第2章 微生物发酵制药工艺

1、第第2章章 微生物发酵制药工艺微生物发酵制药工艺本章内容2.1 微生物发酵与制药2.2 制药微生物生长特征2.3 制药微生物菌种的建立2.4 培养基制备2.5 灭菌工艺2.6 微生物发酵培养技术2.7 发酵工艺过程的控制2.8 抗生素生产工艺2.9 氨基酸发酵生产工艺2.10 维生素生产工艺2.1 微生物发酵与制药v发酵v发酵制药v发酵制药的基本过程1 发酵概念v发酵概念：通过微生物培养而获得产物的过程。v发酵种类：用产品说明，冠以产物名而成，如青霉素发酵，维生素发酵；发酵工程按需氧分为好氧发酵和厌氧发酵。 v初级代谢产物：在初级代谢过程中形成的产物，包括各种小分子前体、单体和多糖、蛋白质、脂

2、肪、核酸等。生长所必须的。几乎所有生物初级代谢基本相同。氨基酸，核苷酸，有机酸。v次级代谢产物：比较复杂的化合物，不是细胞生长必需的，对生命活动有意义（抗逆境条件）。抗生素，毒素，色素。2、发酵制药概念v利用制药微生物的生长繁殖，通过发酵，代谢合成药物，然后从中分离提取、精制纯化，获得药品的过程抗生素的发现 v1928年，英国细菌学家Fleming B发现抗菌物质青霉素。在20世纪40年代，一共发现了14种抗生素，50年代发现了20余种，60年代开始了化学结构改造的合成和半合成抗生素阶段。目前发现并分离到约9000种抗生素，半合成抗生素约1000种，共万种以上。但实际生产和应用的只有100余种

3、。发酵制药种类微生物菌体发酵微生物菌体发酵是以获得微生物菌体为目的，如：面包的酵母发酵、单细胞蛋白发酵（利用各种碳源）、真菌类（各种蘑菇、冬虫夏草）、生物防治剂（苏云金杆菌，伴孢晶体可以毒杀鳞翅目、双翅目害虫）。微生物酶发酵微生物酶发酵是以获得酶为目的的发酵，如青霉素酰化酶，用于半合成青霉素时，制备中间体6氨基青霉烷酸。微生物代谢产物发酵初级代谢产物：氨基酸，核苷酸，维生素，有机酸。次级代谢产物：最主要的是抗生素。微生物转化发酵利用微生物的一种或多种酶把一种化合物转变为结构相关的更有价值的产物的生化反应为转化发酵。 制药微生物的种类 v生产药物的天然微生物主要包括细菌、放线菌和丝状真菌三大类。

4、v细菌主要生产环状或链状多肽类抗生素，如芽孢杆菌(Bacillus)产生杆菌肽（bacitracin），多黏芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）产生黏菌肽（colistin）和多黏菌素（polymyxin）。细菌还可以产生氨基酸和维生素，如黄色短杆菌（Brevibacterium flarum）产生谷氨酸，大小菌生产维生素C。v放线菌主要产生各类抗生素，以链霉菌属最多，诺卡菌属较少，还有小单孢菌属。生产的抗生素主要有氨基糖苷类（链霉素、新霉素、卡那霉素等）、四环类（四环素、金霉素、土霉素等）、放线菌素类（放线菌素D）大环内酯类（红霉素、螺旋霉素、柱晶白霉素）和多烯大环内酯类（制霉菌素

5、、抗滴虫霉素等）。酸性、碱性和中性，但以碱性为多。v真菌的曲菌属产生桔霉素，青霉素菌属产生青霉素和灰黄霉素等，头孢菌属产生头孢霉素等。脂环芳香类或简单的氧杂环类，多为酸性化合物。 3发酵制药的基本过程 菌种选育发酵工段提炼工段成品工段孢子制备种子制备发酵控制预处理分离提取浓缩纯化成品工段包装原料药实验室、种子库发酵车间提炼车间包装车间2.2 微生物的生长特征微生物发酵基本过程特征（批式）菌体生长与产物生成的特征，三个阶段v发酵前期(fermentation prophase)v菌体生长期（cellv发酵中期(fermentation metaphase)v产物合成（生产）期(product s

6、ynthesis phase) growth phase）v发酵后期(fermentation anaphase)v菌体自溶期(cell autolysis phase)发酵前期特征v从接种至菌体达到一定临界浓度的时间，包括延滞期、对数生长期和减速期。v代谢特征：碳源、氮源等基质不断消耗，减少v生长特征：菌体不断地生长和繁殖，生物量增加。v溶氧变化：不断下降，菌体临界值时，浓度最低。vpH变化：先升后降先氨基酸作为碳源，释放出氨，而后氨被利用。先降后升先用糖作为碳源，释放出丙酮酸等有机酸，后又被利用。几个概念v1 延迟期延滞期（lag phase）或适应期是指接种后，菌体的生物量没有明显增加的

7、一段时间。延迟期是菌体适应环境的过程。延迟期时间长短不一，与遗传和环境因素有关，由菌体与环境相互作用的程度决定的。因不同接种量、不同菌种和菌龄等而表现不同。工业上希望延迟期越短越好，常采用如种子罐与发酵罐培养基尽量接近，对数期的菌体作为种子、加大接种量等方法进行放大培养和发酵生产。v2 对数生长期对数生长期（log phase）是菌体快速繁殖，生物量的增加呈现对数速度增长的过程。特点是生长速率达到最大值，并保持不变。细胞的化学组成与生理学性质稳定。菌体生长不受限制，细胞分裂繁殖和代谢极其旺盛。可以认为细胞组分恒定，菌体细胞的生长速率与生物量是一级动力学关系v3 减速期减速期(decline p

8、hase)是指菌体生长速率下降的一段时间。由培养基中基质浓度下降，有害物质积累等不利因素引起。在减速期内，生长速率与菌体浓度仍符合一级动力学关系，但受基质浓度限制。一般生物的减速期较短。发酵中期特征v以次级代谢产物或目标产物的生物合成为主的一段时间。v菌体生长恒定就进入产物合成阶段v呼吸强度：无明显变化，不增加菌体数目v产物量：逐渐增加，生产速率加快，直至最大高峰，随后合成能力衰退。v对外界变化敏感：容易影响代谢过程，从而影响整个发酵进程。发酵后期特征v菌体衰老，细胞开始自溶的一段时间v合成产物能力衰退，生产速率减慢。v氨基氮含有增加，pH上升v发酵必须结束，否则产物被破坏v菌体自溶给过滤和提

9、取等带来困难。v自溶作用（autolysis） 自溶作用是细胞的自我毁灭（cellular self-destruction），速溶酶体将酶释放出来将自身细胞降解。在正常情况下，溶酶体的膜是十分稳定的，不会对细胞自身造成伤害。 如果细胞受到严重损伤，造成溶酶体破裂，那么细胞就会在溶酶体酶的作用下被降解，如某些红细胞常会有这种情况发生。 在多细胞生物的发育过程中，自溶对于形态建成具有重要作用。 生长与产物的关系模型v从菌体生长、能源利用和产物生成速度的变化及其之间的动力学关系出发，Gaden把发酵过程分为三种模型。 vI型：菌体生长与产物生成偶联型(coupling model)。菌体的生长与产

10、物生成直接关联，生长期与生产期是一致的。产物往往是初级代谢的直接产物，菌体生长、糖的分解代谢、能源利用和产物形成几乎平行，生长期与生产期是一致的，菌体生长期和产物形成不是分开的。细胞生长、基质消耗、能源利用和产物生成动力学曲线几乎平行，变化趋势同步，都有最大值，出现的时间接近。组成型表达的基因工程菌的产物生成属于此类型，蛋白质产物是细胞能量代谢的结果。乳酸、醋酸等初级分解代谢产物的生成也属于此类型。所以产物生成速率和比速率分别为：vII型：菌体生长与产物生成半偶联型（semi-coupling model）。该模型介于偶联和非偶联模型之间，产物生成与基质消耗、能量利用之间存在间接关系。产物来自

11、能量代谢所用的基质，但是在次级代谢与初级代谢分开的。在细胞生长期内，基本无产物生成，在生长的中后期生成大量的产物而进入产物形成期。分批发酵出现两个高峰，先是基质消耗和菌体生长的高峰，然后是产物形成的高峰。如柠檬酸和某些氨基酸的发酵，一部分组成型表达的蛋白质药物也属于此类型。产物生成速率和比速率分别为： ； vIII型：菌体生长与产物生成非偶联型（non-coupling model）。菌体生长期与产物生成期为独立的两个阶段，先形成物质消耗和菌体生长高峰，几乎没有或很少有产物生成，然后进入菌体生长静止期，产物大量生成，并出现产物高峰。产物可能来自于中间代谢途径，而不是分解代谢过程，物质消耗和菌体

12、生长之后，菌体利用中间代谢途径，初级代谢与产物形成是完全分开的，如抗生素、生物碱、微生物毒素的发酵。对于诱导型基因工程菌，往往在静止期，加入诱导物，基因转录和产物表达，所以产物生成速率和比速率分别为：代谢产物的生物合成 v代谢（metabolism）是生物体内进行的生理生化反应的统称。代谢分为分解代谢(catabolism)和合成代谢(anabolism)，前者是指把大分子降解为小分子的过程，为合成代谢提供能量和原料；而后者是指把小分子合成为复杂大分子的过程，满足细胞生长和分化的需要。初级代谢是营养物质转变为细胞结构物质和对细胞具有生理活性作用的物质，为细胞提供能量、合成中间体及其生物大分子的

13、代谢网络。在初级代谢过程中形成的产物为初级代谢产物（primary metabolite），包括各种小分子前体、单体和多糖、蛋白质、脂肪、核酸等。几乎所有生物的初级代谢基本相同。次级代谢存在于某些生物中，并在一定时期表达。次级代谢对正常的生长可能不必要，但对抵抗逆境、分解毒素、生殖等具有重要意义。 次级代谢产物生物合成的基本特征 v（1）次级代谢产物种类繁多，结构特殊，含有不常见的化合物和化学键。如氨基糖、苯醌、香豆素、环氧化合物、生物碱、内酯、核苷、杂环等基团，聚乙烯不饱和键、大环、环肽等键。 v（2）具有种属特异性，与种属分类学无关。分类学上相同的菌种能产生不同结构的抗生素，如灰色链霉菌既

14、可以产生氨基环醇类抗生素，又可以产生大环内酯类抗生素。分类学上不同的菌种能产生相同结构的抗生素，如霉菌和链霉菌均可产生头孢菌素C。一种微生物的不同菌株产生结构不同的多种次级代谢物，而同一菌株会产生一组结构类似的化合物。 v（3）生长期转向生产期，形态与生理发生变化。次级代谢产物是在细胞生长后期开始形成，当生长受限制时被启动。完成菌体营养生长期（trophophase）之后，出现次级代谢物合成期（idiophase），其生物合成比生长对环境更敏感，要求更高。次级代谢产物是以初级代谢产物为前体，受到初级代谢的调节。可能是缺乏某种营养成分，菌体生长抑制，启动了次级代谢物合成。菌体内中间代谢物积累，抑

15、制了初级代谢酶，使之消失或活性下降，诱导了新酶的出现，转入生产期。芽孢杆菌形成芽孢，放线菌和真菌形成孢子，抗生素合成可能是细胞分化的伴随现象。 v（4）次级代谢产物是结构相似的一组混合物，但活性差异较大。参与反应的酶的底物特异性不强。产生菌利用一种或两种以上的初级代谢产物合成一种主要的次级代谢产物，并继续对该产物进行修饰生成多种衍生物。一种次级代谢产物可由两种或两种以上代谢途径合成。 v（5）次级代谢产物的合成受多基因控制。往往以基因簇形式存在。除染色体外，还有细胞质遗传物质，可能存在于质粒、线粒体基因。遗传物质的变异和丢失是导致菌种退化和生产不稳定的重要因素，所以具有代谢不稳定性。次级代谢产

16、物的构建单位 v微生物合成的次级代谢产物是由微生物代谢产生的一些中间产物，如由碳水化合物降解生成的五碳（C5）、四碳（C4）、三碳（C3）、二碳（C2）化合物和初级代谢产物合成。把构成次级代谢产物的基本结构单位称为生源（biogen）。生源直接或间接来源于次级代谢过程的中间产物或初级代谢产物。构建单位包括聚酮体、甲羟戊酸、糖类、不常见的氨基酸（如D氨基酸、氨基酸等）、环多醇和氨基环多醇等。次级代谢产物的生物合成的基本过程v次级代谢产物的合成基本过程包括构建单位的聚合再修饰装配。在此过程中，次级代谢产物的累积受合成途径中某些酶活性的限制，这些关键酶活性大小与产量正相关。 （1）前体聚合v微生物合

17、成生源后，通过缩合反应形成聚酮体、寡肽、聚乙烯等。各种聚酮体的合成过程相似，只是起始单位和延长单位不同。聚酮体是26个二碳单位的聚合反应的结果，酮基被保留，或只是还原为羟基。聚酮体可直接形成环，如四环素类和大环内酯类。进而被修饰，与相应基团如氨基糖、糖胺等结合，形成结构和生理活性不同的化合物。乙酰CoA羧化形成丙二酰CoA，再与8个丙二酰单位缩合形成9酮化合物，再转化为中间体三环化合物。甲基化、还原、脱水、加氢、氧化形成4氧脱水四环素，加氯形成4氧脱水氯四环素，转氨形成4氨基脱水氯四环素，再甲基化形成脱水氯四环素，脱氢氯四环素，最后形成氯四环素。大环内酯是24碳单位缩合而成。氨基酸的聚合有三种

18、形式：氨基酸活化成磷酸酯，再被酶催化缩合，如谷胱甘肽；蛋白质的核糖体模板合成途径；多酶复合物将氨基酸活化后，按硫模板或非核糖体机理缩合，形成肽链。氨基酸与ATP反应，在羧基上形成腺苷单磷酸酯被激活。氨基酸被转移到酶的巯基上，形成硫酯键。硫酯键断裂，提高能量，使2个氨基酸之间形成肽键（羧基与氨基结合）。依次，形成多肽链。如短杆菌肽S是由2条5肽首尾连接而成。 （2）结构修饰 v包括糖基化、酰基化、甲基化、羟基化、氨基化、氧化还原等，使抗生素产生了共存的系列类似物。在聚酮体链延长的过程中，伴随许多基团的化学修饰，如引入氧、氯原子、甲基等，再以糖苷键与糖类物质连接，酰胺键与氨基酸连接，形成各种抗生素

19、。如四环素类，先形成聚酮体，在C7位发生氯化则是金霉素，在C5位上先氧化后还原则是土霉素。 （3）装配 v合成各个组分后，需要按一定顺序在特异酶作用下组装，才能形成有活性的药物。 2.3 制药微生物菌种的建立v发酵生产药物，需产量高的菌种，自然界中的菌种趋向于快速生长和繁殖，而发酵工业需要大量积累产物，因此菌种选育很重要。常规方法是利用天然变异，从中选择优良株系。随后物理因子（紫外线、X射线、中子、激光等）和化学因子（烷化剂、碱基类似物等）和生物因子（噬菌体、抗生素）诱变育种。20世纪80年代，以原生质体融合的杂交育种和基因工程育种，90年代以后，可以用基因组shuffling育种。新药生产菌

20、的选育 v自然分离 v自然选育 v诱变育种 v杂交育种 v基因工程技术育种 微生物药物与菌种的筛选流程v样品采集 微生物分离 培养v 筛选方法学建立 筛选鉴定前药新化合物 化合物分离纯化 阳性结果 v 生产出发菌 菌种鉴定与保藏 v 新化合物新药研究与开发1、生产菌的自然分离(1)v来源：大大土土、海水体v样品的采集：80%表层土土（010cm），、海（0100m）v处理：根分离目的和微生物的特性，用物理和化学的方法处理。（1）温度；高温可得到放线菌。（2）SDS酵母膏，CaCO3、NaOH处理，减少细菌，有利于放线菌分离；乙酸乙酯、氯仿、苯处理，除去真菌。 （3）离心、膜过滤1、生产菌的自然

21、分离(2)v培养基：选择适宜的培养基，营养和pH；添加抑制剂。v分离方法：（1）稀释法：无菌水，生理盐水，缓冲液（2）滤膜法：0.22 0.45 m。细菌在膜上，放线菌菌丝可穿透，进入培养基。v培养条件：温度。放线菌：2530，3237，714天至1月；4550，12d 。药物的筛选v琼脂扩散法活性测定：非致病菌为对象，耐药细菌和厌氧菌的抗生素，筛选生物活性物质。HPLC、LCMS等，分析鉴定活性物质。v向筛选v高通量筛选v高内内筛选 从临床有效的抗生素的作用机理和细菌的耐药机理来设计筛选模型，有目的的筛选具有某种作用机理的抗生素。v高通量筛选是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形

22、式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数根，以计算机对实验数根进行分析处理，同一时间对数以千万样品检测，并以相应的数根库支持整体系运转的技术体系。 v所谓高内内筛选是指在保持细胞结构和功能完整性的前提下，同时检测被筛样品对细胞形态、生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号转导各个环节的影响，在单一实验中获取大量相关信息，确定其生物活性和潜在毒性。从技术层面而言，高内内筛选是一种应用高分辨率的荧光数码影像系统，在细胞水平上检测多个指标的多元化、功能性筛选技术，旨在获得被筛样品对细胞产生的多维立体和实时快速的生物效应信息。高内内筛选技术的检测范围包括：点激

23、活、细胞凋亡、分裂指数、蛋白转位、细胞活力、细胞迁移、受体内化、细胞毒性、细胞周期和信号转导等。2、菌种选育自然选育（1）定义：不经过人工诱变处理，：根菌种的自然突变而进行的菌种筛选过程。v应用：（1）菌种的提纯复壮。（2）防止退化，稳定生产水平。1年1次。v过程v菌种 单孢子 平板分离 单菌落测活 优良菌株v效率低, 增产幅度小2、菌种选育诱变育种（2）v定义：人为创造条件（诱变剂处理），使菌种发生变异，筛选优良个体，淘汰劣质个体。v物理类：紫外线，快中子，激光，太空射线。v化学类：碱基类似物，嵌合剂，亚硝酸。v生物类：噬菌体，转座子。v特点：快速，简单，效益大。v缺点：无定向性。诱变育种流

24、程v出发菌种 单孢子悬液 诱变处理 v高产菌株 单菌落初筛 稀释涂板v复筛 稳定性特性 中试放大 投入生产2、菌种选育杂交育种（3）v概念：两个不同基因型的菌株，通过结合或原生质体融合，使遗传物质发生重新组合，从中分离筛选出具有优良性状的新菌株。v特点：有一定的定向性。v种类：v准性生殖v接合v原生质体融合（1）准性生殖育种v概念：准性生殖v范围：放线菌，半半菌菌的真菌v过程v两条菌丝 相互结合 异核体 二倍体 重组单倍体 v产黄青霉：提高青霉素产量 对氟苯丙氨酸v灰黄链霉菌：灰黄霉素产量v v准性生殖是指异核体（单个生物个体中含有两种或两种以上基因型）细胞中两个遗传物质不同地细胞核可以结合成

25、杂合二倍体地细胞核。这种杂合二倍体的细胞核在有丝分裂过程中可以发生染色体和单倍体化,最后形成遗传物质重组的单倍体的过程。也就是不经过减数分裂就能导致基因重组的生殖过程。 （2）接合育种v范围：细菌、放线菌v过程：v两种细胞混合培养 基因片段进入另一细胞 合子 重组单倍体v虽然有成功报导，但多数效果不显著（3）原生质体融合育种v概念v通过生物学、化学或物理学的方法，使两个不同种类的体细胞融合在一起，从而产生具有两个亲本遗传性状的新细胞.v用去壁酶处理将微生物细胞壁除去，制成原生质体，在高渗条件下，用聚乙二醇（PEG）促进原生质体发生融合，再生细胞壁，从而获得异核体或重组子，这一技术叫原生质体融合

26、。 3、菌种保藏v原因：菌种经过多次传代，会发生遗传变异，导致退化，从而丧失生产能力甚至菌株死亡。v目的：保持菌种原有优良特性，延长生命时限，长期存活、不退化。v原理：使菌种代谢处于不活活状态，生长繁殖受抑制的休眠状态。v措：物理和化学方法（温度：低温；水分：干燥；氧气：缺氧；营养；缺乏）保藏方法v低温斜面保藏：低温降低新陈代谢。4，RH70以下。短期保藏，16个月；易变异v石蜡封存：隔绝氧气，减少蒸发。4，约1年。v砂土管保藏：干燥抑制生长。孢子吸附在砂土上，真空抽气干燥。干燥器于冰箱，数年。v冷冻干燥保藏：保护剂降低菌体细胞冰点，减少冰晶对细胞伤害。低温避光，中期保藏，510年。v液氮保藏

27、：培养物与冷冻保护剂混合，密封。液氮（196）罐或80冰箱。低温、缺氧、避光和营养缺乏环境。长期保藏。保藏机构中国v中国典型培养物保藏中心:China Center for Type Culture Collection (CCTCC)。v中国国学学典型培养物保藏藏委会,下设9个库v中国国通微生物菌种保藏管理中心：China General Microbiological Culture Collection Center (CGMCC)，微生物所（真菌和细菌）；武汉所（病毒）v抗生素菌种保藏管理中心（CACC）：中国医学国学学抗生素所，四川抗生素所，华北制药集团抗生素所小结v生产菌的分离：自

28、然分离与筛选v菌种选育：自然选育、杂交育种、诱变育种v菌种保藏：低温、干燥；机构2.4 发酵培养基制备v概念（medium） 供微生物生长繁殖和合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。v培养基的组成和比例是否否当，直接影响微生物的生长、生产和工艺选择、产品质量和产量。2.4.1 培养基的成分v碳源v氮源v无机盐v水v生长因子前体与促进剂v消泡剂1、碳源(carbon sources)v概念：构成微生物细胞和代谢产物中碳素的营养物质。v作用：v为正常生理活动和过程提供能量来源，为细胞物质和代谢产物的合成提供碳骨架。碳源种类v糖类：葡萄糖、淀粉、糊精和糖蜜v脂肪：豆油、棉籽油

29、和猪油v醇类：甘油、乙醇、甘露醇、山梨醇、肌醇v蛋白类：蛋白胨、酵母膏v速效碳源：糖类、有机酸v迟效碳源：酪蛋白水解产生的脂肪酸2、氮源（nitrogen sources）v概念：构成微生物细胞和代谢产物中氮素的营养物质。v作用：为生长和代谢主要提供氮素来源。v种类：无机氮源、有机氮源有机氮源v几乎所有微生物都能利用有机氮源：v黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、蛋白胨、酵母粉、尿素。无机氮源v氨水、铵盐和硝酸盐等。氨盐比硝酸盐更快被利用。v工业应用：主要氮源或辅助氮源；调节pH值v生理酸性物质：代谢后能产生酸性残留物质。 （NH4）2SO4利用后，产生硫酸v生理碱性物质：代谢后能产生碱性残

30、留物质。 硝酸钠利用后，产生氢氧化钠。3、无机盐和微量元素v概念：组成生理活性物质或具有生理调节作用矿物质v作用方式：低浓度起促进作用，高浓度起抑制作用。v种类：盐离子磷、硫、钾、钠、镁、钙，常常添加v铁、锌、铜、钼、钴、锰、氯，一般不加。4、水v菌体细胞的主要成分。v营养传传的介质。v良好导体，调节细胞生长环境温度。v培养基的主要成分之一。5、生长因子（growth factor）v概念：维持微生物生长所必需的微量有机物，不起碳源和氮源作用。v种类：维生素、氨基酸、嘌呤或嘧啶及其衍生物、脂肪酸等。天然成分中含有：一般无需添加。v营养缺陷型菌株：必需添加。6、前体(precursor)v概念：

31、加入到发酵培养基中的某些化合物，被直接结合到目标产物分子中，而自身的结构无多大的变化。v使用：v添加前体是提高抗生素产量的重要措。v多次少量、连续流加的工艺。7、促进剂(accelerant)v概念：v促进产物生成的物质，但不是营养物，也不是前体的一类化合物。v种类：v氯化物有利于灰黄霉素、金霉素合成。v表面活性剂吐温、清洗剂，脂溶性小分子化合物等，起诱导作用。8、消沫剂（defoamingagent）v概念：降低泡沫的液膜强度和表面黏度，使泡沫破裂的化合物。v种类：表面活性剂，低表面面力。v天然动植物油脂类、高分子化合物（高碳醇脂肪酸和酯类、聚醚类、硅酮类）。v作用：v消除泡沫，防止逃液和染

32、菌。2.4.2 培养基种类及其质量控制技术v培养基的种类v按用途：选择性、鉴别性、富营养培养基等v按物理性质：固体，半固体、液体培养基v按化学组成：合成、半合成、天然培养基v按发酵过程中所处位置和作用：斜面或平板固体、种子、发酵和补料培养基。1、固体培养基v概念：（solid medium）v细菌和酵母的固体斜面或平板培养基，链霉菌和丝状真菌的孢子培养基。v制备：v液体培养基添加1.0-2.0%琼脂粉。v作用：v提供菌体的生长繁殖，形成孢子。1、固体培养基要求与质量控制v单细胞培养基：v营养丰富，满足菌体生长迅速，不能引起变异。v孢子培养基：v基质浓度较低，无机盐浓度适量，以利于孢子形成。营养

33、不宜太丰富，否则不易产生孢子。2、种子培养基v概念：（seed medium）v供孢子发芽和菌体生长繁殖，摇瓶和种子罐培养基,为液体。v作用：v使种子扩大培养，增加细胞数目，生长形成强壮、健康和高活性的种子。2、种子培养基要求与质量控制v培养基成分必需完全，营养丰富。v用速效性、容易被利用的碳、氮源和无机盐等物质，但浓度不宜高。v种子培养基要与发酵培养基相适应，主要成分接近，不能差异太大。v缩短发酵的延滞期。3、发酵培养基v概念：(fermentation medium)v提供微生物生长、目标产物生成的生产用培养基。v作用：v不仅要满足菌体的生长和繁殖，还要满足菌体合成目标产物，是发酵生产中最

34、关键和最重要的培养基。3、发酵培养基要求v营养物质浓度和粘度适中。v组成上丰富完整。v不同菌种和不同产物，对培养基的要求差异很大，组成和配方需要优化。4、补料培养基(fed medium）v概念：发酵过程中添加补充的培养基。v作用：稳定工艺条件，延长发酵周期，提高目标产物产量v组成：各种必要的营养物质，碳源、氮源、前体v制备：按单一成分配制，各自独立控制，或按一定比例制成复合补料培养基。5、控制发酵培养基质量v（1）控制水质：v恒定水源和恒定的水质。v地下深层井水，对水质定期化验检查，使用符合要求的水质配制各种培养基v措：检测与控制水质参数vpH、溶解氧、可溶性固体、污染程度、各种矿物，特别是

35、重金属的种类和含量。（2）控制培养基原料的质量：来源与种类的选择农副产品：因品种、产地、加工、贮存条件不同而质量差异较大。化学原料：杂质含量也不相同。措：保持稳定的原料来源。更换原料时，必需再进行一系列试验，确保产量和质量的控制和稳定性。原料的选择试验：v不同碳源、氮源对菌种生长的能力和产物的生产能力很不相同。v对原料进行试验，选择满足发酵要求的来源。v注意：v碳氮浓度与配比：适宜v速效和缓效成分相互配合，发挥综合优势vpH：配制时加入酸碱性物质搭配，甚至使用缓冲剂。（3）控制培养基的黏度：v对发酵的影响：v高黏度的培养基，不易彻底灭菌v影响发酵的通气搅拌等物理过程v直接影响菌体对营养的利用v

36、目标产物的分离提取造成困难v措：固体不溶性成分，淀粉、黄豆粉等增加培养基的黏度，酶水解，降低大分子物质（4）控制灭菌操作： 高压蒸气灭菌影响培养基的有效成分甚至是活性。v较高温度下长时间灭菌，营养成分会破坏，甚至产生有毒物质。v磷酸盐与碳酸钙、镁盐、铵盐也能反应，生成沉淀或络合物，降低利用度。v维生素等不耐高温分解破坏、失活。2.4.3 制药生产用培养基的配制v一般设计原则v设计思路v计算与定量配制v优化1、培养基设计一般原则v生物学原则：根不同微生物营养和反应需求设计。营养物质组成：较丰富，浓度适当。成分之间比例：否当，C/N比适宜。原料之间：不能产生化学反应。适宜的pH和渗透压v工艺原则：

37、不影响通气搅拌、分离精制和废物处理，过程容易控制。v低成本原则：原料来源方便，质量稳定，质优价廉。v高效经济原则：满足菌体生长和合成产物的需求，最高得率，最小副产物。2、培养基设计基本思路 起始培养基：根他人的经验和使用。v单因素实验：确定最适宜的培养基成分。v多因素实验：各成分之间最佳配比和浓度优化。v中试放大试验：摇瓶、小型发酵罐，到中试，最后放大到生产罐。v综合考虑各种因素，产量、纯度、成本等后，确定一个适宜的生产配方。3、理论计算与定量配制微生物生长和生产可用下列表达式表示：碳源和能源氮源其他营养物质细胞产物CO2H2O热量v单位细胞生物量所需最小的营养物质:v单位产量的最小底物浓度:

38、碳源和氮源进行转化率计算和分析v初步计算：参考微生物的化学和元素组成。v转化率：单位质量原料生产的产物量或细胞量。v理论转化率：根代谢途径的物料衡算v实际转化率：发酵过程中实际测量数值计算。v目标：使实际转化率靠近理论转化率。2.5 灭菌工艺v灭菌方法与原理v培养基灭菌工艺v空气除菌工艺几个概念v杂菌：除生产菌以外的任何微生物。v污染：感染杂菌的培养或发酵体系。v消毒：杀灭或清除病原微生物，达到无害化程度，杀灭率99.9%以上。v杀菌：杀灭或清除一切微生物，达到无活微生物存在的过程，杀灭率99.9999%以上。v灭菌：微生物杀灭率99.999999%以上。2.5.1 灭菌方法与原理v1、化学灭

39、菌v2、物理灭菌1、化学灭菌v用化学物质杀灭微生物的灭菌操作。v化学灭菌剂：v氧化剂类等，卤化物类，有机化合物等。v机理：蛋白质变性，酶失活，破坏细胞膜透性，细胞死亡。v应用：皮肤表面、器具、实验室和工厂的无菌区域的台面、地面、墙壁及空间的灭菌。2、物理灭菌v各种物理条件如高温、辐射、超声波及过滤等进行灭菌v紫外线等射线：局部空间v干热灭菌：实验室器皿v蒸汽灭菌：培养基v效果好，操作方便，广泛使用。3 干热灭菌 v在高温120以上，蛋白质、酶、核酸、生物膜等生物大分子变性、凝聚破坏，甚至是降解，生物细胞破裂，内容物释放，生物体死亡。对于干热灭菌，足够长的时间和足够高的温度，都可以杀灭生物体。干

40、热灭菌效果没有湿热灭菌好，是实验室常用的器皿的方法。工业采用160、2h，或170、1h干热空气，用于需保持干燥的器械、容器的灭菌。温度越高，时间相应缩短。4 蒸汽灭菌v湿热灭菌效果优于干热灭菌，原因在于湿热状态下，穿透力强，蒸汽冷凝时释放出大量能量，使蛋白质、核酸等内部的化学键破坏、降解，导致生物体死亡。一般在115140，保持一段时间，可以杀死各种生物体。由于蒸汽价格低廉，来源方便，效果可靠，操作控制简便，因此湿热灭菌常用于培养基和设备容器的灭菌。常用条件为115121，压力1105Pa，维持1530分钟。芽孢是一种休眠体，外面有厚膜包裹，耐热性很强，不易杀灭。因此在设计灭菌操作时，经常以

41、杀死芽孢的温度和时间为指标。为了确保彻底灭菌，实际操作中往往增加50的保险系数。2.5.2 培养基灭菌v1、微生物高温死亡动力学与灭菌的关系v微生物受热死亡过程的一级动力学反应：vdX/dt= kdXv微生物浓度与灭菌时间成正比，浓度越高，灭菌时间越长。v以杀死芽孢的温度和时间为指标。v确保彻底灭菌，实际操作中增加50的保险系数。2、培养基灭菌的操作方式v(1)分批灭菌操作，间歇灭菌,实罐灭菌：v配制好培养基输入发酵罐内，直接蒸汽加热，达到灭菌要求的温度和压力后维持一段时间，再冷却至发酵要求的温度。v特点：不需其他的附属设备，操作简便，手动。v缺点：加热和冷却时间较长。营养成分损失较多，罐利用

42、率低。适合小批量生产规模。分批操作的灭菌过程分批灭菌的操作过程v通入蒸汽：空气管、夹套通入蒸汽。v加热升温：70，取样管、放料管通入蒸汽。v维持保温：120，罐压0.1MPa，排气。调节进汽和排气量，维持30min。v冷却降温：依次关闭排气、进汽阀。罐压低于空气压力后，通入无菌空气，夹套通入冷却水降温。（2）连续灭菌操作v高温短时灭菌操作，连续：v培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭菌，冷却后送入已灭菌的发酵罐内的工艺过程。v加热升温、维持灭菌温度和冷却降温三个阶段由不同的设备执行：加热器，保温设备，冷却器。（2）连续灭菌操作流程图培养基与高压蒸汽直接混匀，达到灭菌温度（130140）

43、（2）连续灭菌操作过程v配料：配料罐，配制培养基。v预热罐：定容和预加热。7090。v加热器：培养基与蒸汽混合，快速升到130140。v维持罐：维持灭菌时间,57分钟。v冷却管：培养基经过冷却水管冷却。4050。v输入灭菌的发酵罐中。连续灭菌的特点1）高温快速灭菌工艺，营养成分破坏的少2）热能利用合理，易于自动化控制；3）不适合粘度大或固形物含量高的培养基灭菌；4）增加了连续灭菌设备及操作环节，增加染菌几率。5）对压力要求高，一般为0.45-0.8 MPa。2.5.3 空气除菌操作工艺v1、发酵对空气的要求v好氧微生物需要氧气供应，通入空气。v连续一定流量的压缩无菌空气。v压强：0.2-0.4

44、 MPa。v空气质量：相对湿度小于70；比培养温度高1030；洁净度100级。2、工业制备大量空气的方法v加热灭菌：空气在进入培养系统之前，一般需用空压机以提高压力，所以空气热灭菌时所需温度的提高，可直接利用空气压缩时的温度升高来实现 .v静电除菌：静电除尘是利用静电引力来吸附带电离子而达到除尘灭菌的目的。悬浮于空气中的微生物、微生物孢子大多数带有不同的电荷，没有电荷的微粒进入高压静电场时则会被电离成带电微粒，但对于一些直径很小的微粒，它所带的电荷很小，当产生的引力等于或小于气流对微粒的拖带力或微粒布朗运动的动量时，微粒就不能被吸附而沉降，所以静电除尘对很小的微粒效率较低。v介质过滤：是使空气

45、通过经高温灭菌的介质过滤层，将空气中的微生物等颗粒阻截在介质层中，而达到除菌的目的。3、空气除菌原理空气中附着在尘埃上的微生物大小为0.5-5um。 是依靠气流通过滤层时，基于滤层纤维的层层阻碍，迫使空气在流动过程中出现无数次改变气速大小和方向的绕流运动，从而导致微生物微粒与滤层纤维间产生撞击、拦截、布朗扩散、重力及静电引力等作用，从而把微生物微粒截留、捕集在纤维表面上，实现了过滤。 v当微粒随气流以一定的速度垂直向纤维方向运动时，空气受阻，改变运当微粒随气流以一定的速度垂直向纤维方向运动时，空气受阻，改变运动方向，绕过纤维前进，而微粒由于它的运动惯性较大，未能及时改变动方向，绕过纤维前进，而

46、微粒由于它的运动惯性较大，未能及时改变运动方向随主导气流前进，于是微粒直冲到纤维的表面，由于磨擦粘附，运动方向随主导气流前进，于是微粒直冲到纤维的表面，由于磨擦粘附，微粒就滞留在纤维表面上。微粒就滞留在纤维表面上。 当气流速度下降到一定值时，若微粒当气流速度下降到一定值时，若微粒 随气流慢慢靠近纤维时，受纤维所阻改变随气流慢慢靠近纤维时，受纤维所阻改变 方向，绕过纤维前进，并在纤维的周边形方向，绕过纤维前进，并在纤维的周边形 成一层边界滞留区，滞留区的气流流速更成一层边界滞留区，滞留区的气流流速更 慢，当与纤维表面接触时就被捕集。慢，当与纤维表面接触时就被捕集。 （）、布朗扩散作用机理（）、布

47、朗扩散作用机理 直径很小的微粒在很慢的气流中能直径很小的微粒在很慢的气流中能产生一种不规则的直线运动，称为布朗产生一种不规则的直线运动，称为布朗扩散。扩散。 v重力沉降是一个稳定的分离作用，当微重力沉降是一个稳定的分离作用，当微粒所受的重力大于气流对它的拖带力时，粒所受的重力大于气流对它的拖带力时，微粒就容易沉降。微粒就容易沉降。 悬浮在空气中的微粒大多带有不同电悬浮在空气中的微粒大多带有不同电荷，这些带电的微粒会受带异性电荷的荷，这些带电的微粒会受带异性电荷的物体所吸引而沉降。物体所吸引而沉降。 当空气流过介质时，上述当空气流过介质时，上述五种除菌机理同时起作用，五种除菌机理同时起作用，不过

48、气流速度不同，起主不过气流速度不同，起主要作用的机理也就不同。要作用的机理也就不同。当气流速度较大时，除菌当气流速度较大时，除菌效率随空气流速的增加而效率随空气流速的增加而增加，此时惯性冲击起主增加，此时惯性冲击起主要作用；当气流速度较小要作用；当气流速度较小时，除菌效率随气流速度时，除菌效率随气流速度的增加而降低，此时扩散的增加而降低，此时扩散起主要作用；当气流速度起主要作用；当气流速度中等时，可能是截留起主中等时，可能是截留起主要作用。如果空气流速过要作用。如果空气流速过大，除菌效率又下降，则大，除菌效率又下降，则是由于已被捕集的微粒又是由于已被捕集的微粒又被湍动的气流夹带返回到被湍动的气

49、流夹带返回到空气中。空气中。 图4-15 过滤除菌效率（ ）与气速（vs)的关系/ %惯性冲击机理vs / (m/s)扩散机理噬菌体拦截机理0重新污染除菌效率除菌效率影响深层过滤效率的因素影响深层过滤效率的因素 v微粒大小、过滤介质的种类、规格、介微粒大小、过滤介质的种类、规格、介质的填充密度、过滤介质层厚度以及所质的填充密度、过滤介质层厚度以及所通过的空气气流速度等。通过的空气气流速度等。4、空气过滤介质膜过滤介质：孔径小于被截留微生物体积硝酸纤维酯、聚四氟乙烯、聚砜、尼龙膜，四氟乙烯、纤维素树脂微孔滤膜。0.1-0.5umv深层过滤介质：空空大于被截留微生物体积。纤维状或颗粒状：棉花(50

50、um)、玻璃纤维、活性炭过滤纸：超细玻璃纤维纸(1-1.5um)v金属烧结管：单：或几十：甚至上百：金属微孔滤管安装在过滤器内。5、空气灭菌工艺过程一一. .概述：概述： 提高压缩前空气的洁净度的主要措：提高压缩前空气的洁净度的主要措： 提高空气吸气口的位置和加强吸入空提高空气吸气口的位置和加强吸入空气的前过滤。气的前过滤。 一、空气预处理设备一、空气预处理设备 1 1粗过滤器粗过滤器 v 安装在空气压缩机前的粗过滤器，其主要作用：捕安装在空气压缩机前的粗过滤器，其主要作用：捕集较大的灰尘颗粒，防止压缩机受损，同时也可减轻集较大的灰尘颗粒，防止压缩机受损，同时也可减轻总过滤器负荷。总过滤器负荷

51、。v 粗过滤器一般要求过滤效率高，阻力小，否则会粗过滤器一般要求过滤效率高，阻力小，否则会增加空气压缩机的吸入负荷和降低空气压缩机的排气增加空气压缩机的吸入负荷和降低空气压缩机的排气量。量。v 常用的粗过滤器有：布袋过滤、填料式过滤、油浴常用的粗过滤器有：布袋过滤、填料式过滤、油浴洗涤和水雾除尘等。洗涤和水雾除尘等。 振动机构含尘气流图4-7 机械振动袋式除尘器滤袋净气121-滤网 2-加油斗 3-油镜 4-油层图4-8 油浴洗涤装置空气出口空气出口空气出口图4-9 水雾除尘装置空气入口过滤网高压水入口 贮气罐的作用：贮气罐的作用：（1 1）消除脉动维持罐）消除脉动维持罐压的稳定。压的稳定。（

52、2 2）使部分液滴在罐）使部分液滴在罐内沉降。内沉降。（3 3）保温灭菌）保温灭菌。 出灰口排气进气图4-11 旋风分离器 v其结构同一级冷却器相同，由于季节关系或其其结构同一级冷却器相同，由于季节关系或其它原因对压缩空气的冷却效果达不到工艺要求它原因对压缩空气的冷却效果达不到工艺要求的情况下，可增设二级冷却器，再次冷却。的情况下，可增设二级冷却器，再次冷却。 v通过油水分离器净化过的空气，仍通过油水分离器净化过的空气，仍含有粒度较小的杂质及油水雾滴，含有粒度较小的杂质及油水雾滴，需在除雾器中进一步除去。除雾器需在除雾器中进一步除去。除雾器结构较简单，为一个中间夹有填料结构较简单，为一个中间夹

53、有填料瓷环的容器，油水雾滴遇到填料瓷瓷环的容器，油水雾滴遇到填料瓷环便凝聚下来，最后，可通过油水环便凝聚下来，最后，可通过油水排出口排出。排出口排出。2.6发酵培养技术v 选择合适的培养基；提供适宜的环境条件v微生物发酵工艺过程的三个工段：v种子制备v接种v发酵培养2.6.1 种子制备v种子的制备：v种子的逐级扩大培养过程。v获得一定数量和质量的纯种过程。1孢子制备v种子活化：将保存菌种接种在固体培养基上，在适宜条件下培养，恢复其固有生物特性。v放线菌孢子：采用琼脂斜面培养基。v霉菌孢子：大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。v细菌：采用碳源有限而氮源丰富的配方。2生产种子制备v

54、摇瓶种子制备：母瓶、子瓶。v种子罐种子制备：一级、二级、三级种子。v种子罐级数：制备种子需逐级扩大培养的次数v确定种子级数的因素:v菌种生长特性及菌体繁殖速度：生长快，少v发酵罐的容积：越大，多v产物的品种及生产规模：越大，多v所选用工艺条件：有利于生长的工艺，少发酵类型的定义v一级发酵：将孢子或菌丝接入直接发酵罐v二级发酵：经过一级种子罐，再到发酵罐；谷氨酸生产v三级发酵：二级种子扩大培养，经过二次种子罐，再接入发酵罐。青霉素生产v四级发酵：三级种子扩大培养，经过三级种子罐，再到发酵罐。链霉素生产菌接种方式v单种法：一个种子罐的种子接种一只发酵罐。v双种法：两个种子罐的种子接种一只发酵罐。v

55、倒种法：从发酵罐中取出一定量发酵液，接种到另一个发酵罐。2.6.2 培养技术1、固体表面培养技术：Solid surface culturev原始，最早采用。v2、液体深层培养：Liquid submerged culturev主要的发酵培养技术3、高密度培养（high cell density culture）v概念：菌体浓度（干重）至少达到50g/L以上的一种理想培养，发酵工艺目标和方向。v优点: v缩小发酵体积v增加表达量v成本低，生产率高。2.6.3 发酵培养的操作方式 1、分批式操作；间歇式操作；不连续操作v2、流加式操作，补料分批式操作v3、半连续式操作，反复分批式或换液培养v4、

56、连续式操作，衡态操作v5、灌流式操作1、分批式操作v概念：培养液一次性装入发酵罐，一次性接种，经过一段时间培养，一次性卸出全部培养物。v特点：非衡态过程发酵体系的组成（基质、产物及细胞浓度）都随发酵时间而变化。v缺点：开始时基质浓度很高，到中后期，营养物浓度很低，产物浓度很高，对发酵不利。v辅助时间：清洗罐，装料、灭菌，时间长。2、流加式操作v概念：装入大部分培养液，一次性接种，在培养过程中连续不断补充新培养基，但不取出培养液。v特点：v流加能源和碳源物质及氨水等。v克服了批式的缺点，使生长和生产保持适宜水平。v缺点：整个发酵体积不断增加。3、半连续式操作v概念：培养液一起装入发酵罐，一次性接

57、种。间歇取出部分发酵培养物（带放），同时补充同等数量的新培养基；然后继续培养，直至发酵结束。v特点：v发酵罐内的培养液总体积保持不变v使生长和生产保持适宜水平。v缺点：丧失部分前体，丧失部分菌体，利于非生产菌突变株的生长4连续式操作v概念：培养液一起装入发酵罐，接种后培养过程中，不断补充新培养基,同时取出包括培养液和菌体在内的发酵液，直至发酵结束。v特点：v恒定状态的发酵，发酵罐内体积及其物系的组成将不随时间而变。v培养基连续稳定流加；产物连续稳定收获；提高菌体密度；自动化。v缺点：时间长，杂菌污染、突变机会增多。5、灌流（注）式操作v概念：培养液与菌体一起装入发酵罐，菌体培养过程中，不断补充

58、新培养基，取出部分条件培养基，菌体仍然滞留罐内。v特点：v除去有毒害的代谢物v补充营养物质2.7 发酵培养工艺控制v微生物发酵生产水平取决于:v生产菌种性能与合适的环境条件v发酵过程各种参数处于不断变化状态v关键在于过程检测与控制检测仪器与主要参数v原位传感器：pH，溶氧，温度，压力v在线仪器：尾气分析仪v离线仪器：基质、产物浓度v生物学参数：菌体浓度，形态，杂菌v物理参数：温度，压力，搅拌，粘度v化学参数：基质浓度，pH，溶解氧，尾气，补料，消泡2.7.1 生物学检测主要的参数与控制v1.细胞形态v镜检：显微镜检测，染色，光学、荧光，电镜v应用：v是否污染，发酵过程状态，菌种的真实性。2.

59、菌体浓度v概念：菌浓：单位体积发酵培养液内菌体细胞的含量。v应用：v决定适宜补料量、供氧量等，以得到最佳生产水平。临界菌体浓度控制v概念：摄氧速率与氧传传速率平衡时的菌体浓度 菌体浓度超过此浓度，抗生素的生产速率会迅速下降。菌体遗传特性与发酵罐氧传质特性的综合反映。3.发酵污染杂菌的检测与控制v种子污染培养基灭菌不彻底v空气带菌v设备及其附件渗漏2.7.2 物理参数的检测与控制v1.温度的检测与控制v发酵温度概念:发酵中的所维持温度v在生长和生产的最适温度范围内v测定：v热电阻等热敏原件测定，温度计上读出。（1）发酵热的构成与计算v发酵热（fermentation heat）v产生热与散失热之

60、差v产生热：生物热和搅拌热v散失热：蒸发热、显热和辐射热。vQ发酵Q生物Q搅伴Q蒸发Q显Q辐射生物热(biological heat)v概念：菌体生长过程中直接释放到体外的热能。v影响因素：v培养基成分：越丰富，生物热越多。v菌体浓度、呼吸强度：越大，生物热越多。v不同生长阶段：生物热也不同。v发酵热平衡的主要依根：对数期的生物热搅拌热(agitation heat)v概念：搅拌器引起的液体做机械运动时因为摩擦所产生的热量。v影响因素：v发酵罐：搅拌设备、搅拌方式v培养基：发酵液黏度。v计算：单位体积发酵液的消耗功率与热功量（3600kJ/kWh）的乘积。散失热v蒸发热：空气进入发酵罐后，引起