构建叶酸修饰的乳腺癌靶向纳米超声造影微粒

1、www.CRTER.org陈园园，等. 构建叶酸修饰的乳腺癌靶向纳米超声造影微粒构建叶酸修饰的乳腺癌靶向纳米超声造影微粒陈园园1，徐 枫1，杨 辉2，刘 婷1，周建桥3，蔡晨蕾4，叶园园1，刘培峰4，韩宝三1(1上海交通大学医学院附属新华医院普外科、普外科实验室，上海市 200092；2教育部高分子合成与功能构造重点实验室，浙江大学高分子科学与工程学系，浙江省杭州市 310027；3上海交通大学医学院附属瑞金医院超声科，上海市 200025；4上海交通大学医学院附属仁济医院中心实验室，上海市 200127)引用本文：陈园园，徐枫，杨辉，刘婷，周建桥，蔡晨蕾，叶园园，刘培峰，韩宝三. 构建叶酸修

2、饰的乳腺癌靶向纳米超声造影微粒J.中国组织工程研究，2016，20(30):4425-4433.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.30.003 ORCID: 0000-0002-0322-5403(韩宝三)文章快速阅读：乳腺癌靶向纳米超声造影微粒的构建陈园园，女，1989年生，江苏省泗洪县人，汉族，上海交通大学医学院在读硕士，医师，主要从事乳腺癌的临床与基础及纳米材料的研究。通讯作者：韩宝三，主任医师，上海交通大学医学院附属新华医院普外科、普外科实验室，上海市 200092中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)30-044

3、25-09稿件接受：2016-05-18逐滴加入40 µL液态氟碳，超声波细胞粉粹仪震荡，超声强度400 W，超声时间每次为10 s，共8次再加入2 mL F68 (1%)溶液， 超声强度400 W，时间设为每次为10 s，共8次真空旋转蒸发除去二氯甲烷，即得造影微粒叶酸修饰的聚乙二醇化乳酸羟基乙酸共聚物包裹液态氟碳的纳米粒称取叶酸-聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物4 mg，充分溶于200 L二氯甲烷文题释义：纳米级超声对比剂：具有较强的穿透能力，能够穿越血管内皮进入组织间隙，使血管外靶组织显像成为可能，从而超越了微米级对比剂仅能发生血池内显像的局限性，推动了超声分子显像技术的发展，

4、特别是针对肿瘤等重大疾病的早期诊断技术；使构建纳米级靶向超声对比剂成为国内外研究的热点。超声靶向分子成像技术：是利用对比剂表面固有的化学特性或通过对对比剂表面进行特殊处理，构建特异性靶向超声对比剂，使其经静脉注入后能靶向性聚集并较长时间滞留于靶组织器官，再通过超声对比显影，产生分子水平显影，提高超声对早期病变的诊断及鉴别能力。摘要背景：研究表明，纳米级超声对比剂具有较强的穿透能力，使血管外靶组织显像成为可能，超越了微米级对比剂仅能发生血池内显像的局限性。目的：构建叶酸修饰的乳腺癌靶向纳米超声造影微粒，评估其与细胞靶向结合的能力及体外超声成像效果。方法：采用超声乳化-蒸发法制备对比剂聚乙二醇化乳

5、酸羟基乙酸共聚物包裹液态氟碳的纳米粒(记为mPP/PFOB)和叶酸修饰的聚乙二醇化乳酸羟基乙酸共聚物包裹液态氟碳的纳米粒(记为mPPF/PFOB)。生物相容性检测：取对数生长期的人皮肤成纤维细胞HFF-1、人乳腺癌MCF-7细胞，分别加入0，0.005，0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，1 g/L的mPP/PFOB或mPPF/PFOB，培养24 h后检测细胞活力。体外寻靶能力检测：取对数生长期的HFF-1、MCF-7细胞，均分3组干预，A、B组分别加入Cy5标记的mPP/PFOB与mPPF/PFOB，C组在加入Cy5标记的mPP/PFOB前以叶酸处理2 h，培养0.5 h后，流式细

6、胞仪检测荧光强度；培养20 min后，共聚焦显微镜观察对比剂在细胞中的分布。体外超声显影：实验分3组，A组为生理盐水，B组制备 mPPF/PFOB纳米粒与生理盐水混悬液，C组以 mPPF/PFOB纳米粒与生理盐水混悬液重悬MCF-7细胞沉淀，制备纳米粒与细胞混悬液，将3种液体加入乳胶手套中扎紧，采用超声诊断仪检测体外超声成像效果。结果与结论：生物相容性检测结果：两种纳米粒无明显的细胞毒性；流式细胞仪检测结果：在MCF-7细胞中，B组平均荧光强度明显高于A组和C组；而在HFF-1细胞中，3组平均荧光强度无显著差别；共聚焦显微镜观察结果：mPPF/PFOB主要聚集在MCF-7细胞膜周围，mPP/P

7、FOB则分布在胞浆。体外超声显影结果：mPPF/PFOB与MCF-7细胞结合后，在体外能增强超声回声；结果提示：叶酸修饰的聚乙二醇化乳酸羟基乙酸共聚物包裹液态氟碳的纳米粒具有良好的生物相容性，具有与乳腺癌MCF-7细胞靶向结合能力和增强超声显像效果。3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083关键词：生物材料；纳米材料；纳米粒；聚乙二醇；聚乳酸-羟基乙酸共聚物；叶酸受体；超声诊断；靶向对比剂；乳腺癌；国家自然科学基金主题词：纳米粒；超声检查；造影剂；组织工程 基金资助：国家自然科学基金(81172078)，宁波市社会发展重大择优科技攻关项目(2012C50

8、13)Chen Yuan-yuan, Studying for masters degree, Physician, Department of General Surgery, General Surgery Laboratory, Affiliated Xinhua Hospital, Medical School of Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200092, ChinaCorresponding author: Han Bao-san, Chief physician, Department of General Surgery,

9、General Surgery Laboratory, Affiliated Xinhua Hospital, Medical School of Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200092, ChinaConstruction of folate-modified nanoparticles as ultrasound contrast agent targeting breast cancerChen Yuan-yuan1, Xu Feng1, Yang Hui2, Liu Ting1, Zhou Jian-qiao3, Cai Chen-

10、lei4, Ye Yuan-yuan1, Liu Pei-feng4, Han Bao-san1 (1Department of General Surgery, General Surgery Laboratory, Affiliated Xinhua Hospital, Medical School of Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200092, China; 2Key Laboratory of Macromolecular Synthesis and Functionalization of Ministry of Educatio

11、n, Department of Polymer Science and Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, Zhejiang Province, China; 3Department of Ultrasound, Affiliated Ruijin Hospital, Medical School of Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200025, China; 4Medical Science Research Center, Affiliated Renji Hospita

12、l, Medical School of Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200127, China)AbstractBACKGROUND: Studies have testified that nano-ultrasound contrast agents have a strong permeability, making it possible to image the targeted tissues outside blood vessels and overcome the limitation that micron contra

13、st agents are only available for the blood pool imaging.OBJECTIVE: To construct the folate-modified nanoparticles targeting breast cancer as ultrasound contrast agents, as well as to observe their ability to specifically bind to cells and imaging effect in vitro.METHODS: Both contrast agents, pegyla

14、ted lactic acid-glycolic acid copolymer wrapping liquid fluorocarbon formed nanoparticles (mPP/PFOB) and folate modified pegylated lactic acid-glycolic acid wrapping liquid fluorocarbon formed nanoparticles (mPPF/PFOB), were constructed by phacoemulsification-evaporation method. (1)Biocompatibility

15、detection: HFF-1 and MCF-7 cells in the logarithmic phase were cultivated with various concentrations (0, 0.005, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2 and 1 g/L) of mPP/PFOB or mPPF/PFOB for 24 hours respectively, and then the cell viability was measured. (2)Targeting ability detection in vitro: HFF-1 and MCF-

16、7 cells in the logarithmic phase were divided into three groups. Cy5-labled mPP/PFOB and mPPF/PFOB were added into groups A and B, respectively; the cells in group C were pretreated with folate for 2 hours, and sequentially Cy5-labled mPPF/PFOB was added into group C. Fluorescence intensity was dete

17、cted by flow cytometry after 0.5 hours of culture. The distribution of contrast agents in cells was observed using confocal microscopy after 20 minutes of culture. (3)Ultrasound imaging in vitro: there were three groups: saline was as group A; the suspension of saline and mPPF/PFOB nanoparticles was

18、 prepared as group B; MCF-7 cells were resuspended with the mixture of saline and mPPF/PFOB nanoparticles to prepare the suspension of nanoparticles and cells as group C. In each group, the suspension was added into latex gloves, that were then tightened and immersed in water. Finally, the ultrasoun

19、d was use to detect the ultrasound imaging effect in vitro.RESULTS AND CONCLUSION: Neither nanoparticles were with significant cytotoxicity. The flow cytometry showed that the mean fluorescence intensity in MCF-7 cells of group B was significantly higher than that of groups A and C. But there were n

20、o significant differences in the mean fluorescence intensity in HFF-1 cells among the three groups. It was observed that mPPF/PFOB mainly gathered around the MCF-7 cell membrane, while mPP/PFOB randomly distributed in the cytoplasm. After mPPF/PFOB binding to MCF-7 cells, they could enhance ultrasou

21、nd echo in vitro. These findings indicate that the targeted nanoparticles mPPF/PFOB have good biocompatibility and can specifically bind to breast cancer MCF-7 cells in vitro and enhance the imaging capability.Subject headings: Nanoparticles; Ultrasonography; Contrast Media; Tissue EngineeringFundin

22、g: the National Natural Science Foundation of China, No. 81172078; Major Science and Technology Project of Ningbo Social Development, No. 2012C5013Cite this article: Chen YY, Xu F, Yang H, Liu T, Zhou JQ, Cai CL, Ye YY, Liu PF, Han BS. Construction of folate-modified nanoparticles as ultrasound cont

23、rast agent targeting breast cancer. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(30):4425-4433.4431ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction乳腺癌的发病率占女性恶性肿瘤的首位，死亡率占第2位，严重威胁女性的身心健康1。乳腺癌的早期诊断和早期治疗是提高治愈率和降低死亡率的关键。研究表明，早期乳腺癌的治愈率可达90%以上，并且早期乳腺癌患者可进行保乳根治手术，可显著减轻对女性身心造成的创伤。如何无创伤性提高早期乳腺癌诊断的准确性，已成

24、为当今乳腺恶性肿瘤研究的热点之一。目前，临床使用的常规超声对比剂(如声诺维)对良恶性乳腺肿瘤的判定有良好的灵敏度和特异性，显著提高了乳腺癌诊断的正确性，但仍然存在很多局限性2-5。它们粒径多数为微米级，只能在肿瘤组织毛细血管中循环，不能透过血管内皮间隙，属于血管池显像6，非肿瘤特异性成像；乳腺癌等实性肿瘤超早期靠周围组织供血，在癌组织较小(体积2.0-3.0 mm3)的无血管期容易被漏诊，无法实现肿瘤超早期的准确诊断及鉴别诊断。超声靶向分子成像技术及纳米生物技术的迅猛发展和学科的交叉渗透，为克服这些不足提供了新的研究思路。超声靶向分子成像技术是利用对比剂表面固有的化学特性或通过对对比剂表面进行

25、特殊处理，构建特异性靶向超声对比剂，使其经静脉注入后能靶向性聚集并较长时间滞留于靶组织器官，再通过超声对比显影，产生分子水平显影，提高超声对早期病变的诊断及鉴别能力。研究表明，疾病(如肿瘤)状态中血管内皮细胞连接存在缺陷，内皮间隙可允许直径小于700 nm的颗粒穿过，这为纳米级超声对比剂应用于血管外靶组织显像、实现病变组织特异性诊断提供了理论基础。叶酸受体是一种通过糖基磷脂酰肌醇锚定于细胞膜上的糖蛋白7，在正常组织中不表达或低表达，而在乳腺癌8-10、卵巢癌11、子宫内膜癌12、肺腺癌等肿瘤中过度表达13。与抗体类大分子相比，叶酸免疫原性低，生物化学性质稳定，易于修饰，相对分子质量小，穿透能力

26、强，能很快渗透到实体肿瘤中；叶酸-叶酸受体的结合具有高度亲和力，且叶酸的羧基与其他分子偶联后仍能保持与叶酸受体的高亲和性，这些优点使得叶酸成为目前肿瘤诊断和治疗的理想靶向载体14-22。聚乳酸-羟基乙酸共聚物是一种具有良好生物相容性、可生物降解、无毒的高分子化合物23-24，已通过美国的FDA认证，被正式作为药用辅料收录进美国药典，具有良好的成囊、成膜性能和特有的机械强度，已成为目前超声对比剂和药物载体研制中最具前途的材料25-26。以可生物降解的高分子多聚物为疏水段与水溶性好、柔性好、低免疫原性的聚乙二醇等组成的两亲性两嵌段共聚物，因有疏水段和亲水段而具有类似非离子表面活性剂的性质，在水中能

27、自发形成具有极稳定壳-核结构的有序聚集体-胶束。Rapoport等27用两嵌段共聚物聚乙二醇-聚乳酸作为成膜材料制成能发生气液相变的纳米泡，发现其在体内稳定，长循环，通过被动靶向到达肿瘤组织间隙后，在超声诱导下转变成微泡，增强成像效果。因此实验采用具有多模态造影潜能的液态氟碳作为纳米粒的核，用叶酸修饰的聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物作纳米粒壳膜，拟构建一种新型的叶酸修饰乳腺癌靶向的纳米超声对比剂，并探讨其细胞毒性，体外寻靶能力及显像效果；为乳腺癌等叶酸受体阳性肿瘤的早期诊断和靶向治疗提供有益借鉴。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 观察性实验。1.2 时

28、间及地点 实验于2014年11月至2015年12月在上海交通大学附属新华医院普外科实验室、仁济医院中心实验室及教育部高分子合成与功能构造重点实验室完成。1.3 实验方法 1.3.1 对比剂的制备与表征 采用超声乳化-蒸发法制备纳米粒28-29，具体步骤如下：称取叶酸-聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物4 mg，充分溶于200 L二氯甲烷。逐滴加入40 µL液态氟碳，超声波细胞粉粹仪震荡，超声强度400 W，超声时间每次为10 s，共8次。再加入2 mL F68(1%)溶液，超声强度400 W，时间设为每次为10 s，共8次。真空旋转蒸发除去二氯甲烷，即得造影微粒叶酸修饰的聚乙二醇化乳酸

29、羟基乙酸共聚物包裹液态氟碳的纳米粒(记为mPPF/PFOB)。将步骤中的叶酸-聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物换为聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物，以相同方法制备造影微粒聚乙二醇化乳酸羟基乙酸共聚物包裹液态氟碳的纳米粒(记为mPP/PFOB)。荧光染料Cy5-NHS标记的纳米粒的制备步骤如下：称取叶酸-聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物 4 mg，充分溶于180 L二氯甲烷。逐滴加入20 µL Cy5-NHS (浓度为10 mg/L)，充分混匀。之后重复上述的第2-4步，即可制得Cy5标记的Cy5/mPPF/PFOB和Cy5/mPP/ PFOB纳米粒。取适量纳米粒悬液稀释一定倍数，用激

30、光粒径仪检测其粒径和表面电位，显微镜和透射电镜观察其形态。叶酸修饰的靶向纳米超声造影剂制备及性能研究所需的主要材料、试剂和仪器：材料、试剂与仪器来源聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙二醇乙二胺西安瑞禧生物有限公司叶酸中国医药集团上海化学试剂公司聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物、叶酸-聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物上海交通大学医学院附属仁济医院中心实验室Cyanine5 NHS ester美国Lumiprobe公司二氯甲烷重庆川江化学试剂厂Pluronic®F68(F68)德国BASF公司胎牛血清、DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶-EDTA美国Gibco公司PFOBTCI公司叶酸受体抗体

31、、山羊抗小鼠二抗英国abcam公司JEM-1230透射电子显微镜日本JEOL公司JY92-2D超声波细胞粉碎仪宁波新芝生物科技股份有公司精密电子天平北京赛多利思科学仪器有限公司Zetasizer Nano 分析仪英国马尔文仪器有限公司激光共聚焦显微镜Carl Zeiss Jena公司流式细胞仪BD公司SpectraMax 190型全波长酶标仪美谷分子仪器（上海）有限公司TGL-16B台式离心机上海精密仪表有限公司真空旋转蒸发仪北京中西远大科技有限公司DAPI、40 g/L多聚甲醛上海碧云天生物技术有限公司飞利浦IU22型超声诊断仪德国西门子股份有限公司1.3.2 纳米粒的细胞相容性检测细胞的获

32、取及培养：人皮肤成纤维细胞HFF-1及人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231购自中国科学院干细胞库(上海)。将HFF-1细胞培养于含体积分数15%胎牛血清的DMEM培养基，MCF-7、MDA-MB-231细胞培养于含体积分数10%胎牛血清及1%青霉素和链霉素的DMEM培养基；将培养皿置于37 、体积分数5%CO2培养箱内。每三四天传代1次，传代时用0.25%胰蛋白酶进行消化，取对数生长期细胞进行实验。Western blot实验检测细胞内叶酸受体蛋白的相对含量：收集细胞，加入RIPA裂解液提取细胞总蛋白，并用BCA法测定蛋白浓度，进行SDS-PAGE电泳。将蛋白转至硝酸纤维素膜上，5%脱

33、脂牛奶室温摇床孵育1.5 h，TBST漂洗3遍，加入小鼠源性一抗(抗FR 1500，抗-actin 11 000)，4 孵育过夜。次日TBST漂洗3遍，加入山羊抗小鼠的二抗(11 000)室温摇床孵育1 h，TBST漂洗3遍，ECL显色。以-actin作为内参。CCK8法检测细胞活力：将对数生长期的HFF-1、MCF-7细胞接种于96孔板，每孔5×103个细胞，培养 24 h待细胞贴壁后进行处理。实验组分别加入质量浓度为0.005，0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，1 g/L的mPP/PFOB或mPPF/PFOB，对照组不加对比剂，空白组不加对比剂和细胞，每组设3个平行孔

34、。放入培养箱培养24 h后，每孔加入CCK8溶液10 L，继续培养3 h。用酶标仪在波长450 nm处检测每孔的吸光度值(A450 nm)。重复实验3次，取其均值。使用GraphPad Prism 5.0软件作细胞活力曲线时，横坐标采用各个浓度Log10的值。细胞活力=(A实验组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100%1.3.3 流式细胞仪检测纳米粒与细胞的黏附结合能力 将叶酸受体阴性的HFF-1细胞和叶酸受体阳性的MCF-7细胞均分为3组，分别为A组、B组及C组。取对数生长期的细胞接种于6孔板，每孔5×104个细胞，培养24 h待细胞贴壁后进行处理。A组、B组分别加

35、入荧光染料Cy5标记的纳米粒mPP/PFOB、mPPF/PFOB，C组在加入Cy5标记的纳米粒mPPF/PFOB前用叶酸预处理2 h，纳米粒终质量浓度为0.1 g/L；共孵育0.5 h后，弃去培养基，用PBS轻轻吹打洗涤3次，胰酶消化，收集细胞，1 000 r/min转速离心3 min，PBS洗涤2次后重悬于300 L缓冲液内，流式细胞仪检测细胞摄取Cy5标记的纳米粒后的平均荧光强度，激发光波长为633 nm，发射光波长为670 nm，实验重复3次。激光共聚焦显微镜观察对比剂在细胞中的分布情况：将叶酸受体阴性的HFF-1细胞和叶酸受体阳性的MCF-7细胞均分为3组，分别为A组、B组及C组。取对

36、数生长期的细胞接种于已放有小圆玻片的24孔板，每孔5×103个细胞，培养24 h待细胞贴壁后进行处理。A组、B组分别加入荧光染料Cy5标记的纳米粒mPP/PFOB、mPPF/PFOB，C组在加入mPPF/PFOB前用叶酸预处理2 h，对比剂终浓度为0.1 g/L；共孵育20 min后，弃去培养基，用PBS轻轻吹打洗涤3次，40 g/L多聚甲醛固定10 min后，0.5%Trton透化10 min，PBS洗涤1次，DAPI染色15 min，PBS洗涤2次，抗淬灭剂封固后暗盒保存，于激光共聚焦显微镜下观察各组对比剂在细胞中的分布情况，实验重复3次。1.3.4 靶向对比剂体外超声显影 实验

37、分为3组，A组取4 mL生理盐水加入乳胶手套中扎紧；B组将mPPF/ PFOB纳米粒与生理盐水混合，制备0.2 mg/L混悬液，取4 mL该混悬液加入乳胶手套中扎紧；C组以B组中制得的混悬液重悬MCF-7细胞沉淀，制备纳米粒与细胞混悬液，置于37 细胞培养箱中孵育15 min，取4 mL混悬液轻轻吹匀后加入乳胶手套中扎紧；将上述3组手套分别固定在25 水中，使用飞利浦超声诊断仪IU22，L9-3型探头，频率4 MHz的宽频基波成像。浅表器官常规设置，机械指数为0.05，采用实时造影匹配成像技术检测纳米粒的超声显影性能，用超声仪内部工作站存储图像资料。1.4 主要观察指标 叶酸修饰的乳腺癌靶向纳

38、米超声造影微粒与细胞靶向结合的能力以及体外超声成像的效果。1.5 统计学分析 实验所得数据采用GraphPad Prism 5.0软件(La Jolla，CA，USA)进行统计学分析。计量资料数据以±s表示，两组间均数比较用两独立样本t 检验，多组间均数比较用单因素方差分析，检验水准=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。2 结果 Results 2.1 mPPF/PFOB和mPP/PFOB纳米粒的物理性质 mPPF/PFOB和mPP/PFOB纳米粒悬液外观均呈乳白色，不透明，表面无明显的泡沫或气泡。制备完成后即时用生理盐水稀释后，于光学显微镜下观察，可见纳米粒呈圆球形

39、，粒径大小分布较均匀(图1A，B)。将纳米粒悬液于4 冰箱静置48 h，可见乳白色沉淀。将其用超声波细胞粉粹仪震荡，超声强度400 W，超声时间每次为10 s，共4次后，用生理盐水稀释，于光学显微镜下观察，可见纳米粒形状和粒径大小与0 h显微镜下所见无明显差别。Zetasizer Nano 分析仪检测0 h和静置48 h后，用超声粉粹仪重新处理对比剂的平均粒径和Zeta 电位，结果如表1所示。统计分析表明制备的两种对比剂在0，48 h时的平均粒径和Zeta电位没有明显变化(P > 0.05)，此结果与显微镜下观察结果一致；而在相同时刻mPPF/PFOB纳米粒的平均粒径均较mPP/PFOB

40、略大，而mPPF/PFOB纳米粒Zeta电位的绝对值均较mPP/PFOB小(P < 0.05)。透射电镜观察纳米粒为大小较均匀的球形，平均直径小于1 000 nm，直径大小与粒径仪器检测结果相吻合(图1C，D)。纳米粒Cy5/mPPF/PFOB及Cy5/mPP/PFOB的粒径及Zeta电位如表2所示，检测结果显示，Cy5/mPPF/ PFOB纳米粒的平均粒径较Cy5/mPP/PFOB略大，Cy5/mPPF/ PFOB纳米粒Zeta电位的绝对值较Cy5/mPP/PFOB小(P < 0.05)，而Cy5标记对纳米粒的粒径大小和Zeta电位无明显影响(P > 0.05)。2.2 细

41、胞内叶酸受体蛋白相对表达量 如图2所示，叶酸受体蛋白在人成纤维细胞HFF-1中的表达量很低，而乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231内叶酸受体的表达量远远高于HFF-1细胞的表达量。研究之后的细胞实验以HFF-1为叶酸受体表达阴性细胞的代表，以MCF-7细胞为叶酸受体表达阳性细胞的代表。2.3 CCK8实验检测结果 用CCK8实验检测HFF-1、MCF-7细胞与不同浓度mPP/PFOB、mPPF/PFOB共孵育24 h后细胞的活力，来评估mPP/PFOB、mPPF/PFOB的细胞毒性。结果表明，在对比剂质量浓度低于0.2 g/L的低浓度时，两种细胞的活力均在90%以上；即使在对比剂为高质量

42、浓度1 g/L时，两种细胞的活力仍在75%以上，结果见图3；提示小剂量对比剂mPP/PFOB、mPPF/PFOB没有明显的细胞毒性，具有良好的生物相容性。2.4 纳米粒体外寻靶能力的检测 用流式细胞仪检测Cy5标记mPP/PFOB和mPPF/PFOB对比剂与HFF-1、MCF-7细胞的黏附结合能力，细胞内摄取或者表面黏附的对比剂越多，所检测细胞的平均荧光强度越强30。检测结果如图4a所示：在HFF-1细胞中，3组平均荧光强度无明显差别(P > 0.05)；而在MCF-7细胞中，B组的平均荧光强度明显高于A组和C组，且C组荧光强度显著低于A组(F=129.8，P < 0.001)，提

43、示靶向纳米粒mPPF/ PFOB与叶酸受体阳性的细胞具有靶向结合能力，且叶酸能够有效阻止mPPF/PFOB与叶酸受体阳性细胞的靶向结合。 激光共聚焦显微镜观察对比剂mPP/PFOB、mPPF/ PFOB在叶酸受体阴性细胞HFF-1和叶酸受体阳性细胞MCF-7细胞中的分布情况，结果如图4b所示，两种对比剂均无规则的分散在HFF-1细胞浆中，且叶酸不能有效阻止靶向对比剂mPPF/PFOB与HFF-1细胞的结合；而在MCF-7细胞中，mPP/PFOB对比剂无规则地分布于细胞浆内，靶向对比剂mPPF/PFOB则主要黏附在细胞表面，沿细胞膜较规则地排列呈花环状围绕在核周，并且叶酸可有效阻止靶向对比剂结合

44、至细胞表面。2.5 体外超声成像效果 将mPPF/PFOB纳米粒按一定比例与生理盐水稀释后，超声观察其显像效果。单纯生理盐水无回声信号(图5A)，加入对比剂的生理盐水与图1 不同对比剂的光学显微镜和扫描电镜观察结果Figure 1 Observations of different contrast agents under light microscope and scanning electron microscope图注：图中A、B分别为叶酸修饰的聚乙二醇化乳酸羟基乙酸共聚物包裹液态氟碳的纳米粒(mPPF/PFOB)和聚乙二醇化乳酸羟基乙酸共聚物包裹液态氟碳的纳米粒(mPP/PFOB)对

45、比剂光学显微镜下的形态，纳米粒呈圆球形，粒径大小分布较均匀(×100)；C、D分别为叶酸修饰的聚乙二醇化乳酸羟基乙酸共聚物包裹液态氟碳的纳米粒和聚乙二醇化乳酸羟基乙酸共聚物包裹液态氟碳的纳米粒对比剂透射电镜下的形态，纳米粒为大小较均匀的球形物，平均直径小于500 nm(×40 000)。mPP/PFOBmPPF/PFOBb12011010090807060mPP/PFOBmPPF/PFOB12011010090807060a细胞活力(%)细胞活力(%)-2.5 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0-2.5 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0质量浓度(lg)(g

46、/L)质量浓度(lg)(g/L)图3 不同对比剂对HFF-1、MCF-7细胞活力的影响Figure 3 Effects of different contrast agents on the cell viability of HFF-1 and MCF-7 cells图注：mPP/PFOB为聚乙二醇化乳酸羟基乙酸共聚物包裹液态氟碳的纳米粒，mPPF/PFOB为叶酸修饰的聚乙二醇化乳酸羟基乙酸共聚物包裹液态氟碳的纳米粒。图中A和B分别为纳米粒对比剂作用于HFF-1、MCF-7细胞24 h后的细胞活力曲线；在对比剂质量浓度低于0.2 g/L时，两种细胞活力均在90%以上；在高质量浓度1 g/L时

47、，两种细胞的活力仍在75%以上。1 5001 0005000HFF-1 FCM-7平均荧光强度A组B组C组bA组 B组 C组aHFF-1MCF-7图4 不同对比剂的体外寻靶能力检测Figure 4 The targeting ability in vitro of different contrast agents图注：A组以聚乙二醇化乳酸羟基乙酸共聚物包裹液态氟碳的纳米粒(mPP/PFOB)干预细胞，B组以叶酸修饰的聚乙二醇化乳酸羟基乙酸共聚物包裹液态氟碳的纳米粒(mPPF/PFOB)干预细胞；C组以叶酸修饰的聚乙二醇化乳酸羟基乙酸共聚物包裹液态氟碳的纳米粒干预细胞前，以叶酸预处理2 h。图

48、中a为流式细胞仪检测HFF-1和MCF-7细胞与纳米粒对比剂作用0.5 h后，细胞的平均荧光强度；在HFF-1细胞中，3组平均荧光强度无明显差别(P > 0.05)；而在MCF-7细胞中，B组荧光强度明显高于A组和C组，且C组荧光强度显著低于A组(F=129.8，P < 0.001)。b为激光共聚焦显微镜观察对比剂在HFF-1、MCF-7细胞中的分布情况，两种对比剂均无规则地分散在HFF-1细胞浆中，且叶酸不能有效阻止靶向对比剂叶酸修饰的聚乙二醇化乳酸羟基乙酸共聚物包裹液态氟碳的纳米粒与HFF-1细胞的结合；而在MCF-7细胞中，聚乙二醇化乳酸羟基乙酸共聚物包裹液态氟碳的纳米粒对比

49、剂无规则地分布于细胞浆内，叶酸修饰的聚乙二醇化乳酸羟基乙酸共聚物包裹液态氟碳的纳米粒对比剂主要黏附在细胞表面，沿细胞膜较规则地排列呈花环状围绕在核周，且叶酸可有效阻止靶向对比剂结合至细胞表面。HFF-1 MDA-MB-231 MCF-7叶酸受体-actin图5 叶酸修饰的聚乙二醇化乳酸羟基乙酸共聚物包裹液态氟碳的纳米粒对比剂体外超声显影Figure 5 The ultrasound imaging in vitro of folate-modified pegylated lactic acid-glycolic acid wrapping liquid fluorocarbon formed

50、 nanoparticles图注：图中A为单纯生理盐水，无回声信号；图B为加入对比剂的生理盐水，显像效果仅稍微增强,表现为少许点状强回声；图C为加入MCF-7细胞后，叶酸修饰的聚乙二醇化乳酸羟基乙酸共聚物包裹液态氟碳的纳米粒对比剂回声则明显增强，显示为密集的点状强回声。图2 HFF-1、MDA-MB-231和MCF-7细胞中叶酸受体的蛋白表达量Figure 2 Protein expression of folate receptor in HFF-1, MDA-MB-231 and MCF-7 cells图注：图中-actin为内参，叶酸受体蛋白在HFF-1中的表达量很低，而在MCF-7和M

51、DA-MB-231细胞内过表达。表1 纳米对比剂的粒径和电位 (±s)Table 1 Mean diameter and potential of nano contrast agents项目0 h48 hmPPF/PFOBmPP/PFOBmPPF/PFOBmPP/PFOB平均直径(nm)347.3±22.2306.2±12.9 a362.4±33.4 314.3±15.9 aZeta电位(mV)-(21.4±1.4)-(26.1±1.2) a-(21.7±1.8) a-(25.9±1.3) a表注：mP

52、P/PFOB为聚乙二醇化乳酸羟基乙酸共聚物包裹液态氟碳的纳米粒，mPPF/PFOB为叶酸修饰的聚乙二醇化乳酸羟基乙酸共聚物包裹液态氟碳的纳米粒。与同时刻mPPF/PFOB纳米粒比较，aP < 0.05。表2 Cy5标记的纳米对比剂的粒径和电位 (±s)Table 2 Mean diameter and potential of Cy5-labeled nano contrast agents项目Cy5/mPPF/PFOBCy5/mPP/PFOBmPPF/PFOBmPP/PFOB平均直径(nm)348.4±25.9308.5±22.4a 347.3±

53、22.2306.2±12.9Zeta 电位(mV)-(21.3±1.6)-(26.3±0.95) -(21.4±1.4)-(26.1±1.2)表注：mPP/PFOB为聚乙二醇化乳酸羟基乙酸共聚物包裹液态氟碳的纳米粒，mPPF/PFOB为叶酸修饰的聚乙二醇化乳酸羟基乙酸共聚物包裹液态氟碳的纳米粒。与对比剂Cy5/mPPF/PFOB比较，aP < 0.05。单纯生理盐水比较，显像效果仅稍微增强，表现为少许点状强回声，但mPPF/PFOB纳米对比剂回声信号仍然很低，接近无回声(图5B)；加入MCF-7细胞后，mPPF/ PFOB纳米对比剂回声则

54、明显增强，显示为密集的点状强回声(图5C)；提示mPP/PFOB对比剂结合至靶细胞并在其表面聚集之后，可产生明显增强的超声信号。3 讨论 Discussion超声具有经济、安全、方便、短期内可重复检查、普及率高等优点，在中国是乳腺疾病临床检查最常用的影像学方法之一。研究表明，纳米级超声对比剂具有较强穿透能力，能够穿越血管内皮进入组织间隙，使血管外靶组织显像成为可能，从而超越了微米级对比剂仅能发生血池内显像的局限性，推动了超声分子显像技术的发展，特别是针对肿瘤等重大疾病的早期诊断技术；使构建纳米级靶向超声对比剂成为国内外研究的热点31。田慧玲等32研究表明，叶酸受体在乳腺恶性肿瘤中高表达，且叶酸

55、受体过表达与预后不良相关；因而针对乳腺癌这一特征制备一种具有靶向作用的纳米级超声对比剂，将有利于提高乳腺癌的早期检出率和对预后的判定。 实验采用先将叶酸修饰于聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸后，再用超声乳化-蒸发法包裹液态氟碳，制备纳米对比剂，拟通过叶酸与乳腺癌细胞膜上的叶酸受体特异性结合，实现纳米粒与肿瘤细胞的靶向结合，制备过程简单，技术成熟；避免了先制备纳米粒，再在纳米粒表面修饰叶酸的繁杂步骤和修饰叶酸时对纳米粒结构可能造成的破坏。通过体外寻靶实验证明了该纳米对比剂能主动与乳腺癌细胞MCF-7靶向结合。研究表明，大多数肿瘤细胞表面的负电荷量比同源正常细胞多。实验制备的纳米对比剂表面电位均为负，根

56、据同种电荷相斥原理，对比剂很难吸附于HFF-1、MCF-7细胞表面。但是流式细胞仪结果显示，MCF-7细胞与mPPF/PFOB对比剂共孵育后，MCF-7细胞的平均荧光强度较A组显著增高，并且叶酸能够使MCF-7细胞的平均荧光强度明显降低；而在HFF-1细胞中，3组间的平均荧光强度没有统计学差异；此结果提示对比剂与MCF-7细胞的粘附并不依赖于两者间电荷的吸引作用，而是依靠FA与RA的特异性靶向结合。激光共聚焦显微镜观察显示的mPPF/PFOB纳米粒，呈花环状围绕在MCF-7细胞膜周围，mPP/PFOB纳米粒无规则地分布在胞浆内的结果，也再次证明了mPPF/PFOB纳米对比剂能与MCF-7细胞特异性地靶向结合。传统超声对比剂的粒径和散射强度是一对矛盾体。粒径越小穿透能力越强，产生的散射越弱，成像效果越差，反之亦然。实验制备的靶向纳米对比剂超声成像则不完全依赖于对比剂粒径，其体外超声结果显示，游离状态下的成像效果非常弱，只有在与