生物芯片原理与技术

1、2021-12-15生物芯片原理与技术生物芯片原理与技术生物芯片原理与技术生物芯片原理与技术生物芯片原理与技术生物芯片原理与技术2021-12-15什么是生物芯片什么是生物芯片什么是生物芯片什么是生物芯片什么是生物芯片什么是生物芯片( ( (Biochips)Biochips)Biochips)？ 生物芯片是将大量生物识别分子按预先设置的排列固定于一种载体（如硅片、玻片及高聚物载体等）表面，利用生物分子的特意性亲和反应，如核酸杂交反应，抗原抗体反应等来分析各种生物分子存在的量的一种技术。 2021-12-15生物芯片计算机芯片生物芯片DNA芯片蛋白质芯片基因芯片生物芯片又称微阵列(microa

2、rray)2021-12-15 基因芯片的工作原理基因芯片的工作原理 标记的待测分子与被固定的探针杂交。标记的待测分子与被固定的探针杂交。 基因芯片的特点：基因芯片的特点： 探针数量多密度高，所以一次可以对大量的探针数量多密度高，所以一次可以对大量的DNA分分子或子或RNA分子进行检测分析。分子进行检测分析。 常用支持物常：玻璃片，聚丙烯酰胺板、金属片、常用支持物常：玻璃片，聚丙烯酰胺板、金属片、硅片等硅片等 ，玻璃是最常用的材料。，玻璃是最常用的材料。常用的待测分子常用的待测分子PCR产物：序列分析产物：序列分析RT-PCR产物：基因表达分析产物：基因表达分析2021-12-15基因芯片使用

3、步骤基因芯片使用步骤芯片制作芯片制作把探针固定于载体表面把探针固定于载体表面样品处理样品处理目标分子富集目标分子富集分子间的杂交分子间的杂交结果检测与数据分析结果检测与数据分析2021-12-15生物芯片分析过程生物芯片分析过程生物芯片分析过程生物芯片分析过程生物芯片分析过程生物芯片分析过程试样处理点阵固定反应或杂交芯片制作标记洗涤检测扫描光刻合成微量点样喷墨纯化、标记光化学检测电化学检测计算处理2021-12-15生物芯片的制作生物芯片的制作生物芯片的制作生物芯片的制作生物芯片的制作生物芯片的制作2021-12-15基因芯片的制作基因芯片的制作基因芯片的制作基因芯片的制基因芯片的制作方式作方

4、式原位合成原位合成直接点样直接点样光引导原位合成光引导原位合成分子印章法分子印章法分子印章法分子印章法针式点样针式点样喷墨点样喷墨点样2021-12-15一、针式点样一、针式点样 1、玻璃片基的处理：使玻璃表面获得羟基、醛基、玻璃片基的处理：使玻璃表面获得羟基、醛基、氨基等活性基团。氨基等活性基团。 2、点样针沾取探针溶液。、点样针沾取探针溶液。 3、点样针把探针点到玻片表面，让探针末端的化、点样针把探针点到玻片表面，让探针末端的化学集团与玻片表面的集团形成共价键。学集团与玻片表面的集团形成共价键。 4、针式点样针式点样的优缺点的优缺点 优点：成本低，操作简单，密度高（几千优点：成本低，操作简

5、单，密度高（几千-几十万几十万点点/cm2)， 转移过程中探针溶液损失小。转移过程中探针溶液损失小。 缺点：定量准确性、重现性不好缺点：定量准确性、重现性不好2021-12-152021-12-152202芯片点样仪芯片点样仪每块玻片点样量每块玻片点样量82,000个点个点2021-12-15 二、喷墨点样二、喷墨点样 喷墨点样喷墨点样的方式类似于喷墨打印机的方式类似于喷墨打印机。将将合成用合成用探针溶液探针溶液放入打印墨盒内，由电放入打印墨盒内，由电脑依据预定的程序在脑依据预定的程序在xyz方向自动控制打方向自动控制打印喷头在芯片支持物上移动，并根据芯印喷头在芯片支持物上移动，并根据芯片不同

6、位点探针序列需要将特定的片不同位点探针序列需要将特定的探针探针试剂（不足纳升）喷印到特定位点。喷试剂（不足纳升）喷印到特定位点。喷印上去的试剂即以固相合成原理与该处印上去的试剂即以固相合成原理与该处支持物发生偶联反应。支持物发生偶联反应。2021-12-15三三三种种种制制制作作作芯芯芯片片片方方方法法法的的的示示示意意意图图图2021-12-15三、生物芯片技术的应用三、生物芯片技术的应用三、生物芯片技术的应用三、生物芯片技术的应用三、生物芯片技术的应用三、生物芯片技术的应用 applications ofapplications ofapplications of biochip tech

7、nologybiochip technologybiochip technology1. 1. DNADNA序列测定序列测定人类基因组计划：鉴别和测定人类基因的人类基因组计划：鉴别和测定人类基因的DNA序列；序列；杂交测序：（杂交测序：（sequencing by hybridization,SBH） 建立在特定序列的建立在特定序列的DNA与特定长度的寡核苷酸集合的杂交与特定长度的寡核苷酸集合的杂交的基础之上。未知的基础之上。未知DNA序列可以通过鉴定与靶序列可以通过鉴定与靶DNA序列形序列形成完整的双链体寡核苷酸的重叠区域来确定；成完整的双链体寡核苷酸的重叠区域来确定；65536个八核苷酸点

8、阵可测定约个八核苷酸点阵可测定约200个核苷酸的序列；个核苷酸的序列；一百万个十二核苷酸点阵可测定约一百万个十二核苷酸点阵可测定约1000个碱基对；个碱基对；2021-12-15生物芯片技术的应用生物芯片技术的应用生物芯片技术的应用生物芯片技术的应用生物芯片技术的应用生物芯片技术的应用2. 2. 蛋白质芯片蛋白质芯片 基因组计划后的另一项重要计划：蛋白组计划；基因组计划后的另一项重要计划：蛋白组计划； 正常与癌变细胞蛋白谱的差异分析。正常与癌变细胞蛋白谱的差异分析。3. 3. 基因突变检测与遗传病和肿瘤诊断基因突变检测与遗传病和肿瘤诊断 大量平行测定。大量平行测定。4. 4. 药物筛选药物筛选

9、 在基因水平上寻找药物靶标，毒性对基因的影响。在基因水平上寻找药物靶标，毒性对基因的影响。5. 5. 微型化分析仪器微型化分析仪器 快速、平行、重复性检测。快速、平行、重复性检测。2021-12-15血气检血气检血气检血气检血气检血气检测芯片：测芯片：测芯片：测芯片：测芯片：测芯片：622mm2021-12-15应用示例：基因芯片在肿瘤研应用示例：基因芯片在肿瘤研应用示例：基因芯片在肿瘤研究中的应用究中的应用究中的应用 v癌基因的活化 原癌基因的突变 原癌基因由于启动因子而转录活性增高 原癌基因的甲基化程度降低而被激活 原癌基因的拷贝数增加 基因易位或重组使原癌基因激活 2021-12-15能

10、诊断癌症的基因芯片能诊断癌症的基因芯片能诊断癌症的基因芯片能诊断癌症的基因芯片能诊断癌症的基因芯片能诊断癌症的基因芯片2021-12-15基因芯片的使用流程基因芯片的使用流程基因芯片的使用流程基因芯片的使用流程基因芯片的使用流程基因芯片的使用流程 以以HLA基因多态性为例基因多态性为例 一、一、待测分子的获得与标记待测分子的获得与标记 1）提取患者基因组DNA 2）DNA样品样品PCR扩增扩增并进行标记。并进行标记。2021-12-15 常用标记物为荧光素。常用标记物为荧光素。 1. 末端标记：在引物上标记有荧光末端标记：在引物上标记有荧光素素，在，在DNA扩增过程时，使新形成的扩增过程时，使

11、新形成的DNA链末端链末端带有荧光带有荧光素素。 2 .随机插入：选择四种缄机基，使其中一随机插入：选择四种缄机基，使其中一种或几种挂有荧光种或几种挂有荧光素素，在，在PCR过程中，带有过程中，带有荧光荧光素素的碱基和不带荧光探针的碱基，同时的碱基和不带荧光探针的碱基，同时参与参与DNA链的形成。链的形成。2021-12-15 二、杂交二、杂交 过程类似于一般的杂交法。过程类似于一般的杂交法。 把要杂交的分子的溶液覆盖芯片的探针，把要杂交的分子的溶液覆盖芯片的探针，用盖玻片覆盖，即可杂交。用盖玻片覆盖，即可杂交。杂交温度的选择极关键。杂交温度的选择极关键。2021-12-15芯片杂交炉芯片杂交

12、炉 （Hybridization oven) 生产商生产商 Affymetrix 全自动控制芯片的杂交过程。温度控制精确，全自动控制芯片的杂交过程。温度控制精确，芯片舱的转动提供充分的混合。该杂交炉可以芯片舱的转动提供充分的混合。该杂交炉可以同时处理同时处理64张芯片。张芯片。 2021-12-152021-12-15 三、基因芯片的扫描三、基因芯片的扫描 基因芯片杂交结果要用专用的扫描系统基因芯片杂交结果要用专用的扫描系统读取。读取。BBACDE放大器放大器数模转数模转换器换器计算机计算机A:激光器激光器 B:滤光片滤光片 C:二色镜二色镜 D:反光镜反光镜 E:关栅关栅 2021-12-1

13、5 Scanner Array Scanner Array扫描仪采用氩离子激光器来激发与目的扫描仪采用氩离子激光器来激发与目的DNA结合的荧光分子来产生定量的杂交信号。结合的荧光分子来产生定量的杂交信号。 Scanner Array扫描仪扫描芯片上成千上万的探针。扫描仪扫描芯片上成千上万的探针。 扫描的同时给出高分辨率的实时的图像，同时荧光亮扫描的同时给出高分辨率的实时的图像，同时荧光亮度的数据储存在原始文件中。度的数据储存在原始文件中。 激光源激光源: 488 nm 氩离子激光器氩离子激光器激光束直径：激光束直径：3微米微米 检测指标：检测指标：样品点直径：样品点直径：20微米微米支持的染料

14、：荧光素支持的染料：荧光素分辨率：分辨率： 3微米微米 预扫描时间：最长预扫描时间：最长2 分分 单次扫描时间：最长单次扫描时间：最长4分钟（分钟（12.8mm x12.8 mm）2021-12-15基因芯片扫描结果基因芯片扫描结果不同的颜色代表一个探针点杂交上的带荧光标记不同的颜色代表一个探针点杂交上的带荧光标记的核酸分子数的差异。红的核酸分子数的差异。红黄黄绿绿兰兰紫紫2021-12-15芯片扫描仪芯片扫描仪芯片扫描仪芯片扫描仪芯片扫描仪芯片扫描仪2021-12-15 四、结果分析四、结果分析 当从芯片发出的荧光转换成数字输出后，当从芯片发出的荧光转换成数字输出后，数据文件就被定量和翻译，

15、通过重叠芯数据文件就被定量和翻译，通过重叠芯片像线栅，软件对芯片上的每个点计算片像线栅，软件对芯片上的每个点计算平均密度值，从而完成定量，通过对芯平均密度值，从而完成定量，通过对芯片上实验点和对照点的比较，片上实验点和对照点的比较，选出杂交选出杂交点，并定量。点，并定量。 2021-12-15Genomic DNAGenomic DNA2021-12-15 基因芯片具有什么优点与基因芯片具有什么优点与 缺点？缺点？2021-12-154、生物芯片的优点、生物芯片的优点1）高通量性：可同时并行分析成千上万种）高通量性：可同时并行分析成千上万种分子。节省时间。分子。节省时间。2）微型化，实验所需试

16、剂用量少）微型化，实验所需试剂用量少3）高度自动化）高度自动化5、缺点：在同一温度下杂交，不同探针杂、缺点：在同一温度下杂交，不同探针杂交效率不同。交效率不同。2021-12-15生物芯片于一般分子杂交比较生物芯片于一般分子杂交比较生物芯片于一般分子杂交比较生物芯片于一般分子杂交比较生物芯片于一般分子杂交比较生物芯片于一般分子杂交比较生物芯片生物芯片Southern等等信息通量信息通量高，几千高，几千-几十万点几十万点/cm2低低自动化程度自动化程度 高高低低研究的速度研究的速度 快快慢慢实验结果的实验结果的平行性平行性好好低低2021-12-15基因芯片在医学领域的应用基因芯片在医学领域的应

17、用基因芯片在医学领域的应用一、基因芯片可应用于疾病诊断一、基因芯片可应用于疾病诊断 1）肿瘤的基因诊断）肿瘤的基因诊断 例：例： Affymetrix公司，把公司，把P53基因全长序列基因全长序列和已知突变的探针集成在芯片上，制成和已知突变的探针集成在芯片上，制成P53基因芯片，将在癌症早期诊断中发挥作用。基因芯片，将在癌症早期诊断中发挥作用。2）用于诊断遗传性疾病）用于诊断遗传性疾病例：上海联合基因公司开发了例：上海联合基因公司开发了-地中海性贫血地中海性贫血的检测芯片的检测芯片3）用于病原体的检出和确定）用于病原体的检出和确定例：西安联尔公司开发了呼吸道病原体诊断芯例：西安联尔公司开发了呼吸道病原体诊断芯片，可检出多种引起呼吸道感染的病原体。片，可检出多种引起呼吸道感染的病原体。20