有统计学意义，*与对照组比较P<0.01。C.流式细胞学结果表明siRNA技术抑制Hes5表达促进了IEC-6细胞的凋亡。FITC-Annexin V+/PI+表示晚期凋亡；FITC-Annexin V+/PI表示早期凋亡；FITC-Annexin V/PI 表示正常细胞，*与对照

23、组比较P<0.01。4.讨论 在本研究中，我们发现肠道I/R损伤促进了肠粘膜上皮细胞的凋亡。在肠I/R条件下，肠粘膜上皮Notch信号通路mRNA及蛋白表达水平升高，而且激活的NICD2/Hes5信号通路抑制了I/R对肠粘膜上皮细胞的损伤作用。 创伤、出血及其他的急性应激均可导致肠道的I/R损伤，肠粘膜上皮细胞出现坏死、凋亡，最终导致肠粘膜屏障的损伤。其中，肠粘膜上皮细胞的凋亡是导致肠粘膜屏障损伤的非常重要的因素。早期反应基因，如c-fos、c-jun参与了肠粘膜上皮细胞的凋亡22,23。其他的信号通路及因子如p38 MAPK, IL-6, HGF, KGF均参与了肠I/R条件下肠粘膜上

24、皮细胞凋亡的调控24-27。然而，肠道I/R条件下肠粘膜上皮细胞凋亡的调控机制仍不完全明确。 Notch信号通路在肠粘膜稳态的维持中发挥重要的调控作用8。基因沉默Notch信号通路可抑制肠粘膜上皮细胞的正常分化，分泌酶阻断剂抑制Notch信号通路的激活可影响肠粘膜的稳态28-30。既往研究表明，在肠道缺血再灌注后1h-6h内肠粘膜上皮细胞出现明显增殖反应，6h后肠粘膜TUNEL阳性染色细胞明显增多22,23,31。我们此前的研究表明，在肠道I/R损伤1h-6h内Notch信号通路参与了肠I/R后肠粘膜上皮细胞的增殖19,32。然而，在此前的研究中，我们未研究在肠道I/R损伤6h之后Notch信

25、号通路的表达情况及其在肠粘膜上皮细胞凋亡调控中的作用。 在本研究中，我们首先利用Real-time PCR技术筛查了肠粘膜上皮细胞Notch信号通路组分的表达变化。生理条件下，Jagged1、DLL1正常表达于肠粘膜上皮细胞20,33。本研究中，我们发现肠I/R促进了肠粘膜上皮Jagged1、DLL1的表达，Notch2及Hes5的mRNA及蛋白表达水平同样升高明显，这说明肠道I/R损伤后肠粘膜上皮内Notch2-hes5信号通路是激活的。与此同时，TUNEL染色表明肠道I/R明显促进了肠粘膜上皮细胞的凋亡。我们接下来的研究将明确二者之间的内在联系。 我们建立了体外培养IEC-6细胞缺氧-复氧

26、模型，模拟体内的肠道I/R动物模型。Notch信号通路阻断剂DAPT及siRNA干扰阻断Hes5表达研究均表明，Notch2-Hes5信号通路具有抑制肠粘膜上皮细胞凋亡的作用，尤其是在H/R刺激条件下。上述研究表明，Notch2-Hes5信号通路参与了肠道I/R损伤后肠粘膜上皮细胞凋亡的调控作用。接下来的研究中，我们将进一步深入明确肠道I/R损伤后肠粘膜上皮细胞凋亡的具体调控机制。参考文献1. Deitch, E.A.; Xu, D.; Lu, Q. Gut lymph hypot Hesis of early shock and trauma-induced multiple organ d

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