HPV技术问题解答

1、l项目开展的要求l宫颈细胞样本的采集l宫颈细胞DNA的提取lPCR实验过程l导流杂交过程l结果判读1.HPV项目开展对实验室的要求有哪些？项目开展对实验室的要求有哪些？ 临床基因扩增实验室设置临床基因扩增实验室设置 十六字方针十六字方针 各区独立各区独立 注意风向注意风向 因地制宜因地制宜 方便工作方便工作l2.2.除了凯普医用核酸分子快速杂交仪外，凯普除了凯普医用核酸分子快速杂交仪外，凯普HPVHPV核酸扩核酸扩增分型检测项目在实验设备方面还需要哪些仪器设备？增分型检测项目在实验设备方面还需要哪些仪器设备？l答：答：l 标准型设置：按卫生部临检中心基因扩增实验室标标准型设置：按卫生部临检中心

2、基因扩增实验室标准的实验室配置。在第准的实验室配置。在第4 4区（产物分析区）设置杂交仪和区（产物分析区）设置杂交仪和水浴锅做杂交分析。水浴锅做杂交分析。l 经济型设置：分隔的房间（保证经济型设置：分隔的房间（保证PCRPCR产物的杂交不能产物的杂交不能污染到污染到PCRPCR前的实验过程）。前的实验过程）。PCRPCR仪、至少仪、至少2 2套微量移液器、套微量移液器、超净工作台或生物安全柜、水浴锅超净工作台或生物安全柜、水浴锅/ /干热器、离心机、涡干热器、离心机、涡悬混匀器。悬混匀器。HybirMax医用核酸医用核酸分子快速杂交仪分子快速杂交仪PCR扩增仪扩增仪超净工作台超净工作台水浴锅水

3、浴锅离心机离心机旋涡混合仪旋涡混合仪微量移液器微量移液器l1.1.在宫颈细胞采集过程中应该注意哪些问题？在宫颈细胞采集过程中应该注意哪些问题？ A A 不可在碘试验和醋酸试验之后采集样本。不可在碘试验和醋酸试验之后采集样本。 B B 检查前检查前4848小时内不要作阴道冲洗，不要用避孕药小时内不要作阴道冲洗，不要用避孕药膏等阴道内用药物。膏等阴道内用药物。 C C 检查前检查前4848小时最好不要行性生活。小时最好不要行性生活。 D D 月经期不可采集标本。月经期不可采集标本。 E E 液基细胞学样本可以用于液基细胞学样本可以用于HPVHPV检测。检测。 F F 注意避免交叉污染。注意避免交叉

4、污染。l2.2.样本采集中可否用棉拭子代替宫颈细胞采集刷？样本采集中可否用棉拭子代替宫颈细胞采集刷？l答：凯普宫颈细胞采集器及细胞保存系统对于采集足答：凯普宫颈细胞采集器及细胞保存系统对于采集足够的宫颈脱落细胞和长期保存细胞样本十分必要。够的宫颈脱落细胞和长期保存细胞样本十分必要。l 并且为了保证所采集细胞样本的质量，最好在采集并且为了保证所采集细胞样本的质量，最好在采集细胞前先用棉拭子拭去宫颈口的分泌物。细胞前先用棉拭子拭去宫颈口的分泌物。l 不能保证避免用棉拭子采集的样本及其他缓冲液的不能保证避免用棉拭子采集的样本及其他缓冲液的保存条件对实验结果的不良影响。保存条件对实验结果的不良影响。凯

5、普一次性使用宫颈细胞采集器凯普一次性使用宫颈细胞采集器宫颈细胞宫颈细胞DNADNA的提取的提取l宫颈细胞宫颈细胞DNADNA的提取过程中常见问题有哪些？的提取过程中常见问题有哪些？l答：答：lA A 样品中有黏液性物质会导致离心时不能把细胞等样品中有黏液性物质会导致离心时不能把细胞等固形物离心到管底。固形物离心到管底。l 可采取增大离心速度增长离心时间的方法使细胞可采取增大离心速度增长离心时间的方法使细胞离心到管底。或者用离心到管底。或者用PBSPBS或生理盐水洗涤一次后再离心。或生理盐水洗涤一次后再离心。lB B 丢弃上清时注意不要损失管底的沉淀。丢弃上清时注意不要损失管底的沉淀。lC C

6、在沉淀了在沉淀了DNADNA后，一定要在溶液挥发干净之后再溶后，一定要在溶液挥发干净之后再溶解解DNADNA。lD D 注意避免交叉污染。注意避免交叉污染。DNA提取试剂盒PCR实验过程实验过程l在在PCRPCR实验过程中要注意那些问题？实验过程中要注意那些问题？lA A 注意避免污染。注意避免污染。lB B 移液器尽量准确，避免由于加样过程中的损失造成移液器尽量准确，避免由于加样过程中的损失造成试剂量的不足（主要是试剂量的不足（主要是TaqTaq酶）。每个试剂盒均有多加酶）。每个试剂盒均有多加3 3人份，如果发现试剂不够请先校准所用移液器，同时人份，如果发现试剂不够请先校准所用移液器，同时避

7、免多次吸取液体。避免多次吸取液体。lC PCRC PCR反应管要求使用反应管要求使用200200ulul薄壁管。薄壁管。lD D 注意试剂的有效期，避免反复冻融。注意试剂的有效期，避免反复冻融。lE E 保证保证PCRPCR仪正常工作。仪正常工作。PCR扩增试剂盒导流杂交过程导流杂交过程l1.1.在导流杂交实验过程中需要注意哪些？在导流杂交实验过程中需要注意哪些？lA A 保证加热仪器的温度在保证加热仪器的温度在9595以上，确保以上，确保PCRPCR产物的产物的完全热变性。完全热变性。lB B 变性后的变性后的PCRPCR产物应该立即置于冰水中，避免在室产物应该立即置于冰水中，避免在室温下暴

8、露而使温下暴露而使DNADNA复性。复性。lC C 在安装金属多孔板时，确保多孔板在卡槽内。否则在安装金属多孔板时，确保多孔板在卡槽内。否则会导致不能有效泵走液体。会导致不能有效泵走液体。lD D 分隔膜的多余孔位必须封住。也要确保杂交膜正确分隔膜的多余孔位必须封住。也要确保杂交膜正确覆盖在分隔膜上。覆盖在分隔膜上。lE E 每次清洗膜时每次清洗膜时，抽液干净。抽液干净。lF F 确保实验用液体充分溶解并处于合适的温度。确保实验用液体充分溶解并处于合适的温度。lG G 注意杂交仪的保养。注意杂交仪的保养。杂交试剂盒导流杂交过程导流杂交过程结果分析及常见问题结果分析及常见问题正常阳性结果正常阳性

9、结果正常阴性结果正常阴性结果结果分析及常见问题结果分析及常见问题1 1. .在杂交膜上既无在杂交膜上既无ICIC点，也没有点，也没有HPVHPV分型阳性点显色。分型阳性点显色。可能原因可能原因解决办法解决办法因为因为DNADNA模板中存在抑模板中存在抑制制PCRPCR反应的抑制物质。反应的抑制物质。用去离子水用去离子水1 1：1010稀释样稀释样本本DNADNA降低抑制物质的浓降低抑制物质的浓度，重新实验。在度，重新实验。在DNADNA提提取过程中注意按要求操取过程中注意按要求操作。作。细胞样本，不符合要求，细胞样本，不符合要求，采样本之前经过碘采样本之前经过碘/ /乙乙酸染色或者使用了对酸染

10、色或者使用了对PCRPCR反应产生抑制药物。反应产生抑制药物。按照要求重新采样。按照要求重新采样。PCRPCR产物变性不完全。产物变性不完全。变性后又恢复为双链。变性后又恢复为双链。确保确保PCRPCR产物热完全。产物热完全。变性后即冷却避免复性。变性后即冷却避免复性。结果分析及常见问题结果分析及常见问题 2、IC点弱或者没有，但点弱或者没有，但HPV分型阳性点显色正常。分型阳性点显色正常。 可能原因：可能原因： 由于由于IC和和HPV DNA之间存在竞争，高浓之间存在竞争，高浓度的度的HPV DNA可能会对可能会对IC点的扩增反应产生竞点的扩增反应产生竞争性抑制。争性抑制。 如如HPV分型点

11、显色正常，则分型点显色正常，则分型结果正确分型结果正确。3、Biotin（生物素）点不显色（生物素）点不显色可能原因：可能原因：请确认所使用试剂是否仍在有请确认所使用试剂是否仍在有 效期内。尤其是酶标液及显色效期内。尤其是酶标液及显色 液是否按要求使用及储存。液是否按要求使用及储存。 确定实验操作是否严格按照说确定实验操作是否严格按照说 明书进行、且试剂是否按要求保明书进行、且试剂是否按要求保 存使用。存使用。结果分析及常见问题结果分析及常见问题4、阴性对照显现、阴性对照显现HPV分型阳性点分型阳性点可能原因：可能原因：PCR试剂可能被污染，取试剂可能被污染，取5 l PCR扩增产物进行琼脂糖

12、凝胶电扩增产物进行琼脂糖凝胶电 泳分析。泳分析。 重复进行重复进行PCR及杂交试验及杂交试验。结果分析及常见问题结果分析及常见问题 5、杂交膜有很高的背景、杂交膜有很高的背景 可能原因：可能原因： 可能由于封闭不足，使未结合可能由于封闭不足，使未结合 的酶标残留在膜上。确保封闭液的酶标残留在膜上。确保封闭液 完全覆盖整个杂交膜。完全覆盖整个杂交膜。 也可能因为没有完全将未结合也可能因为没有完全将未结合 的试剂清洗干净，请确保在显色的试剂清洗干净，请确保在显色 过程中杂交膜充分清洗，无剩余过程中杂交膜充分清洗，无剩余 残留液体。残留液体。结果分析及常见问题结果分析及常见问题6 6、什么时候需要做

13、阳性及阴性对照？、什么时候需要做阳性及阴性对照？ 当一个新的医院，一个新的地方开展试验的时候，或当一个新的医院，一个新的地方开展试验的时候，或更换试验地点的时候，建议进行阴阳性对照试验。更换试验地点的时候，建议进行阴阳性对照试验。 当使用的检测试剂批次改变的时候，建议做当使用的检测试剂批次改变的时候，建议做1 1次阴阳次阴阳性对照。性对照。 当杂交结果令人疑惑时，需要使用同批试剂进行阴阳当杂交结果令人疑惑时，需要使用同批试剂进行阴阳性对照试验以验证问题所在。性对照试验以验证问题所在。 怀疑污染时，多个样本的杂交结果一样，同一亚型反怀疑污染时，多个样本的杂交结果一样，同一亚型反复出现，杂交结果出

14、现过多的多重感染；复出现，杂交结果出现过多的多重感染； 杂交试验后出现许多无杂交试验后出现许多无ICIC点的结果。点的结果。结果分析及常见问题结果分析及常见问题7 7、导流杂交试验中的污染主要会出现在那一步中，应该怎样、导流杂交试验中的污染主要会出现在那一步中，应该怎样防范？防范？A A 最严重的污染是最严重的污染是PCRPCR产物污染了产物污染了PCRPCR前区或试剂。前区或试剂。 实验过程中严格按照实验室操作规程操作。避免实验过程中严格按照实验室操作规程操作。避免PCRPCR后区后区的物品进入的物品进入PCRPCR前区。前区。B B 样本样本DNADNA交叉污染。交叉污染。 认真谨慎操作可

15、以避免样本的交叉污染。认真谨慎操作可以避免样本的交叉污染。C C 杂交结果中出现的一些弱的杂交点可能不是污染造成，杂交结果中出现的一些弱的杂交点可能不是污染造成，而是杂交温度不符合要求而造成的非特异性点。而是杂交温度不符合要求而造成的非特异性点。 最终结果如果出现杂交点较弱的情况最终结果如果出现杂交点较弱的情况 ( (肉眼很难看出肉眼很难看出) )，此点可以不用判读。凯普此点可以不用判读。凯普HPVHPV分型检测项目现在配有分型检测项目现在配有微阵列微阵列芯片阅读仪芯片阅读仪自动判读实验结果，使结果的判读标准化自动判读实验结果，使结果的判读标准化。结果分析及常见问题结果分析及常见问题HPV 3

16、4弱弱 IC, HPV(-)IC, HPV(-)电泳阳性电泳阳性其他其他HPVHPV亚型亚型8、HPV杂交结果为阴性，但电泳结果为阳性杂交结果为阴性，但电泳结果为阳性 此种情况较少。可能原因为电泳所检测到的此种情况较少。可能原因为电泳所检测到的HPV DNA不包含在凯普试剂盒所能检测到的不包含在凯普试剂盒所能检测到的21种亚型内。种亚型内。结果分析及常见问题结果分析及常见问题9 9、杂交后的杂交膜没有形成均一的杂交边缘，而且出现同一、杂交后的杂交膜没有形成均一的杂交边缘，而且出现同一次杂交结果互相污染的现象。次杂交结果互相污染的现象。可能原因：可能原因： 分隔膜没有放好，没有形成每个样本独立的杂交间，分隔膜没有放好，没有形成每个样本独立的杂交间，所以出现了杂交膜之间的互渗、反渗以及下渗现象；所以出现了杂交膜之间的互渗、反渗以及下渗现象；验证方法：验证方法： 在进行预杂交的时候，首先要将杂交膜上的残留溶液在进行预杂交的时候，首先要将杂交膜上的残留溶液全部抽干净，然后先将杂交液加入不相邻的几个杂交孔中，全部抽干净，然后先将杂交液加入不相邻的几个杂交孔中，观察其他几孔杂交膜观察其他几孔杂交