达安血筛项目介绍

1、 达安基因核酸检测系统介绍拉萨2017年2月15日1血液核酸筛查一、血液核酸筛查开展的意义二、血液核酸筛查的主要技术三、血液核酸筛查的开展路线和要求血液筛查 血液可以挽救病人的生命 同时输血或血液制品又有传播疾病的危险 全球每年输血感染人数 HBV: 8,000,000 -16,000,000 HCV: 2,300,000 4,7000,000 HIV: 80,000 - 160,000输血医学从诞生的那一天起，就在不断寻求如何用血液治疗疾病、拯救病人的生命，同时保证血液安全，消除疾病传播的危险。血源筛查项目（常规检测）血源筛查项目（核酸检测）EIA EIA 酶联免疫检测缺陷酶联免疫检测缺陷N

2、ATNAT核酸检测优点核酸检测优点较长的血清转换窗口期筛选出处于血清窗口期献血员病毒株变异避免试剂假阴性（包括病毒株变异引起）免疫静默期鉴别无抗体反应的慢性病毒携带者核酸血液筛查(NAT)检测方法基于病毒核酸的检测，比血清血方法有着更高灵敏度、更高特异性，能够更早期地检测到病原体的感染。NATNAT核酸检测不足核酸检测不足可以大大缩短窗口期，但是不能完全消除窗口期高灵敏度的特点也造成了出现假阳性的风险（产物和样本间）免疫检测及分子生物学检测单独使用均可造成漏检。血筛与患者生命攸关，应慎之又慎。两种检测同时使用，结果互补，可在目前科技水平下最大程度防止漏检。血液核酸筛查的背景数据血液核酸筛查（N

3、AT）Nucleic Acid Test 基于核酸检测技术平台的献血源性血液筛查。血液核酸检测主要技术I. 检测模式：单人份检测（ IDT）和混合样本检测（ Pooled Testing）II.提取技术：主流技术-磁珠法核酸提取III.检测技术：主要包括 聚合酶链反应（ PCR）核酸扩增检测 转录介导的扩增检测（ TMA）磁珠法提取磁珠法提取PCR条件靶序列引物探针PCR检测原理PCR检测原理PCR检测原理 基线期 指数期 对数期 平台期PCR检测原理 基线期 指数期 对数期 平台期PCR检测原理 基线就是扩增曲线的水平部分， PCR最初几个循环的荧光信号,基线（空白）信号的产生是由于背景引起

4、的。在这段时间里，荧光信号变化不大，接近一条直线，因此称为基线。缺省设置为3-12个循环的荧光信号。PCR检测原理PCR检测原理 CT（Cycle threshhold）值：到达阈值荧光信号所需要的循环数。PCR检测原理-内标设计原理 全程进行质量监控质控，参与核酸提取和扩增，避免假阴性检测结果。 内标自核酸提取步骤开始加入反应液中，保证内标和样本反应条件一致，以反应每管真实的扩增情况 内标探针与目标基因探针采用不同的荧光报告基团标记，在不同的波长区分别检测，通过检测内标是否获得正常扩增来监测待测样本中是否具有PCR抑制物。 如果内标和样品都未扩增出结果，则表示该管扩增无效。对于PCR检测体系

5、， IC应在一定的CT值范围内。血液核酸检测开展路线图I. 血筛核酸项目立项II.实验室建设、设备和试剂采购III.设备的安装、调试、人员培训IV.系统的调试、试运行V. 正式运行，每日报告，质量反馈血液核酸检测环境要求 按照卫计委颁布的血站核酸检测实验室质量保证指南 实验室分为三个区域 试剂准备区（试剂和耗材的存放） 样本处理区（DA3500全自动核酸提取仪） 扩增分析区（AFD9600荧光PCR仪）血液核酸检测环境要求（1）试剂准备区、标本制备区和扩增分析区三个区域在物理空间上，必须是完全相互独立的，各区域无论是在空间还是在使用中，应始终处于完全的分隔状态，不能有空气的直接相通。（2）各区

6、的可移动的仪器设备及各种物品包括实验记录本、记号笔、试管架及清洁用具等必须专用。（3）在标本制备区、扩增分析区等相对有可能出现“污染物”的区域安装独立排风扇或其它排风和有效的通风装置，建议扩增后区域保持负压状态，以使空气按试剂准备区标本制备区扩增分析区方向流动。血液核酸检测环境要求（4）标本接收区域应与核酸实验室标本处理区域分开，以免过多人员进入标本处理区域造成污染。（5）实验室应具有清洁、消毒设施，遵从从清洁区域向污染区域实施消毒的原则在试验开始前和结束后对实验室地面、实验台面和空气实施清洁和消毒。废弃物需放置在指定位置或容器。可采用消毒设备（紫外灯、臭氧消毒装置）实施空气或相关位置的消毒。

7、血液核酸检测环境要求-试剂准备区l核酸扩增实验室中最为“洁净”的区域，不应有任何核酸的存在，包括试剂中所带的标准品和阳性对照。l试剂盒和实验用洁净物品如离心管、吸头等耗材的存放和准备处。l仪器设备主要有加样器、混匀器等。血液核酸检测环境要求-标本制备区l仪器设备主要有（加样设备、核酸提取仪）、生物安全柜、开盖机、离心机、冰箱等。 生物安全柜不应放在实验室门口等易受人员走动影响的地方，也不应直对分体式空调。l主要是用于血液样本的加样、核酸样本的提取。l加样器吸头必须带滤芯。血液核酸检测环境要求-PCR扩增区l仪器设备主要有实时荧光定量PCR仪，最好配备不间断电源（UPS）或稳压电源。l关键是要防

8、止扩增产物的污染。l每次扩增后，可使用紫外灯对扩增热循环仪进行照射。l扩增仪应定期进行校准。人员配置实验室基本操作人员需要2名质量监督员1名（可兼职）仪器维护人员1名（企业定期提供仪器设备维护）u核酸检测实验室技术人员应经过有资质的机构的核酸检测技术培训并核酸检测实验室技术人员应经过有资质的机构的核酸检测技术培训并获得合格证书获得合格证书，接受，接受实验室实验室生物生物安全以及厂家的上岗前仪器设备操作、维护及校准等的培训安全以及厂家的上岗前仪器设备操作、维护及校准等的培训。u核酸检测实验室应有限制进入的要求，核酸检测人员核酸检测实验室应有限制进入的要求，核酸检测人员必须经授权许可必须经授权许可

9、才能才能进入实验室。进入实验室。37标本的采集和管理38采血管要求核酸检测应使用带分离胶的真空采血管核酸检测应使用带分离胶的真空采血管，无菌无菌、无、无DNADNA酶、无酶、无RNARNA酶酶，标本标本为血清或者血浆（为血清或者血浆（ EDTA EDTA 或者或者枸橼酸盐抗凝枸橼酸盐抗凝）最好最好采用含惰性分离胶的采用含惰性分离胶的EDTA K2EDTA K2真空真空采血管留取。采血管留取。39标本的采集量要求用于核酸检测的标本，标本量对检测非常重要。核酸检测中，可能会进行标本确认试验，加之仪器故障等意外原因，增加了标本的复测需求量。达安的单检样本量1.0ml， 考虑各种可能因素，采血量尽量满

10、足不小于5ml，保证离心后2-3ml。40标本的采集要求严格采用无菌操作技术进行静脉穿刺。留样时用针头刺穿试管密封塞，按照采血管管标注的留取量准确留取，注意使用加抗凝剂的采血管应在采血后颠倒混匀5-10次（或按照采血管技术要求进行），使血液与抗凝剂充分混匀。应依据选用的采血管规格及自动加样仪的条码扫描要求在采血管相应的位置粘贴。 粘贴整齐，无污渍、无划痕、无缺损。条码标签底部与试管底部相隔 12-14mm 的距离；条码标签贴在样本管上，使得倾斜角不大于 5。41标本采集后的处理与保存要求标本在采血现场保存温度通常为2-10。采集后的标本宜在4 4小时内小时内实施离心，分离红细胞和血浆（1200

11、-1600g ，20min）。如不能按上述要求处理采集的标本，应对所采用（集） 的标本保存、处理（离心时间和条件）等条件进行保证弱阳性样本有效检出的确认。42标本的运送要求标本应隔离密封包装，包装材料应满足防水、防破损、防外泄、易于消毒处理。装箱时应保持标本管口向上。同时运输温度应在2-10，标本和冷源不要直接接触，并有温度监测措施。43标本接收要求标本接收时应仔细核对标本数量与送检单是否一致，建议采用计算机程序进行核对。特别强调标本采集时所留取标本的采血管均需逐一扫描，以保证不同采血管的同源性。运输过程温度应保持在2-10范围内，容量符合采血管标注的采集量，标本应无严重溶血、脂血、凝血、渗漏

12、。标签条形码清晰，无血渍、无划痕，粘贴符合要求，离心后运送的标本血浆和红细胞应被分离胶隔离。44标本拒收如有以下情形应拒收标本：n检测申请关键信息缺失或不符；n标本管无标识或标识不清、错误；n标本管选用错误；n严重溶血、脂血等影响检测结果的情形；n采血量不能满足检验需要量；n采样到送检时间超过规定期限；n离心后送检标本未达到离心效果（如分离胶胶面不平整等）。45标本接收后的处理及保存要求标本在检测前应保存在 2-8条件下，并于采样后 72 小时内完成核酸检测。 因特殊情况 72 小时以内不能完成检测的标本应在-20以下冻存。标本应在检测前从冰箱取出平衡至室温，观察其管壁外部有无冷凝水，以免影响

13、条码的扫描。真空采血管的开盖应在生物安全柜或正压环境中进行，自动开盖和手工开盖均应有防止样本交叉污染的措施。标本在进行检测后应密闭保存在 2-8，等待结果全部确认无误后进行处置或长期保存。2达安血筛系统一、NAT系统组成二、系统的技术特点三、系统的操作流程和维护血筛和临床的区别 定性与定量定性与定量 临床使用核酸检测主要目的是定量监测，进行疗效分析。 血筛用于病原体的定性筛查 灵敏度和特异性灵敏度和特异性 临床在漏检与误差之间更重视误差 血液筛查用核酸目的是保证用血安全，更重视漏检 质控要求不同质控要求不同 临床用与血液筛查用质控要求也不同。临床试剂以定量准确和防止误报为质控目标 血筛用以防止

14、漏检为主要目的 阳性率也不同阳性率也不同 临床更多的阳性；血筛更多是阴性 对自动化要求不同对自动化要求不同 临床更多用于病人,单人份检测,标本量少 血筛更多用于正常人，因此检测量不同，对自动化的要求也不同49达安血筛系统技术路线 单检筛查检测-血血站系统站系统单个标本单个标本（1.0ml / 个样本） 核酸提取-磁珠磁珠法（旋转式混匀法（旋转式混匀+ +转移磁珠式提取）转移磁珠式提取） 核酸检测-实时荧光实时荧光PCRPCR技术技术 质量控制-内标质控内标质控/UNG/UNG酶防污染酶防污染 采用转移磁珠的核酸提取模式-（上吸磁法） 转移磁珠（上吸磁法）转移磁珠（上吸磁法）： 通过一次性套管进

15、行混匀，并用磁棒进行磁珠转移动作： 操作步骤简单：避免移液操作引起的交叉污染，缩短核酸处理时间，避免由于时间过长导致核酸的降解。 液体混匀和洗涤充分：磁珠核酸结合和洗涤效率高，保证了核酸的得率和纯度。 节省一次性吸头的使用量：减少耗材的使用成本。 转移液体（下吸磁法）转移液体（下吸磁法）： 通过移液通道和震荡模块进行混匀，并进行多次的液体转移动作： 容易产生气泡，造成移液过程交叉污染； 容易产生液体残留：导致核酸纯化不足， 从而抑制扩增，影响灵敏度或造成假阴性； 增加了一次性吸头的用量和移液通道的损耗。转移磁珠的核酸提取模式（上吸磁法）系统组成生物样本安全操作自动化系统全自动核酸处理平台实时荧

16、光定量PCR仪信息自动化处理平台血源筛查HBV、HCV、HIV-1病毒核酸检测试剂盒（PCR荧光探针法） 假病毒内标质控系统 & UNG-dUTP国际化防污染系统 专一化单项目检测：保证检测结果的特异性和灵敏度，降低混合感染（混合样本）不同检测项目间干扰和抑制。 多种PCR引物探针体系：基因覆盖广，有效防止病毒突变引起的假阴性，降低漏检。 高性能的混样检测灵敏度：1ml样本体积+高效的扩增体系，降低混样检测漏检。 直接提供单项病毒检测结果：选用相同的高效扩增程序，2h同时给出单项病毒的检测结果，无需鉴别。试剂盒试剂盒储存温度储存温度核酸提取试剂室温保存核酸扩增试剂和质控品-20保存血源

17、筛查标准物质和质控品 溯源性：各系列标准物质可溯源至国家一级标准物质或WHO标准物质。 准确度：产品溯源性强，量值的准确度高。 稳定性：采用先进生产工艺，严格的生产质量体系，保证产品的质量稳定性与均一性。 互通性：均为液态标准标准，无需重新复融，操作简单且无基质效应。产品和临床样本互通性好。 多种组合：已获批准17项国家二级标准物质定级证书，包含血源性筛查核酸类和酶免类系列质控物质为客户提供多种组合和选择。全自动试管开盖机高效率：一次操作时间70%管理投入）样品保存不当运输成本过高保存成本过高样品混淆交叉风险提取失败人力管理分析前分析中/后 文献报告临床检测中60%错误是来自于 样品前处理直接

18、影响结果：灵敏度+重复性间接影响：人力投入、管理投入、风险投入生物样本前处理质量控制 核酸提取的得率 核酸提取的纯度 核酸提取的完整性 核酸提取的特异性DA3500全自动核酸处理平台-DA3500 全自动加样、核酸提取、纯化、PCR加样一体化，减少人工操作 可进行大体积样本核酸提取，保证核酸得率 采用TECAN 空气置换式移液模块ADP稳定可靠的移液操作平台 高磁通量的磁珠分离转移，磁珠回收率高 采用磁棒旋转式混匀技术，保证磁珠悬浮充分，避免震荡混匀方式对核酸结构的破坏，提取核酸的纯度更高，效果更好，保证核酸的纯度和完整性，降低气溶胶的风险 全中文系统，可根据试剂的要求，利用程序编辑功能，灵活

19、、高效地编辑实验程序 有效的污染控制：全封闭设计，具有空气过滤系统和紫外消毒模块；样本核酸提取和加样过程分为两个区域，具有优化的桌面模块布局和工作流向联合国际相关行业知名品牌共同打造，全自动移液工作站提供商Tecan公司进口核心组件稳定可靠AFD9600实时荧光扩增仪 6区域独立控温，具备定量分析、熔解度分析等常用功能 先进的光纤光学及高性能低温CCD成像分析，具备5通道(最多8个)组合检测，并具有多重校准功能 96孔荧光同时检测，无时间差，实现高速、高灵敏度、多通道检测 中文操作界面，方便人机交流 OFFICE 2007界面风格,与用户操作习惯一致 自带数据库，具有LIS系统接口功能 自定义

20、报告打印功能达安血筛系统的日常工作流程标本采集(Elisa初筛)标本加样核酸提取核酸扩增结果确认标本采集采血管要求： 带分离胶 无菌真空采血管 EDTAK2抗凝初次离心： 采集后在采集现场4小时内离心 离心模式： 1600g-2000g,20min标本保存： 28，48小时内进入核酸检测建议剔除酶免阳性的标本DA3500标本加样和核酸提取 依次开启仪器和电脑的电源 按照要求，将耗材（TIP头、 8连PCR管、离心管、吸头丢弃套）和试剂放置于平台相应位置 将挑出的核酸标本管在全自动开盖机进行开盖或手动开盖 将待测标本和质控品装载到专用16孔样品架上 采血管上条形码一律面向左，面向条码扫描器，以方

21、便扫描条码DA3500标本加样和核酸提取 启动核酸提取实验的软件操作（包括加载扫描条码、加载Protocol、样本排版、枪头选择等一系列操作）。 匀速载入样本架，仪器同时自动进行条码扫描，输入当日标本数并编辑相应的条码信息 输入实验ID、实验类型等信息，进行标本排版（标识标本和质控品的位置） 选择需要加载的程序文件DA3500标本加样和核酸提取 进行提取板和扩增板的位置确认 进行试剂和枪头数量和位置的确认 确认后进入运行界面，进行标本加样、核酸提取和纯化、PCR体系建立步骤 结束后进入DA3500报告界面导出加样信息报告AFD9600核酸扩增检测 打开控制电脑及AFD9600型PCR扩增仪的电

22、源； 打开AFD9600软件 ,点击软件界面左上角图标， 新建实验； 输入实验ID号后，选择程序模板文件，并勾选导入样本参数设置； 将制备好的PCR扩增八连管按顺序依次放入PCR仪的扩增孔中； 确认后点击开始按钮进入运行界面； 结束后分析当日实验结果，分析合格后进入报告界面导出扩增结果报告。扩增检测与结果分析方案 HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA分别在不同的反应孔内扩增，实验结束直接给出各项目的检测结果。 HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA的扩增程序一致，可以在同一台荧光PCR仪上同时进行扩增。 内对照参与扩增，其扩增信号提示实验是否正确，避免假阴性。 各项目的扩增曲

23、线直观反映扩增结果。扩增检测与结果分析方案 实验结束后，应对整体检测结果进行分析： 包括阴性对照、 阳性对照、 室内质控结果是否正常； IC是否有效（对于PCR检测体系， IC应在一定的CT值范围内）。在此基础上观察被检测的特定待测物的有反应、无反应、有效、无效或可疑结果。对于可疑或无效结果按照检测程序，核对实验样本位置及编号重新进行检测。 PCR检测原理的检测体系： 观察整体扩增曲线，阈值设定是否合理。分析每个检测的扩增曲线，阴性应在于直线下无起跳，阳性（包括室内质控和内对照）呈典型的“S”扩增曲线。对于判定界值后出现的的特异扩增曲线或非特异扩增的曲线，应分析原因，必要时对该样本重新进行检测

24、。扩增检测与结果分析方案 质控品结果 内标（CT值在正常范围内） 阴性对照阴性（CT无数值） 阳性对照阳性（CT40） 室内质控品阳性（CT值进行质控图分析） 项目结果 测定CT值无数值，并且内标CT40的标本为阴性。 测定CT值40的标本为阳性标本。 测定CT值在4045之间的标本为灰区标本，建议复测或随访，并以复测结果为准。扩增检测结果报告 结果报告应包含或可追溯以下内容： 样本的唯一标识； 原始样本采集日期和时间，实验室接收样本的时间； 检测时间，结果发布时间； 检测系统名称，试剂的名称和批号； 内对照、阴阳性对照和室内质控信息； 在检测结果不被接受时，应有原因分析； 如果所收到的原始样

25、本质量不适于检测或可能影响检验结果，应在报告中说明。DA3500的日常维护和保养-日维护保养工作 为保持本仪器的最佳工作状态并且安全使用，一定要每日做维护保养， 按下列步骤进行每日维护工作，并记录维护项目。 日常清洁消毒日常清洁消毒：每次实验工作完毕后，先关闭仪器总电源。 1、回收标本管，加盖后置于2-8暂存； 2、回收吸头，清理吸头废弃套、离心管、提取板等实验耗材； 3、目视检查仪器各模块的轨道是否有异物，如有则需进行清理； 4、用乙醇(75%)打湿无尘布后，擦拭仪器工作台面；先里后外、先难后易； 5、用清水擦拭仪器的外表面，并使之风干； 注意事项：不要使用酒精等有机溶剂喷射仪器表面/移液通

26、道进行消毒。 DA3500的日常维护和保养-日维护保养工作 清理清理废料废料桶桶 清理废料桶的步骤： 1、清理废料桶，可将废弃耗材装入垃圾袋一起进行危废处理； 2、更换专用垃圾袋，放置好废料桶，确保废弃孔位于废料桶正上方； 紫紫外灯消毒：外灯消毒：每天日常清洁消毒完毕后 打开仪器紫外灯开关，照射1小时。 注意：严禁紫外灯开启期间，打开仪器外门。注意：严禁紫外灯开启期间，打开仪器外门。DA3500的日常维护和保养-周维护保养工作 每周维护：每周维护： 1、清洁废料废料桶桶； 2、用清水清洗废料桶的内壁。必要时，可用消毒剂对废料桶进行浸泡； 3、用干净纱布将废液桶外部上的水珠擦干； 4、放置好废料

27、桶，确保吸废弃孔位于废料桶正上方； 5、打开仪器门，用清水擦洗工作台面仪器内壁； 6、用清水擦洗仪器两侧外壳及仪器后板。 注意注意：清洗前废料桶时需做好防预措施，戴好手套、穿上工作服，必要时戴上防护眼镜并小心操作清洗前废料桶时需做好防预措施，戴好手套、穿上工作服，必要时戴上防护眼镜并小心操作以防感染。以防感染。DA3500的日常维护和保养-周期性维护保养工作 周期性维护：周期性维护：建议由厂商进行操作。 每半年进行轨道和齿轮润滑维护； 每半年定期维护加样枪； 每年由厂家进行加样、移液校正维护。注：搬动过仪器或更换过位移部件需要进行重新校正。AFD9600的日常维护和保养每每周周维护任务维护任务 归档或备份反应板文件； 使用无纺布蘸中性清洁剂对外壳进行了清洁； 清洁时注意不能使液体进入到仪器内部。 每月维护任务：每月维护任务： 执行计算机硬盘碎片整理程序每每半年半年维护任务维