重组人白介素18在毕赤酵母中的高效分泌表达

1、重组人白介素18在毕赤酵母中的高效分泌表达 作者：杨莉莉, 魏 枫, 刘 虹, 李 慧, 于津浦, 任秀宝【摘要】 目的: 构建人白介素18（hIL18）真核表达载体, 在毕赤酵母中高效分泌表达hIL18。方法: 通过PCR法扩增得到hIL18基因, 构建其真核表达载体pPICZaC/hIL18, 电转化毕氏酵母X33, PCR、 SDSPAGE、 Western blot等方法筛选获得高效表达rhIL18的工程菌株, 疏水层析和阴离子交换层析纯化表达产物, 并初步测定其生物学活性。结果: rhIL18经甲醇诱导后其表达产量约为202 mg/L。Western blot检测了rhIL18的特异

2、性结合活性; rhIl18纯化后纯度达95%左右, 并证明rhIL18能够协同IL2诱导PBMC分泌IFN。结论: 构建了重组hIL18的基因工程菌, 并在毕赤酵母中实现了高效分泌表达, 为进一步研究其活性和功能奠定了基础。 【关键词】 人白细胞介素18; 毕赤酵母; 表达; 纯化 白细胞介素18 (IL18)/又称IFN诱导因子 (IGIF), 主要由巨噬细胞产生的细胞因子1。人IL18前体蛋白由193个氨基酸组成, 天然IL18的活化依赖于IL1转化酶（Interleukin1 conversing enzyme, ICE）的特异裂解作用, 从前体IL18的N端切除36个氨基酸残基而使之活

3、化2 。IL2 / 1618的生物学活性与IL12相似, 能促进T细胞增殖, 诱导T细胞分泌IFN、 GMCSF, 抑制IL4和IL10产生, 增强NK及Th1细胞的细胞毒活性等; IL18的表达还与自身免疫病、 肿瘤及感染有关3, 4, IL18在抗肿瘤及抗病毒等方面具有潜在的应用前景5, 6。目前关于IL18制备的报道主要集中在原核表达体系2, 7, 但由于原核表达体系产量较低, 且存在复性得率低等一些问题, 使得其生产成本较高。为了更好的研究hIL18特性, 探索新的生物学活性, 我们在真核表达体系毕赤酵母中表达hIL18, 试图得到大量hIL18蛋白, 更好的开展hIL18体内或体外活

4、性研究。本研究从胎儿肝脏组织克隆了人IL18成熟肽（即从第37位氨基酸到193位氨基酸）基因, 构建了真核重组表达质粒, 利用毕赤酵母交配因子信号肽引导重组hIL18（rhIL18）成熟肽的分泌表达, 探索了纯化方法, 并对其活性进行了初步研究。 1 材料和方法 1.1 材料 pPICZaC质粒和毕赤酵母菌株X33购自Invitrogen公司; E.coli DH5购自北京鼎国生物公司; PCR引物由上海生物工程公司合成; 限制性内切酶及T4 DNA连接酶购自大连宝生物公司; Phenly Sepharose 6 FF, Q Sepharose HP购于美国GE公司。淋巴细胞分离液购自中国医学

5、科学院血液学研究所; 山羊抗人IL18抗体和辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗山羊IgG抗体购自Santa Cruz公司。自动玻璃发酵罐（KLF2000型）为瑞士比欧（Bioengineer）公司产品; 蛋白纯化仪（型号AKTA explorer 10）为美国GE公司产品。 1.2 方法 1.2.1 hIL18基因的克隆及载体构建 提取胎儿肝脏组织RNA, 以其为模板, 根据GenBank公布序列(Accession No. BC007007.)设计引物, 上游引物为5CCG CTC GAG AAG AGA TAC TTT GGC AAG3, 下游引物为5GCC GCT CTA GAT TAG

6、 TCT TCG TTT TGA ACA G3(Xho I和Xba I划线所示), PCR扩增得到含hIL18成熟肽基因片段。为了终止C端Histag 的表达, 下游引物中Xba I的前面加入终止密码子。PCR扩增产物用Xho I和Xba I酶切后, 连于用同样酶切的载体pPICZaC得到质粒pPICZaC/hIL18。连接产物转化大肠杆菌DH5, 涂于含25 mg/L Zeocin LB平板上, 酶切鉴定转化产物并测序, 提取鉴定正确的阳性克隆质粒用于表达。 1.2.2 质粒pPICZaC/IL18的转化及鉴定 将重组表达质粒pPICZaC/hIL18以Pme I线性化, 纯化回收。将15

7、g线性pPICZaC/hIL18电转化至新鲜制备的酵母感受态细胞X33中, 并同时转化空质粒pPICZaC和空酵母菌作对照, 转化产物涂布于YPD平板（Zeocin的浓度为100 mg/L）。28培养23 d至长出菌落。在YPD平板（Zeocin抗性）上挑取20个克隆, 提取转化的毕赤酵母菌基因组DNA, 以其为模板, 以上面提到的特异引物进行PCR鉴定, 并以未转化的酵母菌基因组DNA和空质粒pPICZaC转化的酵母菌基因组DNA作对照, PCR鉴定质粒pPICZaC/hIL18是否稳定转化。 1.2.3 摇瓶环境rhIL18的表达 经鉴定的重组阳性克隆pPICZaC/IL18/X33接种于

8、10 mL BMGY中, 28、 250 r/min空气摇床培养至对数生长期（A600=26）, 3 000 r/min 离心5 min, 弃上清, 用10 mL BMMY培养基悬浮细胞, 28、 250 r/min诱导rhIL18表达, 培养过程中保持良好的通气。每24 h 补加100%甲醇诱导重组蛋白表达, 至甲醇终浓度为5 mL/L。分别在诱导24、 48、 72、 96、 120 h 取1 mL 培养物离心分离上清, SDSPAGE分析目的蛋白表达。 1.2.4 重组hIL18的大规模表达 在筛选出高表达菌株后, 重组hIL18 在3.7 L发酵罐进一步表达。挑取筛选出的阳性转化子于1

9、0 mL BMGY培养基, 28、 250 r/min振摇培养24 h, 然后接种到200 mL的BMGY培养中, 28、 250 r/min振摇培养24 h至A600到 6左右。2 L 发酵基础盐培养基（BSM）添加8.7 mL PTM1微量元素和6 mL 0.2 g/L 生物素。28 mL/L氨水调整培养基的pH至6.0。首先扩增菌体, 培养至菌体湿重达到220 g/L, 待碳源完全消耗尽, 开始补加100%甲醇诱导rhIL18的表达, 甲醇补加速度6 mL/h 2 h, 10 mL/h 2 h, 最后18 mL/h 维持至发酵结束。发酵过程中, 调节通气量和转速维持溶解氧高于30, 通过

10、NH4OH 或 H3PO4的泵入维持pH的稳定, 通过循环冷凝水维持温度的稳定, 发酵每隔6 h取样进行分析A600和细胞湿重, 留上清用于蛋白分析。 1.2.5 rhIL18的纯化 表达完成后, 疏水层析和阴离子交换层析分离纯化rhIL18。收集上清, 确定最佳的疏水层析(NH4)2SO4饱和度, 然后用Phenyl Sepharose 6 FF疏水层析树脂分离纯化, 将上述疏水层析洗脱的蛋白溶液调节pH至8.0, 继续用Q Sepharose HP阴离子层析柱分离纯化。 1.2.6 rhIL18的鉴定 利用150 g/L SDSPAGE 和Western blot 分析蛋白的表达及纯化结果

11、。将rhIL18转移到PVDF膜上, 用山羊抗人IL18抗体为一抗, 以HRP标记的兔抗山羊IgG抗体为二抗进行分析。Lowry法检测 rhIL18培养上清中总蛋白含量。采用SDSPAGE电泳凝胶扫描半定量分析目的蛋白表达量。 1.2.7 rhIL18刺激PBMC产生IFN 用RPMI1640（含100 mL/L FCS）培养液稀释标准品rhIL18和纯化的rhIL18各2组, 浓度分别为0.4、 4、 40 mol/L分别加到96孔板, 100 L/孔, 每个稀释度3个平行孔。常规Ficoll法分离健康志愿者PBMC, 调整细胞密度为1×109/L, 分成2份, 其中一份加入IL2

12、（100 U/mL）, 分别接种96孔板, 100 L/孔, 对应稀释好的标准品rhIL18和纯化的rhIL18, 37、 50 mL/L CO2孵箱培养48 h。收集细胞上清, 用ELISA试剂盒测IFN含量。 2 结果 2.1 hIL18表达载体的构建 PCR产物行10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定, 在500 bp左右见到特异扩增条带（图1）, 与预测片段大小相同, 初步确定为编码hIL18的片段。重组质粒pPICZaC/hIL18经Xho I和Xba I双酶切得到约3 600 bp和500 bp左右2条带（图1）, 初步确定重组质粒中有目的基因片段的正向插入。重组质粒pPICZaC/hIL

13、18序列测定结果证实目的基因碱基序列按照预期方向定向插入表达载体, 且接口处序列正确, 未改变读码框架。 2.2 rhIL18的表达及鉴定 重组质粒pPICZaC/hIL18转化酵母菌X33后, 在YPD平板（Zeocin抗性）上挑取20个克隆, PCR产物经电泳分析, 对照组未见电泳条带, 18个转化子出现预期500 bp左右特异性扩增条带, 说明hIL18基因已经整合至酵母基因组中。不同时间表达上清行SDSPAGE (图2)和Western blot (图3), 结果表明, 重组工程菌pPICZaC/hIL18/X33在相对分子质量（Mr）约18 000处出现考马斯染色条带, 与预期hIL

14、18的Mr一致。 2.3 rhIL18的纯化 利用Phenyl Sepharose 6 FF疏水层析纯化rhIL18（图4）, 分析确定rhIL18疏水层析最佳(NH4)2SO4饱和度为40%, 经疏水层析分离样品再次经Q Sepharose HP阴离子交换层析分离, 得到一个活性洗脱主峰, NaCl的洗脱浓度为0.3 mol/L。 2.4 rhIL18刺激PBMC分泌IFN 分离PBMC, 分析纯化的rIL18协同IL2对淋巴细胞刺激IFN的能力。结果显示, 单独加入 rhIL18或标准品rhIL18刺激的细胞上清中检测不到IFN, 而同时加入亚适剂量IL2后, 细胞培养上清中IFN含量升高

15、, 并且随 rhIL18及标准品rhIL18浓度增加而提高(图5), 说明毕赤酵母制备的rhIL18具有同标准品rhIL18一样的协同IL2对PBMC诱导IFN的能力。图5 rIL18协同Il2诱导PBMCs分泌IFN 3 讨论 选择适合真核表达体系巴斯德毕赤酵母来表达hIL18。此表达体系既具备易于操作, 遗传背景清楚, 生产成本低等原核生物的特点, 又具有真核生物的折叠、 分泌机制, 可以完成真核生物特异的蛋白酶解、 折叠、 糖基化等翻译后修饰过程, 且生长速度快, 培养成分简单, 适应工业化生产的需要8。毕赤酵母乙醇氧化酶基因（aoxI）是一个甲醇诱导表达的严格调控基因, 启动活性高,

16、加入甲醇后可以迅速启动转录, 而且N糖基化方式更接近高等真核生物9。交配因子信号肽部分已被广泛用于酵母中合成和分泌异源蛋白质。本研究把hIL18成熟肽连在交配因子信号肽的C端, AOXI启动子控制下交配因子信号肽引导hIL18成熟肽在毕赤酵母中分泌表达。设计时, 为了得到不带有Histag的蛋白, 在扩增hIL18片段时在其下游引物引入终止密码子, 这使得纯化相对困难, 但得到的hIL18由于没有多余的氨基酸便于以后的动物实验研究。 rhIL18在3.7 L发酵罐进行了初步的表达, 表达产物经Lowry法定量和SDSPAGE半定量分析初步确定表达产量约为202 mg/L。首先确定rhIL18疏

17、水层析最佳(NH4)2SO4饱和度为40%, 然后用Phenyl Sepharose 6 FF疏水层析纯化rhIL18。hIL18等电点为4.9左右2, 经疏水层析纯化的样品再次经Q Sepharose HP阴离子交换层析纯化, pH选择8.0, 纯度达95%左右。对纯化的rhIL18进行了刺激PBMC分泌IFN的实验, 结果表明, rhIL18能够协同IL2诱导PBMC分泌IFN, 作用效果同标准品rhIL18相当。 总之, 我们利用毕赤酵母表达体系制备了rhIL18, 产量约为202 mg/L。蛋白以分泌形式表达便于后期的纯化, 建立了简单快速rhIL18纯化方法, 初步验证了其协同IL2

18、诱导PBMCs分泌IFN的能力, 为以后开展体内或体外生物学活性奠定了良好的基础。【参考文献】 1 Okamura H, Tsutsui H, Komatsu T, et al. Cloning of a new cytokine that induces IFN production by T cellsJ. Nature, 1995(2), 378: 88-91. 2 Ushio S, Namba M, Okura T, et al. Cloning of the cD NA for human IFNinducing factor, expression in Escherichia c

19、oli, and studies on the biologic activities of the proteinJ. J Immunol, 1996, 156(11): 4274-4279.3 Nakanishi K, Yoshimoto T, Tsutsui H, et al. Interleukin18 is a unique cytokine that stimulates both Th1 and Th2 responses depending on its cytokine milieuJ. Cytokine Growth Factor Re, 2001, 12(1): 53-72.4 Dao T, Mehal WZ, Crispe IN. IL18 augments perforindependent cytotoxicity of liver NKT cellsJ. J Immunol, 1998, 161(5): 2217-2222.5 Eberl M, Beck E, Coulson PS, et al. IL18 potentiates the adjuvant properties of IL12 in the induction of a s