PPARγ在胃癌的表达及曲格列酮对胃癌SGC7901细胞生长的影响

1、PPAR在胃癌的表达及曲格列酮对胃癌SGC7901细胞生长的影响 作者：崔涛，刘莹，朱祖安，刘霞【摘要】 目的 探讨过氧化物酶体增殖物活化受体（PPAR）在胃癌及癌前病变中的表达，研究PPAR激动剂曲格列酮（troglitazone,TGZ）对人胃癌细胞SGC7901生长抑制作用及其作用机制。方法 免疫组织化学方法检测PPAR在胃癌及癌前病变中的表达；体外培养SGC7901细胞给予TGZ干预，四甲基偶氮唑蓝（MTT）法、流式细胞术、苏木精-伊红染色、免疫细胞化学方法、Western blot检测TGZ作用后SGC7901细胞生长情况、凋亡率及细胞周期的改变、细胞形态学变化、PPAR表达情况。结

2、果 免疫组化染色结果显示在轻度不典型增生、重度不典型增生及胃癌标本中PPAR阳性表达率为15.15（5/33）、66.67（14/21）、71.43（60/84），轻度不典型增生与重度不典型增生及胃癌组间有统计学差异（P0.05）。体外实验结果显示SGC7901细胞与不同浓度的TGZ共同培养，细胞的生长受到不同程度的抑制，TGZ 50 mol/L组与对照组相比P0.05，同时其作用具有浓度及剂量依赖性，苏木精-伊红染色结果显示实验组肿瘤细胞的生长较阴性对照组逐渐稀疏，出现细胞体积变小、形态不规则、细胞皱缩、核固缩、胞浆空泡等形态学表现。免疫组织化学染色显示PPAR在SGC7901细胞中有较高表

3、达，50 2 / 21mol/L与阴性对照组及低浓度25mol/L组相比P0.05，流式细胞仪检测结果显示TGZ 25 mol/L组起作用72 h后，细胞凋亡率明显升高，处于G0/G1与S期的细胞比例与阴性对照组相比，具有统计学意义（P0.05）。Western blot结果显示 TGZ作用72 h后与阴性对照组相比，高浓度50 mol/L组PPAR表达增加（P0.01）。结论 应用TGZ可以将SGC7901细胞阻滞于G0/G1期，进而抑制其增殖。 【关键词】 过氧化物酶体增殖物活化受体; SGC7901胃癌细胞; 曲格列酮 过氧化物酶体增殖物活化受体（peroxisome prolifera

4、tors-activated receptor, PPAR）属于核受体超家族成员，是一类由配体激活的核转录因子；人类PPAR有3种亚型，分别为PPAR、PPAR/、PPAR1。研究发现PPAR在脂肪肉瘤、乳腺癌、结肠癌、肺癌等肿瘤组织和细胞系中有较高水平的表达，但是研究同时显示PPAR激动剂能诱导胃癌细胞、结肠癌细胞株分化，抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡2-4。目前，对于PPAR在胃癌发生发展中的具体作用尚不明确。本研究在通过免疫组织化学方法检测PPAR在胃癌中的表达的同时，体外培养人胃癌SGC7901细胞给予PPAR激动剂干预后检测胃癌细胞增殖的改变，以探讨PPAR在胃癌发生发展中的作用

5、。 1 材料和方法 1.1 PPAR在胃癌及癌前病变中的表达 1.1.1 标本来源 所有标本取自徐州医学院附属医院20012004年胃镜活检及手术切除标本。84例胃癌中男性 61例,女性 23例,年龄3177岁,平均 57.5岁,有淋巴结转移 56例。不典型增生标本中,轻度不典型增生 33例,重度不典型增生 21例。所有胃癌患者术前均未经过化疗和放疗。 1.1.2 试验方法 采用免疫组化PowerVision两步法进行染色 (按试剂盒说明书进行,抗原修复均采用高压热修复 )。用 PBS取代一抗作为空白对照 ,已知阳性组织片作为阳性对照。PPAR购自北京中杉试剂公司（美国Santa Cruz公司

6、产品，sc-6285）。PPAR主要定位于细胞核，染色后光镜观察免疫组化染色切片的显色反应，高倍镜下计数10个高倍视野，阳性细胞计数>10% , 判定为阳性。 1.2 体外实验 体外培养人胃癌SGC7901细胞（购自上海细胞生物学研究所），给予PPAR激动剂曲格列酮（troglitazone，TGZ，美国Cayman公司）干预后检测胃癌细胞增殖、细胞周期及凋亡的改变。 1.2.1 实验分组 以DMSO液体配成浓度100 mmol/L，-20保存备用。TGZ作用浓度分为6组：0、6.25、12.5、25、50、100 mol/L共6个剂量组。四唑蓝比色试验按照上述分组进行，根据MT

7、T结果挑选出第1、4、5组进行苏木精-伊红染色、免疫组织化学染色、Western blot 检测蛋白表达及流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期。 1.2.2 四唑蓝比色试验（MTT法） 取SGC7901细胞1×108/L接种于96孔培养板,每孔200 l，置37、5%CO2及饱和湿度条件下待24 h细胞贴壁生长后，弃上清，按照上述实验分组设计分别加入含有TGZ的培养液，每组设6个复孔，重复2板，分别培养至48 h、72 h，弃上清，每孔加入5 g/L MTT液20 l，4 h后每孔加入150 l DMSO振荡混匀，酶标仪测定490 nm处的吸光度，计算抑制率。抑制率=（1给药组D值/空白

8、组D值）×100%。 1.2.3 苏木精-伊红染色 用1640培养液稀释肿瘤单细胞悬液浓度至2×105/ml，以每孔1 ml单细胞悬液接种于6孔板中，培养板每孔内放置3枚直径10 mm的圆形盖玻片。按照实验分组设计，每组每孔分别加入含有TGZ的培养液各1 ml。当SGC7901细胞与TGZ共同培养72 h后，取出6孔板内的玻片，4%多聚甲醛固定510 min，取出晾干，干燥彻底后即可进行苏木精-伊红染色，观察形态学改变。 1.2.4 免疫组织化学染色及Western blot 检测TGZ作用72h后SGC7901细胞PPAR表达 1.2.4.1 免疫组织化学染色步骤 用16

9、40培养液稀释肿瘤单细胞悬液浓度至2×108/L，以每孔1 ml单细胞悬液接种于6孔板中，培养板每孔内放置3枚直径10 mm的圆形盖玻片。按照上述实验分组设计，每组每孔分别加入含有TGZ的培养液各1 ml。当SGC7901细胞与TGZ共同培养72 h后，取出6孔板内的玻片，4%多聚甲醛固定510 min，取出晾干，干燥彻底后即可进行免疫细胞化学染色(SP法)。PPAR一抗稀释浓度1300，PPAR表达的判定以细胞核中有明显棕黄色或棕褐色颗粒者为阳性细胞；光镜高倍镜下观察，随机选取10个视野，共计1000个细胞中的阳性细胞数（即阳性细胞占计数细胞的百分比）。 1.2.4.2 Weste

10、rn blot检测 将对数生长期的SGC7901细胞消化，吹打成单细胞悬液，计数，调整细胞终浓度为2×108/L，置于100 ml培养瓶中，每瓶10 ml，待细胞贴壁生长后，弃上清，按照上述实验分组，加药作用72 h后收集细胞，提取总蛋白，蛋白定量后进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE ），转膜后加入含羊抗人PPAR多克隆抗体（1500稀释）的一抗封闭液，置摇床上30 min，4过夜，次日漂洗封闭后加入碱磷酶标记兔抗羊IgG（12000稀释）的封闭液，置摇床上晃动2 h后漂洗，NBT/BCIP显色液显色，观察蛋白表达的改变。 1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期 用

11、RPMI 1640培养液稀释肿瘤单细胞悬液浓度至2×108/L，以每孔1 ml单细胞悬液接种于24孔板中于37、5%CO2培养箱内培养，待细胞贴壁后，按照上述实验分组设计，每组每孔分别加入含有TGZ的培养液各1 ml，培养48 h、72 h后，收集细胞，70%冰乙醇固定，PI染液染色后采用Beckon/Dickinson FACS Calibur型流式细胞仪进行流式细胞术检测，在488 nm波长处进行检测，记录激发波长493 nm处的红色荧光。检测细胞凋亡与细胞周期改变。 1.3 数据处理 实验结果采用Stata8.0软件进行统计分析。各组数据均以±s表示，采用单因素方差分

12、析，并采用Scheffe法分析组间差异。检验水准：=0.05。 2 结 果 2.1 PPAR在胃癌中表达 在轻度不典型增生、重度不典型增生及胃癌标本中，PPAR阳性表达率为15.15（5/33）、66.67（14/21）、71.43（60/84），轻度不典型增生与重度不典型增生及胃癌组间有统计学差异（P0.05） ，重度不典型增生与胃癌组之间未见统计学差异。 2.2 体外实验结果 2.2.1 MTT法检测应用TGZ对胃癌SGC7901细胞的生长的影响 SGC7901细胞与不同浓度的TGZ共同培养，细胞的生长受到不同程度的抑制，当药物作用48 h，TGZ浓度达50 mol/L及以上时，与对照组相

13、比P0.05，同时其作用具有浓度及剂量依赖性（表1）。 表1 TGZ作用48、72 h后对SGC7901细胞抑制作用与0 mol/L组比较:P<0. 05 2.2.2 形态学观察TGZ对胃癌SGC7901细胞的影响 SGC7901细胞与TGZ共同培养72 h，实验组肿瘤细胞的生长较阴性对照组逐渐稀疏，细胞体积变小、形态不规则、细胞皱缩、核固缩、胞浆空泡等形态学表现（图 1）。图1 TGZ作用SGC7901 后形态学表现（苏木精-伊红染色，10×40） 2.2.3 TGZ作用后胃癌SGC7901细胞PPAR的改变 2.2.3.1 免疫组织化学方法检测TGZ作用后胃癌SGC

14、7901细胞PPAR的改变 PPAR在SGC7901细胞中有较高表达，低浓度25 mol/L组TGZ作用后与阴性对照组相比无显著性差异（P>0.05）；高浓度50 mol/L组与阴性对照组及低浓度25 mol/L组相比有显著性差异（P<0.05）（表2、图2）。 表2 TGZ作用72 h后PPAR蛋白阳性表达率 2.2.3.2 Western blot 检测TGZ作用72 h后SGC7901细胞PPAR的表达水平 TGZ作用72 h后与阴性对照组相比，高浓度50 mol/L组PPAR表达增加（P<0.01），低浓度25 mol/L组PPAR表达未见明显

15、改变（P>0.05）（图3）。 2.2.4 细胞凋亡 25 mol/L TGZ可诱导SGC7901细胞凋亡，应用药物后细胞凋亡率明显升高，48 h后50 mol/L与0 mol/L组、25 mol/L组比较P<0.05（表3）。表3 TGZ 对SGC7901细胞凋亡率的影响与0 mol/L组、25 mol/L组比较：P<0.05 2.2.5 细胞周期的改变 高浓度用药组处于G0/G1与S期的细胞比例与阴性对照组相比，具有统计学意义（P<0.05）。各组肿瘤细胞处于G2/M期的细胞比例之间的差异无统计学意义（P>0.05）（表

16、4）。表4 TGZ对SGC7901细胞周期的影响与0 mol/L组比较：P<0. 05 3 讨 论 PPAR是一类由配体激活的核转录因子，它是由英国科学家Issemann和Green于1990年首先克隆成功，属于型核受体超家族成员1。目前发现PPAR家族在脊椎动物中至少有3种亚型:PPAR、PPAR、PPAR。PPAR最初被认为是调节脂肪细胞分化的核激素受体，近年来其在抗肿瘤方面的研究较多，PPAR与相应的配体结合后，转入核内结合启动子区域过氧化物酶体增殖物反应元件（peroxisome proliferator responsive element,PPRE），调节c-ras、

17、c-myc、c-fos等生长调控基因的表达；同时还调节许多细胞因子、黏附分子以及信号转导分子等的表达，对PPAR研究已成为肿瘤研究的热点。 本研究结果显示PPAR在胃癌中阳性表达率明显高于轻度不典型增生组织，提示PPAR表达与胃癌的发生存在一定的关系，这与众多学者研究结果是一致的。但近来研究结果却显示PPAR激动剂对胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肝癌、肺癌、肾癌等恶性肿瘤细胞具有生长抑制、诱导凋亡和促进分化作用3,5-10。因此我们在本实验用PPAR激动剂TGZ处理胃癌SGC7901细胞后观察其对肿瘤细胞生长的作用，结果发现TGZ作用后SGC7901细胞PPAR蛋白表达明显升高，同时不同浓

18、度TGZ对于SGC7901细胞发挥不同程度生长抑制作用，抑制作用具有浓度及时间依赖性，高浓度药物（50 mol/L）与阴性对照组相比有显著性差异。至于其抑制肿瘤细胞生长的作用机制，结果提示TGZ可诱导SGC7901G0/G1的细胞比例增加、细胞凋亡增加。 研究显示PPAR/RXR能被 PPAR、RXR激动剂单独或协同激活形成PPAR/RXR二聚体，再结合于PPRE激活目的基因转录而发挥调控作用11。其作用的机制主要有：通过泛素-蛋白体蛋白降解途径，上调周期素依赖激酶抑制因子p21Waf1、p27Kip1的表达12-13；通过抑制炎症及核转录相关因子（如TNF、IL-4、NF-B）的活性而抑制肿

19、瘤细胞的生长14-15；降低凋亡抑制蛋白Bcl-2和Bcl-XL的表达，从而激活caspase-3介导的细胞凋亡途径16；抑制肿瘤血管内皮细胞增殖，从而抑制肿瘤血管生成17。那么如何去理解PPAR在胃癌中高表达，而其激动剂却可以抑制胃癌细胞生长的作用，根据实验结果可以推测在胃癌中可能存在PPAR过表达与RXR表达失平衡而无法形成有效的PPAR/RXR二聚体进而发挥其抗肿瘤作用。因此进一步探讨RXR在胃癌中的表达及其联合使用二者激动剂对胃癌细胞的影响将是本研究继续研究的方向与内容。【参考文献】 1 Lemberger T, Desvergne B, Wahli W. Peroxisome pro

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