动物肝脏中DNA的提取及检测实验报告

1、动物肝脏中DNA勺提取及检测一、前言脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸（DNA，为英文Deoxyribonucleic?acid 的缩写）， 又称去氧核糖核酸，是脱氧核糖核酸染色体的主要化学成分，同时也是组成基因的材料。有时也被称为“遗传微粒”，原因是在繁殖过程 中，父代会把它们自己DNA的一部分复制传递到子代中，从而完成 性状的传播。DNA是高分子聚合物，DNA溶液为高分子溶液，具有很高的粘 度，可被甲基绿染成绿色。DNA对紫外线（260nm ）有吸收作用， 利用这一特性，可以对DNA进行含量测定。当核酸变性时，吸光度 升高，称为增色效应；当变性核酸重新复性时，吸光度又会恢复到原 来的水平。较高温度、

2、有机溶剂、酸碱试剂、尿素、酰胺等都可以引 起DNA分子变性，即DNA双链碱基间的氢键断裂，双螺旋结构解 开一也称为DNA的解螺旋。在细胞内，DNA能与蛋白质结合形成染色体，整组染色体则统 称为染色体组。对于人类而言，正常的体细中含有 46条染色体。染 色体在细胞分裂之前会先在分裂间期完成复制，细胞分裂间期又可划 分为：G1期-DNA合成前期、S期-DNA合成期、G2-DNA合成后 期。对于真核生物，如动物、植物及真菌而言，染色体主要存在于细 胞核内；而对于原核生物，如细菌而言，则主要存在于细胞质中的拟 核内。染色体上的染色质蛋白，如组织蛋白，能够将 DNA进行组织 并压缩，以帮助DNA与其他蛋

3、白质进行交互作用，进而调节基因的 转录。脱氧核糖核酸的结构DNA的结构：DNA的结构一般可划分为一级结构、二级结构、 三级结构和四级结构四个水平。DNA是一种长链聚合物，组成单位为四种脱氧核苷酸，即腺嘌 呤脱氧核苷酸（dAMP脱氧腺苷）、胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTMP脱 氧胸苷）、胞嘧啶脱氧核苷酸（dCMP脱氧胞苷）、鸟嘌呤脱氧核 苷酸（dGMP脱氧鸟苷）。而脱氧核糖（五碳糖）与磷酸分子借由 酯键相连，组成其长链骨架，排列在外侧，四种碱基排列在内侧。每 个糖分子都与四种碱基里的其中一种相连，这些碱基沿着DNA长链所排列而成的序列，可组成遗传密码，指导蛋白质的合成。读取密码 的过程称为转录，是以D

4、NA双链中的一条单链为模板转录出一段称 为mRNA （信使RNA ）的核酸分子。DNA是由许多脱氧核苷酸按一定碱基顺序彼此用 3 '，5 '-磷酸二酯键相连构成的长链。大多数 DNA含有两条这样的长链，也有 的DNA为单链，如大肠杆菌噬菌体 © X174、G4、M13等。DNA 有环形DNA和链状DNA之分。在某些类型的 DNA中，5-甲基胞 嘧啶可在一定限度内取代胞嘧啶，其中小麦胚DNA的5-甲基胞嘧啶 特别丰富。在某些噬菌体中，5-羟甲基胞嘧啶取代了胞嘧啶。40年 代后期，查加夫（）发现不同物种 DNA的碱基组成不同，但其中的 腺嘌呤数等于其胸腺嘧啶数（A=T ）

5、，鸟嘌呤数等于胞嘧啶数（G=C）, 因而嘌呤数之和等于嘧啶数之和，一般用几个层次描绘DNA的结构。浓盐法从动物组织中提取DNA核酸和蛋白质在生物体中常以核蛋白（DNP/RNP）的形式存在， 其中DNP能溶于水及高浓度盐溶液，但在 M的盐溶液中溶解度很 低，而RNP则可溶于低盐溶液，因此可利用不同浓度的 NaCl溶液 将其从样品中分别抽提出来。将抽提得到的DNP用SDS处理可将其 分离DNA和蛋白质，用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去可得 DNA上 清，加入冷乙醇即可将其呈纤维状析出。肝脏细胞肝脏是由肝细胞组成，肝细胞极小，肉眼看不到，必须通过显微 镜才能看到。人肝约有25亿个肝细胞，5000个肝细

6、胞组成一个肝 小叶，因此人肝的肝小叶总数约有 50万个。肝细胞为多角形，直径 约为20-30/加（微米），有6-8个面，不同的生理条件下大小有差异， 如饥饿时肝细胞体积变大。每个肝细胞表面可分为窦状隙面、肝细胞 面和面三种。肝细胞里面含有许许多多复杂的细微结构：如肝细胞核、 肝细胞质、内质网、高尔基氏体、微粒体及饮液泡等组成。二、实验目的1. 掌握浓盐法从动物组织中提取 DNA的原理与技术三、实验原理核酸和蛋白质在生物体中常以核蛋白 ( DNP/RNP )的形式存在， 其中 DNP 能溶于水及高浓度盐溶液，但在 M 的盐溶液中溶解度很 低，而 RNP 则可溶于低盐溶液，因此可利用不同浓度的 N

7、aCl 溶液 将其从样品中分别抽提出来。将抽提得到的 DNP 用 SDS 处理可将其分离 DNA 和蛋白质，用 氯仿 -异戊醇将蛋白质沉淀除去可得 DNA 上清，加入冷乙醇即可将 其呈纤维状析出。四、实验器材和材料试剂实验器材： 匀浆器 量筒 离心机 离心管 试管 吸管 恒温水浴锅实验材料： 猪肝实验试剂： L L柠檬酸钠溶液() 95%乙醇（.） NaCI固体（.） 5%SDS溶液（5g SDS 定容至100ml ） V（氯仿）:V （异戊醇）20 : 1的混合液五、实验操作1. 称量 称取一定质量的猪肝， 加入 2 倍肝重的 L L 柠檬酸钠缓冲液并 用匀浆器磨碎（已完成）。2. 提取 D

8、NA 量取肝糜 4 ml 于 10 毫升离心管，在 4000r/min 下离心10min ，沉淀中再加入 8 ml 缓冲液于 4000r/min 离心 5 min ； 弃上清，取沉淀； 将沉淀用 10 ml 柠檬酸钠缓冲液完全洗入干净的小烧杯、加入5 ml氯仿-异戊醇混合液、1 ml SDS，振荡30min （保鲜膜封口）； 缓慢加入固体NaCI （约），使其最终浓度为1mol/L ； 将溶液分装到 2 个 10 毫升离心管中，在 4000r/min 离心 5 min ，取上清水相； 在上述水相溶液中分别加等体积冷95% 乙醇，边加边用玻棒慢慢朝一个方向搅动， 将缠绕在玻棒上的凝胶状物用滤纸吸

9、去多余的 乙醇，即得 DNA 粗品； 用 8ml 蒸馏水溶解 DNA 粗品于 10ml 离心管中。3. 标准曲线的绘制按下表加入各种 试剂，混匀，于60 C恒温水浴锅45min，冷 却后，在595nm 波长下于分光光度计比色测定，以吸光度对 DNA 浓度作图，制作标准曲线。012345标准DNA溶液/ml蒸馏水/ml0二苯胺试剂/mlA595nm4.样品的测定将DNA粗品定容至25ml容量瓶，再取DNA样液，加入蒸馏 水，混匀。然后准确加入二苯胺试剂，混匀，于60 C恒温水浴锅45min ,冷却后，595nm波长下于分光光度计比色测定，根据所测 的吸光度对照标准曲线求得 DNA的质量（ug ）

10、。5.计算100g猪肝中DNA含量w=m1/m2 X100%w : DNA的质量分数（%）ml :样液中测得的DNA的质量（ug ）m2 :样液中所含样品的质量（ug ）六、实验数据处理1.标准曲线012345标准DNA溶液/ml蒸馏水/ml0二苯胺试剂/mlA595nm0DNA含量/ug080160240320400a 0.050 丄 0丄50.2025032. 实验结果处理猪肝质量为DNA提取液体积为序号123A595nm平均A595nm样液中DNA含量/ug样液中样品质量/g根据公式w=m1/m2 X100%得：w= %则100g猪肝中DNA 含量为：w X100=七、思考题1. 实验中

11、的乙醇、SDS、氯仿-异戊醇、NaCI、柠檬酸钠分别有什么作用答：柠檬酸的钠盐在实验中既充当DNA酶的抑制剂，也是pH 缓冲溶液； SDS是表面活性剂，可以让蛋白质与 DNA分开； 氯仿是有机溶剂， 可以使蛋白质聚集沉淀， 便于分离出去； 异戊醇是消泡剂，可以减少泡沫的发生； 氯仿 -异戊醇的作用是使、膜溶解； NaCI固体溶解使得试液成为高浓度的盐溶液，在这样的 环境中 DNA 核蛋白能溶解， RNA 核蛋白则溶解度很低，可以利用 这一性质分离两种核酸。八、实验注意事项主要集中在细胞核中， 因此，通常选用细胞核含量比例大的生活 组织作为提取制备 DNA 的材料，小牛胸腺组织中细胞核比例较大，

12、 因而 DNA 含量丰富，同时其脱氧核苷酸酶活性较低，制备过程中 DNA 被降解的可能性相对较低，所以是制备 DNA 的良好材料，但 其来源较困难，脾脏或肝脏易获得，也是实验室制备 DNA 常用的材 料，本实验用新鲜肝脏作为实验材料。2. 为了防止大分子核酸在提取过程中被降解，须采取以下措施： 整个过程必须在低温下进行， 可加入某些物质抑制核酸酶的活性， 如 柠檬酸钠、 EDTA、SDS 等， EDTA 是抑制核酸酶的活性最好的抑制 剂。3. 从核蛋白中脱去蛋白质的方法很多，经常采用的有：氯仿- 异 丙醇法、苯酚法、去垢剂法等，他们均能使蛋白质变性和核蛋白解聚， 并释放出核酸。4. 使用离心机

13、时，对称放置的离心管必须用天平调平衡。5. 避免剧烈振荡，如研磨过程、搅拌过程等。九、实验结果误差分析及讨论 经过对本次实验结果进行分析，得出 100g 猪肝中 DNA 含量大约为 的结论，在上网查阅相关资料后发现：猪肝中 DNA 含量与本次试验 实际操作测量得出的结果大致相互吻合。 由此可知， 本次试验结果是 相对比较成功的，较为粗略地测量出猪肝中 DNA 的含量，并且较为 熟练地掌握了浓盐法从动物组织中提取 DNA 的原理与技术，基本达 到了本次实验的目的。但是本次实验结果只是粗略测量，并未达到精确测量猪肝中DNA 的含量，且实验数据较理论值偏低，这是由于某些误差导致， 在实验过程中些许因

14、素可能会导致实验结果数据有偏差， 经分析得出 以下几点： 在称取猪肝后加入柠檬酸钠缓冲液进行研磨的过程中， 由于猪 肝组织表面较滑不易磨碎， 且研磨至最后依旧有小部分猪肝组织块残 留，因此可能导致猪肝中 DNA 提取不充分，致使实验数据较理论值 偏低； 研磨过程中， 可能由于操作不当，导致部分液体溅出，因此可能使得提取液中部分 DNA 损失，导致实验数据偏低； 在粗提取 DNA 操作中，频繁地将 DNA 提取液转移至各个仪 器内，可能有极小部分 DNA 提取液未倒净， 残留在仪器壁上损耗掉， 导致实验误差； 在使用移液枪的过程中， 可能因为操作不当或移液枪经常错误 使用，出现仪器误差， 导致吸取的 DNA 样液不精确， 出现实验误差； 在水相中加入乙醇析出 DNA 时，不是所有 DNA 均析出，有 小部分依