RT-PCR原理和实验步骤

1、RT-PCR原理与实验步?一、知识背景：1、基因表达：DNA RNAProtein单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因 一 104个丝心蛋白 mRNA (每个mRNA存活4d ,可以合成10,个丝心蛋白)共合成1()9个丝心蛋 S。因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。2、PCR 技术(Polymerase chain reaction):即聚合酶链式反应。在模板、引物和四种脱氧核苗酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其 特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步：A.变性：通过加热使DNA双螺旋的氢犍断裂，形成单链DNA ;B.退火：将

2、反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。C.延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2 +存在下，退火引物沿夕3方向延伸。 以上三步为一个循环，如此反复。3、逆转录酶和RT-PCR逆转录酶(reverse transcriptase )是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚 合酶，至少具有以下三种活性：1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；2、Rnase水解活性：水解RNA:DNA杂合体中的RNA ;3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.二、RT-PCR的准备：1.引物的设计及其原则：1)引物的特异性决定PCR反

3、应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至 关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚 型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对弓|物的特异性的影响。尽量选择 覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不 存在的内含子。2)引物设计原则的把握引物设计原则包括：a、引物长度:一般为15 30bp，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最 适延伸温度会超过Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。b、碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免瞟吟或喀D定的聚集存在，特别是连续出 现3个以上的单一碱基。GC含量(Tm值

4、)：40% 60% , PCR扩增的复性温度一般 是较低Tm值减去5 10度。c、3,端要求：3,端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二 级结构的可能。末位碱基是A时错配的引发效率最低，G、C居中间，因此引物的3' 端最好选用A、G、C而尽可能避免连续出现两个以上的T。d、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折墨成发夹状结构或 引物自身复性。e、引物之间的二级结构：两引物之间不应有多于4个连续碱基互补，3'端不应超过 2个。f、同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续8个的互补碱基存在。g、5'端无严格限制：5'末端

5、碱基可以游离，但最好是G或C ,使PCR产物的末端 结合稳定。还可以进行特异修饰（标记、的切位点等）等等。根据实验目的选择适当的引物。常用引物设计软件如Primer5.0 , Oligo6.0等对于 这些条件都可以自行设置。2、耗材：实验所用的接触样品的耗材如冻存管、枪头、EP管之类事先都需经过0.1%DEPC 水浸泡处理，除去RNA酶，防止操作过程中RNA降解。然后经高压灭活（灭菌和灭活 DEPC） .3、试剂准备:变性液、水饱和酚、乙酸钠、氯仿、异丙醇、75%酒精、经DEPC处理并高压的 水。三、RNA的提取方法RT -PCR中从细胞分离的RNA的质量至关重要，包括RNA的纯度和完整性。R

6、NA分离的最关犍因素是尽量减少RNA酶的污染。但RNA酶活性非常稳定，分布广 泛,除细胞内源性RNA酶外，环境中也存在大量RNA酶。因此在提取RNA时,应尽 量创造一个无RNA酶的环境，包括去除外源性RNA酶污染和抑制内源性RNA酶活 性,主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，通过RNA酶的阻抑蛋白 Rnasin和强力的蛋白质变性剂如异硫富酸肌抑制内源性RNA酶。RT-PCR 步骤：50-J00mg组级加0.8ml变性液匀奖,转移入EP管内1> RNA的提取，约Id个细胞加0-8ml变隧反复吹打10-20次U 一加0.'ml乙酸钠，0.5ml水饱和酚，0 2ml氯

7、仿，充分混匀，静置5分钟后，4匕12000gX20minII丁小心将上岸无色澹体?专移入新EP管内，切勿取到申星白色物店（取3/4即可）1对于脂肪、酶较多的组织样品，可以再加水饱f口酎和氯仿再提取一次以增高兜度11；加等体积异解字，粒粒颠倒混匀，-20七放置3m1 in4 f 12000gxl0mino可看到管底部壁上有白色沉淀即为RNA,弃去上清。加03ml变性液和0 3nli异丙醒重箱悬起沉淀，-20七放朋30mm, 4 t.12000gXl0minn界去上清，加1ml75%Zgj,吹打悬起沉淀，室温薛比5min（可-20七保存）4七7500g X 5mm,并上清，灭菌源纸u-加适量203

8、左右）口EPC处理过的水，溶解RNA可-2。七保存）,取23稀释50倍，于核酸蛋白测定2、cDNA的合成；Sul2.5ul0.4ulO.5ul2.5-3us逆转录体系的组成： DEPC处理水10mM dNIPs Random primers RNasin后、R2 Au70 C 5minQ速置冰水中冷却口Sul lul(200U)再加：5*逆转录buffer逆转录酶(M-MLV)加水至25ul口37 "C 60tnin90"C 5min3、PCR扩增：50ul PCR体系的组成：1 OxPCRbuffer Mscl21 OmMdNTPs sense primer antise

9、nse primercDNADEPC处理水T叫酶总体积4、PGR反应条件：94 P94 VC退火温度72 UC72 UC4 r5ul3ul(2. OmM)lullul( lumol 1) lulflu-niol/l) 1.5ul36.7ul0.8ul(2.4U)50ul5min lmin 40sec 50sec 7min Osec229 cycles四、PCR条件的优化：PCR条件的优化主要是引物退火温度的调节，一般在引物设计软件推荐温度的上下 2 c变化寻找最隹退火温度。此外一浓度的调节也非常重要，通常最佳浓度为2mM左 右，引物和模板的量等。五、产物的电泳和结果的测定：根据产物长度制作造亘

10、浓度的琼脂楣凝胶（不同长度产物所需凝胶浓度）取适量PCR产物，加上样缓冲液充分混合，点样于事先做好的凉脂糖凝胶点样孔中， lOV/cm电泳45 -6cmi口。成像系统成像分析。分离不同大小D、A片段的合适琼脂精浓度琼脂楣浓度（）线性DNA片段的有效分离范围（kb）0.51-300.70.8 - 121.00.5 - 101.20.4-71.50.2-3六、需汪蕙的阿港：1、注意避免有毒、有害试剂伤害自己和他人；氯仿、漠化乙锭（EB）、酚、异硫氨酸服、紫外线等2、注意避免试剂污染3、始终注意避免RNA酶的污染：4、保管好自己专用的试剂，公用试剂保管好，相互协调，注意实胺室卫生RNA的琼脂糖凝胶电

11、泳实验原理和步骤来源：生物谷访问量：3688评论（0）分享1一、实验目的掌握植物总RNA非变性胶电泳的原理和方法。二、实验原理RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0%-1.4% 的凝胶，不同的RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的 条件下，RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定RA分子 量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总RA样品完整性时，配制普通 的1%琼脂糖凝胶即可。25SrRNA （占 8085 % ）18s5S植物RNA -tRNA及小分子RNA （占1015%）mRNA （占1 5%）V.bbioQ.Gon）寡聚脱氧胸背

12、（Oligod'D层析柱三、实验材料、器具及药品蘑菇的总RNA溶液。电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉， 紫外透射检测仪等。琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，0.5pg/ml溪化乙锭（EB） 10X载样缓冲液。四、实验步躲（1）用1XTAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加1MAE电泳缓冲液至液面覆 盖凝胶。（2）在超净工作台上，用移液器吸取总RA样品4川于封口膜上。在实验台 上再加入5川“TAE电泳缓冲液及的10X载样缓冲液，混匀后，小心加入 点样孔。ZBSrRNA+ IKrRNA1 % Denaturiirg Agarose Gel 0fT(MalRNAW33.bbioQ.Gon

13、)(3)打开电源开关，调节电压至100V,使RNA由负极向正极电泳，约30m h后将凝胶放入EB染液中染色5m力,用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪 上观察RNA电泳结果。Ufte I： Hlth Qudk? ToUl RNAUm 2： Psi的 grU Total RNAXtWIrTel 卧ARNA的变性琼脂糖凝胶检测试剂：(1) MOPS缓冲液(10*) :0.4m o此吗咻代丙烷磺酸(MOPS) (ph7.0), 0.1m olt N aAc, 10m o 14 ED TA o(2)上样染料:50%甘油,lm mo此EDTA ,0.4%打酚蓝,0.4%二甲苯蓝。(3)甲醛。（4）去离子甲酰胺。v电泳槽清洗：去污剂洗干净（一般浸泡过夜）一水冲 洗乙醇干燥3%H20 2灌满室温放置10分钟0.1% DEPC水冲 洗。操作：（1）将制胶用具用70%乙醇冲冼一遍，晾干备用。（2）配制琼脂糖凝胶。称取0.5g琼脂糖，置干净的100m 1锥形瓶中，加入40nli蒸储水，微波炉内 加热使琼脂糖彻底溶化均匀。待胶凉至6070 °C,依次向其中加入91nl甲醛、51nliOX M 0 PS缓冲液和 0.5ul滨化乙锭，混合均匀。灌制琼脂糖凝胶。（3 ）样品准备：取DEPC处