胃癌特征性循环microRNA组合模式的建立及应用研究

1、金华市人民医院消化科 施莉一、立项研究内容一、立项研究内容二、研究工作情况二、研究工作情况三、取得的技术、经济、社会效益分析四、存在问题和前景预测背景全球每年约150万新发胃癌病例，引起近50000人死亡血清肿瘤标志物，如CEA、CA19-9对早期大肠癌诊断的敏感性和特异性尚不足。内源性小RNA，即miRNA在血清中非常稳定，能区分肿瘤患者和非肿瘤患者的潜在能力，miRNA的表达水平和肿瘤的临床病理特征及肿瘤预后相关，能准确判断其组织来源、对组织学上难以诊断的低分化肿瘤进行分类。目前的研究通常是基于肿瘤组织的miRNA表达谱的研究，因此较难用于肿瘤的早期筛选。术前肿瘤组织的获得具有一定的创伤性

2、，也限制了其在临床诊断中的应用。目的本研究应用实时定量PCR芯片结合定量PCR证，检测胃癌患者血清中特异相关miRNA，探讨候选miRNA作为胃癌诊断标志物的可行性。 立项研究内容筛选胃癌相关microRNA建立外周血循环miRNA的检测方法检测并分析microRNA在胃癌诊断中的价值收集胃癌患者和正常对照者外周血标本 研究方案(1) 招募研究对象，即临床诊首次断胃癌并未接受手术以及放化疗的患者和健康对照者，签署知情同意书，采集5ml外周血。(2) 采用Trizol-LS分离血浆/血清总RNA，加入RNA保护液于-80冰箱保存。(3) 文献挖掘及生物信息学数据库下载，统计分析筛选胃癌诊断相关m

3、icroRNA。(4) 建立茎环逆转录荧光定量PCR方法检测血浆循环microRNA水平。 研究方案(5) 逆转录条件和荧光定量PCR方法的优化。(6) 检测临床样本和健康对照组外周血循环microRNA水平(7) 临床资料和检测数据统计分析，确定胃癌诊断的microRNA组合模式，并提出诊断标准。公共数据库下载文献挖掘胃癌相关miRNA胃癌差异miRNA备选miRNA胃癌患者健康对照分离血浆/血清总RNA提取miRNA检测方法的建立和优化循环miRNA水平与临床资料分析胃癌早期诊断及预后的microRNA组合模式技术技术路线路线材料Tri-Reagent BD试剂购自Sigma公司；miRN

4、A定量PCR芯片检测购自Exiqon公司；miRNA定量PCR检测试剂盒购自Qiagen公司；DEPC水购自宝生物工程（大连）有限公司。结果采用含384条miRNA的定量PCR芯片检测3例-期的胃癌患者血清及3例健康对照血清miRNA的表达水平。结果显示（图1及表2），9条miRNA差异倍数大于2，且P值小于0.01，其中5条miRNA明显上调，4条明显下调。miRNA差异倍数（胃癌/正常对照）P值上调hsa-miR-218.7620.009hsa-miR-320a5.2670.005hsa-miR-29a3.9390.014hsa-miR-2102.7380.013hsa-miR-3782.

5、350.01下调hsa-miR-146a0.340.005hsa-miR-181b0.190.017hsa-miR-2030.1330.02hsa-miR-3820.0450.006胃癌患者特征血清胃癌患者特征血清miRNA的筛选的筛选结果进一步采用Qiagen公司的定量PCR检测试剂盒，分析100例胃癌患者血清标本及60例健康对照血清中候选miRNA的表达。如图2所示，筛选获得的9条miRNA均得到验证。胃癌患者特征血清胃癌患者特征血清miRNA的验证的验证结果聚类分析产生的系统树图可见，9个胃癌患者特征血清miRNA能够清晰地将胃癌患者与正常人分为两类。胃癌患者特征血清胃癌患者特征血清mi

6、RNA的诊断效能评价的诊断效能评价利用单一miRNA诊断胃癌的ROC曲线分析显示，9条均有较好的诊断效率。miRNA曲线下的面积P 值95% 置信区间下限上限miR-210.93400.8770.992miR-3200.92700.860.993miR-29a0.98200.9551miR-2100.8700.7810.959miR-3780.86200.7710.953miR-146a1011miR-3821011miR-181b0.90900.8220.996miR-2030.97800.951进一步利用胃癌患者血清标本及健康对照血清的miRNA表达水平建立 logistic回归模型，采用

7、ROC曲线分析9个胃癌患者特征血清miRNA的诊断效能。结果显示，检测胃癌样本的曲线下面积(AUC)达0.934 (95% CI 0.877-0.992)（P0.001） 技术创新本项目采用定量PCR芯片结合定量PCR筛选、验证血清microRNA表达谱，获得9条胃癌特异相关的血清miRNAs。在分别分析单一miRNA诊断胃癌效率的基础上，综合9条miRNA，提出胃癌早期诊断的特异周血循环microRNA组合模式，为胃癌的诊断提供新的思路。(四)总体评价结论 本研究达到主要技术指标要求，顺利完成各项立项研究内容。 取得技术、经济、社会效益分析本研究达到主要技术指标要求，顺利完成各项立项研究内容。本研究筛选鉴定了9条胃癌特异血清microRNA，并评价其作为胃癌诊断的效应。本研究的结果发表学术论文2篇，目前正准备申请国家发明专利。存在