实时荧光定量PCR法检测人骨肉瘤耐MTX细胞系中RFC、DHFR、GSTπ的mRNA表达

1、实时荧光定量PCR法检测人骨肉瘤耐MTX细胞系中RFC、DHFR、GST-的mRNA表达【摘要】 目的研究RFC(还原叶酸载体)、GST-（谷胱甘肽S转移酶）、DHFR（二氢叶酸还原酶） mRNA在人骨肉瘤U2-OS细胞系及人骨肉瘤耐药细胞系U2-OS/R1-R3中的表达差异，并探讨其在人骨肉瘤MTX化疗耐药中的意义。方法采用冲击并逐步增加诱导药物浓度诱导的方法，诱导人骨肉瘤细胞系U2-OS，并建立耐MTX细胞系（U2-OS/R1-R3），利用荧光定量PCR技术在mRNA 水平检测RFC、GST-、DHFR在U2-OS及（U2-OS/R1-R3）中的表达。结果本试验成功建立三株人骨肉瘤耐药细胞

2、系U2-OS/R1-R3中，荧光定量PCR结果显示MTX耐药与DHFRmRNA表达增加有关，与RFCmRNA的表达降低有关，与 GST-mRNA的表达增加有关。结论本试验在基因水平探讨人骨肉瘤细胞MTX化疗耐药机制， DHFR、GST-基因表达的增加及RFC基因表达的降低参与了人骨肉瘤细胞的MTX耐药，为临床探索骨肉瘤患者的MTX耐药机制提供了重要的依据，为临床筛选MTX化疗不敏感患者提供重要的依据。 【关键词】 实时荧光定量PCR； 甲氨喋呤（MTX） 还原叶酸载体（RFC）； 二氢叶酸还原酶（DHFR）； 谷胱甘肽S转移酶（GST-） Abstract: ObjectiveTo study

3、 the difference in expression of RFC, GST-, DHFRmRNA between human osteosarcoma U2-OS cell line and the MTX-resisitant variants U2-OS/R1-R3, and to investigate the significance in MTX resistance for human osteosarcoma. MethodsThree resistant MTX human osteosarcoma cell lines were established by puls

4、e exposure parental cell line(U2-OS) in gradually increased dose of MTX . The expression of RFC，GST-2 / 17，DHFRmRNA were assayed by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction(FQ-PCR).ResultsThree MTX-resistant variants(U2-OS/R1-R3) were successfully established , the results of th

5、e FQ-PCR revealed that the MTX resistance was associated with the decreased expression of the RFC mRNA and increased expression of DHFR mRNA and GST- mRNA.ConclusionThe author investigated the MTX resistant mechanism of human osteosarcoma cell line at a gene level. The decreased expression of RFC mR

6、NA and the increased expression of DHFR mRNA and GST- mRNA participate in the MTX resistance in human osteosarcoma cell lines U-2 OS. This provides the evidence for exploring the MTX resistance mechanism in clinical osteosarcoma patients ,and helps to screen the patients who are insensitive to MTX c

7、hemotherapy. Key words：real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction(FQ-PCR); methotrexate(MTX); reduced folate carrier（RFC）; dihydrofolate reductase(DHFR)； Glutathione-S-Transferases-（GST-） 随着新辅助化疗在骨肉瘤治疗中的应用及发展，骨肉瘤的5年生存率已由以前的10%20%提高到现在的60%70%。氨甲喋呤（MTX）作为新辅助化疗的主要药物，其在临床实践中存在原发或继发耐药而

8、影响疗效的现象。以往研究表明，多种基因及表达产物可能参与其耐药机制。作者运用实时荧光定量PCR法，检测还原叶酸载体（RFC），二氢叶酸还原酶（DHFR），谷胱甘肽-S-转移酶-（GST-）在人骨肉瘤细胞株U2-OS及耐药细胞株U2-OS/R1-R3中基因水平的表达，为临床预测骨肉瘤的耐药程度，筛选化疗不敏感患者提供参考和依据。 1 材料与方法 1.1 材料 人骨肉瘤细胞株U2-OS（购自中国科学院上海生物细胞研究所），氨甲喋呤（MTX）（浙江海正药业公司）、MTT、DMSO（sigma产品），酶标仪(sigma960型)、荧光定量PCR试剂盒（Takara 公司）、RFC、GST-、DHFR、

9、GAPDH引物及Taqman探针（上海生工生物工程公司）。 1.2 方法与步骤 1.2.1 人骨肉瘤U2-OS细胞株培养于含10%胎牛血清、100 Uml青霉素、100 g/ml链霉素的RMPI 1640培养基中。细胞置于37、5%CO2细胞培养箱内培养。待细胞增殖至60%70%融合状态时进行传代。加入0.25%胰蛋白酶2 ml，37消化45 min，显微镜下见细胞收缩、细胞间隙变大，形态变圆后加入完全培养液终止消化，用吸管反复吹打培养瓶底贴壁细胞成细胞悬液，按12比例接种于培养瓶中。 1.2.2 采用冲击并逐步增加诱导药物浓度诱导的诱导方法。待细胞增殖至铺满培养瓶底60%70%对数期时，加入

10、起始浓度为50 ngml的MTX,作用24 h后用37的1×PBS缓冲液冲洗2次，加入不含药物的RPMI 1640培养液，每天换液1次，以清除死亡细胞及细胞碎片，到细胞增殖至正常状态后，重复上述药物冲击过程，每一种药物浓度冲击3次。MTX药物递增浓度为30 ngml、300 ngml、1 gml、3 gml。耐药诱导历时7个月，选用300 ng/ml(0.66 mol/L)，1 gml(2.20 mol/L)，3 gml(6.60 mol/L)组细胞株(分别命名为U2-OSR1，U2-OSR2,U2-OSR3)与原代细胞株作对比试验。 1.2.3 生物学特性观察，倒置显微镜下观察U2

11、-OS，U2-OSR1,U2-OSR2,U2-OSR3细胞株的细胞形态。 1.2.4 生长曲线测定，取对数生长期的U2-OS，U2-OSR1,U2-OSR2,U2-OSR3细胞株接种于24孔板，每孔细胞数为1×104个。每个细胞株间隔24 h取3个复孔用苔盼兰染色，计数其中活细胞的数量，连续计数7 d。按每天细胞计数数量绘制细胞生长曲线。 1.2.5 FQ-PCR法检测mRNA表达：RNA fast 200总RNA极速抽提试剂盒一步法提取各细胞株总RNA。逆转录试剂采用TaKaRa公司试剂盒（code:DDR037S），检测模板质量。荧光定量PCR试剂采用TaKaRa公司试剂盒（co

12、de:DDR039S）。RFC，DHFR，GST-，GAPDH引物和探针均由上海生工生物工程公司合成，其基因序列见表1。Real-Time PCR反应体系20 l,含Premix Ex TaqTM(2×)10 l，RFC，DHFR，GST-，GAPDH上、下游引物各0.7 l(浓度为6 mol/L),Taqman探针各0.8 l(浓度为4 mol/L),ROX Reference Dye(50×)0.4 l,模板（cDNA溶液）2 l(相当于总RNA 100 ng),RNase free去离子水5.4 l。反应仪器为ABI PRISM 7 500实时检测扩增仪。反应条件：预

13、变性，95 10 s 1个循环；PCR反应，95 5 s 60 45 s 40个循环。以SDS软件分析循环次数（Ct值），mRNA表达以Ct值表示。Ct=RFC或DHFR 或GST-孔Ct值-GAPDH孔Ct值。每份标本各种基因的表达量均用其对应的GAPDH基因的量进行校正。目的基因的拷贝数计算公式:目的基因拷贝数2-Ct 法=（Ct目的基因 Ct内参基因）试验组（Ct目的基因 Ct内参基因）对照组表1 RFC、DHFR、GST-、GAPDH上下游引物及Taqman探针基因序列RFC上游引物5-CGCCACCTTTCAGATTGCAT-320bp下游引物5-CACGTCCGAGACAATGAA

14、AGTG-322bp探针序列5-(FAM)TCAACACGTTCTTTGCCACCATC(TAMRA)-323bpDHFR上游引物5-TGGTTCGCTAAACTGCATCGT-321bp下游引物5-CAGGAATGGAGAACCAGGTCTTC-323bp探针序列5-(FAM)CCAGAACATGGGCATCGGCAAGAA(TAMRA)-324bpGST-上游引物5-CGGGCAAGGATGACTATGTGA-321bp下游引物5-GGGCTAGGACCTCATGGATCA-321bp探针序列5-(FAM)TGTCCCAGAACCAGGGAGGCAAGAC(TAMRA)-325bpGAPD

15、H上游引物5-TCATGGGTGTGAACCATGAGAA-322bp下游引物5-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-321bp探针序列5-(FAM)TCATCAGCAATGCCTCCTGCACCA-(TAMRA)-324bp1.2.6 统计学分析：各数据均以x-±s表示，组间比较采用t检验的方法，以=0.05为检验水准应用SPSS 11.0软件，对所得数据进行处理。 2 结果 2.1 光镜下U2-OS及U2-OS/R1-R3细胞形态(图14) 倒置显微镜下观察：U-2OS、U-2OS/R1 U-2OS/R2、U-2OS/R3细胞均为贴壁生长，U-2OS细胞呈梭形，排列规则，

16、体积中等，大小均匀，细胞核较大，胞浆较少（见图1）。U-2OS/R1、U-2OS/R2、U-2OS/R3细胞形状不规则，多为多角形，大小不均匀。胞浆明显增大（见图24），出现多核仁现象（见图2）。 2.2 生长曲线 系列1为原代U2-OS细胞，系列2、3、4分别为U2-OSR1,U2-OSR2,U2-OSR3细胞。 以细胞培养时间为横轴，每次细胞计数的平均数为纵轴，绘制生长曲线。各细胞株细胞在相同的条件下培养7 d，在细胞培养的第4 d开始产生明显差异。各耐药细胞株细胞增殖速度较原代细胞减慢，生长斜率减小。表明各耐药细胞株细胞较原代细胞的倍增时间延长。但各耐药细胞株细胞增殖能力表现相似。说明氨

17、甲喋呤对肿瘤细胞的生长具有明显的抑制作用。 2.3 采用2-Ct 法比较各模板中目的基因（RFC mRNA， DHFR mRNA，GST-mRNA）的相对含量。人骨肉瘤耐药细胞系U2-OS/R1-R3中RFC mRNA的表达为原代U2-OS的0.7 139、0.6 258、0.4 908倍（组间差别有统计学意义，P0.05）；U2-OS/R1-R3DHFR mRNA的表达为原代U2-OS的5.3 145、12.8 937、30.6 501倍（组间差别有统计学意义，P0.05）；U2-OS/R1-R3中GST-mRNA的表达为原代U2-OS的1.9 081、3.5 420、4、8 319倍（组间

18、差别有统计学意义，P<0.05）.图6为荧光定量PCR扩增曲线。 图1光镜下U-2OS细胞（×200） 图2光镜下U-2OS/R1细胞（×200） 图3光镜下U-2OS/R2细胞（×200） 图4光镜下U-2OS/R3细胞（×200） 图5U2-OS及U2-OS/R1-R3生长曲线 图6各细胞株RFC DHFR GST-mRNA的表达荧光定量PCR扩增曲线3 讨论 对骨肉瘤患者预后影响因素的探讨一直是临床医师关注的问题。郭全义，卢世璧，张莉等1统计分析骨肉瘤患者84例，认为接受化疗是影响患者预后的主要因素。MTX作为最早公认的对骨肉瘤化疗有

19、效的药物，其化疗耐药是造成临床骨肉瘤患者预后不良的主要因素。关于骨肉瘤的MTX耐药的机制仍然没有完全阐明。本试验通过构建人骨肉瘤耐药细胞株，模拟临床骨肉瘤患者MTX化疗耐药过程，对骨肉瘤耐药机制进行探索，筛选MTX化疗耐药指标，为进一步的基因转染治疗提供体外试验模型。 还原叶酸载体（RFC）又称RFC-1、FOLT、RFT-1或SLC19A1等2，人类RFC是一个包含591个氨基酸的完整膜蛋白，分子量为6.4 487万，有12个典型跨膜区的运输蛋白。Moscow等3分析报道RFC基因突变导致的RFC氨基酸序列和数量的改变使RFC的各个跨膜区发生相应的改变，从而影响载体的活性和功能。RFC介导的

20、MTX跨膜运输是MTX进入肿瘤细胞的主要途径，即MTX的表达主要取决于RFC表达和功能活性。Massimo Serra等4研究发现在人骨肉瘤MTX耐药细胞株中RFC基因表达较原代细胞株RFC基因表达降低。本试验结果示耐药细胞株中RFC基因表达随耐药性增加而逐渐减少，结果与上相似。 二氢叶酸还原酶（DHFR）是单体酶，在辅酶NADPH的参与下形成F-DHFR-NADPH三元复合物，并将叶酸转换为体内DNA、RNA 以及蛋白质生物合成所必需的原料，因而该酶对于生物体的新陈代谢具有极为重要的作用 。当MTX 取代叶酸后，它与酶形成MTX-DHFRNADPH三元复合物，就可以抑制核酸和蛋白质的合成 ，

21、且MTX是二氢叶酸还原酶的天然底物，它与DHFR酶的亲和力比叶酸高105倍左右，因此MTX的抗肿瘤作用强而持久。本研究结果显示在人骨肉瘤MTX耐药细胞株中DHFR基因表达较原代细胞株DHFR基因表达升高，且随细胞耐药性的增加，DHFR基因的表达亦增加。本试验结果与Scionti I5结果一致。 谷胱甘肽S转移酶（GST）是一组具有多种生理功能的二聚体蛋白质。谷胱甘肽S转移酶（GST）主要分布于人和动物的肝细胞浆中，分为、和。其中GST-被认为是多种肿瘤的标志物6。GST-是通过水解GSH与疏水性或亲电性复合物之间的连接而起细胞内的解毒作用，成为肿瘤耐药的因素之一。目前有观点7认为化疗药物不能诱

22、导GST-的表达，GST-的过表达可能是恶性细胞的表型特性，提示化疗与GST-的表达可能不存在相关性，本研究结果不支持以上观点。国内魏玲、宋现让等8收集临床标本34例，研究发现骨肉瘤患者化疗可引起GST-上调。与本试验结果部分相同。 本试验采用实时荧光定量PCR技术，它具有探针杂交的高度特异性并结合PCR技术的高效核酸扩增、光化学技术的敏感及易定量等优点，从扩增到结果分析均在PCR反应管封闭状态下进行，解决了PCR产物污染而导致假阳性的问题，同时也提高了灵敏度，其结果用拷贝数来表示，这种绝对数量更为准确，易于统一标准，便于不同试验室之间进行比较 9。本试验采用实时荧光定量PCR法，定量检测了R

23、FC、GST-、DHFR mRNA在人骨肉瘤细胞系及耐MTX细胞系中的表达，表明RFC、GST-、DHFR参与了人骨肉瘤细胞MTX耐药机制的形成，为临床药物的研发提供了新的靶点。 临床骨肉瘤患者MTX化疗的耐药可能受到年龄、性别、生活习惯、病理类型等诸多临床因素的影响，本试验通过体外建立骨肉瘤细胞耐MTX模型，提示临床骨肉瘤耐MTX患者可能存在RFC、DHFR、GST-基因表达的变化，研究RFC、DHFR、GST-基因表达的变化，对于推断临床骨肉瘤患者MTX化疗可能的耐药机制有重要的指导作用。在临床工作中对骨肉瘤患者进行检测RFC、DHFR、GST-在基因或蛋白水平的表达，有助于筛选MTX化疗

24、不敏感患者并对下一步的基因治疗提供重要依据。但由于骨肉瘤细胞体外培养并不能完全模拟骨肉瘤在人体内的生长，故本实验结论尚待进一步临床验证。【参考文献】 1 郭全义，卢世璧，张莉等.骨肉瘤的治疗及生存率的多因素分析J.中国矫形外科杂志，2006，7：497-499.2 邓高荣,李书忠.还原性叶酸载体与骨肉瘤甲氨蝶呤化疗J.国外医学:骨科学分册, 2005,3:150-152.3 Moscow JA.Methotrexate transport and resistanceJ.Leuk Lymphoma，1998，3:215-224.4 Serra M.Analysis of dihydrofolate reductase and reduced folate