hbv基因与耐药检测 临床版ppt课件

1、产品经理 吴 勇HBVHBV分型和耐药突变基因检测分型和耐药突变基因检测产品经理 吴 勇一、慢性乙肝患者抗病毒治疗的临床现状一、慢性乙肝患者抗病毒治疗的临床现状二、基因芯片原理、亚能二、基因芯片原理、亚能HBVHBV分型与耐药突变基因检测分型与耐药突变基因检测三、三、HBVHBV分型与耐药突变基因检测的运用与临床意义分型与耐药突变基因检测的运用与临床意义目目 录录一、乙肝患者抗病毒治疗的临床现状一、乙肝患者抗病毒治疗的临床现状耐药耐药 指南指南 战略战略 干扰素：普通干扰素干扰素：普通干扰素2a2a、2b2b、1b1b、 聚乙二醇干扰素聚乙二醇干扰素2a2a、2b2b核苷酸类药物：拉米夫定、阿

2、德福韦酯、核苷酸类药物：拉米夫定、阿德福韦酯、 恩替卡韦、替比夫恩替卡韦、替比夫定定药物种药物种类有限类有限我国我国CHB治疗现状治疗现状20212021年年EASLEASL、APASLAPASL乙肝防治指南建议乙肝防治指南建议: : ETV ETV或或TDFTDF作为单药一线用药作为单药一线用药国内难以普及：国内难以普及： 强调根据情况个体化选药，患者依从强调根据情况个体化选药，患者依从性差性差国情国情差别差别干扰素：干扰素：PegIFN 1PegIFN 1年病毒学应对率年病毒学应对率25%25%，HBeAgHBeAg血血 清学转换率清学转换率30%30%，血清，血清HBV DNAHBV D

3、NA阳性阳性率高；率高；耐药问题耐药问题: :核苷酸类药物核苷酸类药物疗效疗效有限有限慢性乙型肝炎结合抗病毒治疗专家共识，中国肝脏病杂志，2021，32：38-45耐药的危害耐药的危害导致疾病进展病毒学反弹、生化突破等导致疾病进展病毒学反弹、生化突破等肝硬化和肝癌发生率高肝硬化和肝癌发生率高使已获得的疗效如组织学改善丧失使已获得的疗效如组织学改善丧失后续治疗更复杂、困难，添加医疗本钱后续治疗更复杂、困难，添加医疗本钱耐药毒株的传播能够导致公共卫生问题耐药毒株的传播能够导致公共卫生问题警惕警惕耐药耐药HBVHBV耐药耐药EASL Clinical Practice Guidelines :Man

4、agement of chronic hepatitis B virus infection. Journal of Hepatology 2021 vol.57|167-185核苷酸类药物耐药核苷酸类药物耐药的预防和治疗的预防和治疗1243 33 5 严厉掌握治疗顺应症严厉掌握治疗顺应症谨慎选择核苷酸类药物谨慎选择核苷酸类药物1高危患者及时结合治疗高危患者及时结合治疗治疗中亲密监视，一旦耐药尽早救援治疗治疗中亲密监视，一旦耐药尽早救援治疗尽量防止单药序贯治疗尽量防止单药序贯治疗生物化学检查：血清生物化学检查：血清ALT和和AST、胆红素、白蛋白等、胆红素、白蛋白等乙肝实验室检查乙肝实验室检查

5、HBVHBV血清学检查：血清学检查：HBsAgHBsAg、抗、抗HBsHBs、HBeAgHBeAg等乙肝两对半等乙肝两对半HBV DNAHBV DNA、基因型和变异检测、基因型和变异检测生物化学检查：血清生物化学检查：血清ALT和和AST、胆红素、白蛋白等、胆红素、白蛋白等HBVHBV血清学检查：血清学检查：HBsAgHBsAg、抗、抗HBsHBs、HBeAgHBeAg等乙肝两对半等乙肝两对半HBV DNAHBV DNA、基因型和变异检测、基因型和变异检测生物化学检查：血清生物化学检查：血清ALT和和AST、胆红素、白蛋白等、胆红素、白蛋白等HBVHBV分型与耐药突变检测方法分型与耐药突变检测

6、方法u PCR PCR产物直接测序法；产物直接测序法；u PCR PCR产物克隆测序法；产物克隆测序法；u 限制性片段长度多态性技术限制性片段长度多态性技术(RFLP)(RFLP)；u 线性探针反向杂交法线性探针反向杂交法(INNO-LiPA)(INNO-LiPA)；u 基因芯片技术基因芯片技术u 限制性片段质谱多肽性分析限制性片段质谱多肽性分析u 焦磷酸测序法焦磷酸测序法u 深度测序法深度测序法二、基因芯片原理、二、基因芯片原理、亚能亚能HBVHBV分型与耐药突变基因检测分型与耐药突变基因检测基因芯片基因芯片(gene chip)(gene chip)：是多种特定的寡核苷酸序列为探针，固定：

7、是多种特定的寡核苷酸序列为探针，固定于支持物外表上而成的二维于支持物外表上而成的二维DNADNA阵列。阵列。根本原理：利用碱基互补配对原那么，经过目的根本原理：利用碱基互补配对原那么，经过目的DNADNA与探针特异结与探针特异结合来判别目的合来判别目的DNADNA的序列信息。的序列信息。基因芯片原理基因芯片原理乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测试剂盒乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测试剂盒 PCR-PCR-反向点杂交法反向点杂交法注册号：国食药监械准字注册号：国食药监械准字20212021第第34011773401177号号专利号：专利号：ZL200710073933.3ZL200710073

8、933.3国内首个全面提示核苷酸类药物耐药的快速诊断试剂国内首个全面提示核苷酸类药物耐药的快速诊断试剂 PCR PCR扩增：在扩增：在S S基因和基因和P P基因重叠区段设计基因重叠区段设计PCRPCR引物，引物，PCRPCR扩增片段扩增片段既包含耐药突变位点又能进展基因分型。既包含耐药突变位点又能进展基因分型。P P基因：耐药突变检测基因：耐药突变检测编码编码DNADNA合成酶包含逆转录酶合成酶包含逆转录酶rtrt，抗，抗病毒药物作用靶区，耐药基因突变热点区病毒药物作用靶区，耐药基因突变热点区S S基因：分型检测基因：分型检测产品技术原理产品技术原理亚能亚能HBVHBV产品运用产品运用抗病毒

9、治疗前、治疗中抗病毒治疗前、治疗中HBVHBV的基因分型和耐药突变基因检测的基因分型和耐药突变基因检测u 区分我国常见的区分我国常见的HBV-BHBV-B、C C、D D基因型基因型u 涵盖我国涵盖我国4 4种核苷酸抗病毒药物拉米夫定、阿德福韦酯、种核苷酸抗病毒药物拉米夫定、阿德福韦酯、 u 替比夫定、恩替卡韦替比夫定、恩替卡韦7 7个耐药位点的个耐药位点的1616种突变：种突变：rtL180MrtL180M、rtM204V/IrtM204V/I、rtA181V/TrtA181V/T、rtN236TrtN236T、rtM250I/L/VrtM250I/L/V、rtS202G/IrtS202G/

10、I、rtT184I/S/A/F/LrtT184I/S/A/F/L。本产品检测的样本为血清或血浆；本产品检测的样本为血清或血浆；要求待检样本的要求待检样本的HBV DNAHBV DNA载量载量1.01.0103copies/mL103copies/mL。样本要求样本要求样本保管样本保管为了防止为了防止DNADNA降解，制备好的血清或血浆，防止长时间室温放置；降解，制备好的血清或血浆，防止长时间室温放置；2 288保管不超越保管不超越4848小时；小时；-18-18以下保管不超越半年，防止反复冻融。以下保管不超越半年，防止反复冻融。本卷须知本卷须知全基因序列全基因序列测定法测定法限制性片段长度多态

11、限制性片段长度多态性分析法（性分析法（RFLPRFLP）实时荧光实时荧光PCRPCR法法亚能亚能HBV HBV 基因芯片基因芯片灵敏度灵敏度灵敏度低，最低检测限为20%；灵敏，最低检测限为5%；灵敏，最低检测限为5%；灵敏，最低检测限为5%；检测检测位点位点所有突变位点已知耐药位点仅能检测rt204位点我国4种核苷类药物7个耐药位点的16种突变评价评价1、测序试剂大多未获得SFDA批准；2、操作繁琐、技术难度大、仪器要求高、不易在临床开展。1、需针对每一个待测突变位点，分别设计特异性内切酶反应体系；2、一些突变可能生成新的酶切位点，或破坏原有酶切位点，必须谨慎看待检测结果。结果仅提示拉米夫定耐

12、药。1、是首个获得SFDA批准的，同时进行分型、耐药检测的试剂盒；2、准确性好、6小时出结果、结果肉眼可见。仪器要求低，操作便捷、易于临床使用。HBVHBV耐药检测产品比较耐药检测产品比较三、三、HBVHBV分型与耐药突变基因检测分型与耐药突变基因检测的运用与临床意义的运用与临床意义HBVHBV基因型检测临床意义基因型检测临床意义 HBeAg HBeAg阳性患者中，阳性患者中，B B基因型对基因型对IFN-IFN-治疗的应对率高于治疗的应对率高于C C基因基因 型，型，A A基因型高于基因型高于D D基因型。基因型。 与与C C基因型感染者相比，基因型感染者相比，B B基因型感染者较早出现基因

13、型感染者较早出现HBeAgHBeAg血清学血清学 转换，较少进展为慢性肝炎、肝硬化和原发性肝细胞癌；转换，较少进展为慢性肝炎、肝硬化和原发性肝细胞癌；预测干扰素应对和疾病进展情况预测干扰素应对和疾病进展情况 HBVHBV耐药检测临床意义耐药检测临床意义 抗病毒治疗前，预存耐药检测 协助临床选择合理抗病毒药物，实现个体化抗病毒治疗、提高抗病毒疗效、降低耐药发生率。 抗病毒治疗中，全程耐药监测 全程监测耐药，利于早期挽救治疗，为调整治疗方案提供实际支持。选择合理抗病毒药物，为调整治疗方案提供实际根据选择合理抗病毒药物，为调整治疗方案提供实际根据抗病毒治疗前抗病毒治疗前抗病毒治疗期间抗病毒治疗期间抗

14、病毒治疗效果不佳时抗病毒治疗效果不佳时何时选择何时选择HBVHBV基因分型、耐药检测？基因分型、耐药检测？预存耐药检测，实现治疗个体化预存耐药检测，实现治疗个体化LAMLAM、ADV ADV 、ETVETV预存耐药率分别为预存耐药率分别为7.81%7.81%、7.81%7.81%、1.56%1.56%预存耐药 慢性乙型肝炎患者在核苷(酸)类似物治疗前即存在耐药位点突变，即预存耐药变异。盖洪鹏，孙伟翔，袁德胜，等，预存耐药对核苷酸类似物抗病毒治疗应对和耐药的影响，临床肝胆病杂志，2021，2811：841-844预存耐药检测显著提高预存耐药检测显著提高CHBCHB患者患者 HBV DNA HBV

15、 DNA 转阴率、转阴率、HBeAg/HBeAg/抗抗HBeHBe转换率转换率盖洪鹏，孙伟翔，袁德胜，等，预存耐药对核苷酸类似物抗病毒治疗应对和耐药的影响，临床肝胆病杂志，2021，2811：841-8444848周周HBeAg/HBeAg/抗抗-HBe-HBe转换率转换率P P 0.050.054848周周HBV DNA HBV DNA 转阴率转阴率P P 0.050.05预存耐药检测，显著提高临床疗效预存耐药检测，显著提高临床疗效抗病毒治疗中的监测抗病毒治疗中的监测( (线路图线路图治疗第治疗第12周评价能否存在周评价能否存在“原发性无应对原发性无应对病毒学应对：HBV DNA 较基线下降

16、10IU或50拷贝/ml原发性治疗失败：HBV DNA 较基线下降 10IU或 50拷贝/ml患者依从性良好：加用更强的抗病药物患者依从性不佳：督促劝说坚持治疗治疗治疗24周评价疗效的早期预测因子周评价疗效的早期预测因子完全病毒学应对：PCR检测 HBV DNA 阴性部分病毒学应对：60IU/ml HBV DNA 2000IU/ml不充分病毒学应对：HBV DNA 2000IU/ml以同一药物继续治疗，每6个月监测一次基因屏障低的药物：加用基因变异特点不同的第二种药物基因屏障高的药物：每3个月监测一次并在48周后继续监测抗病毒才干相对低的药物：每3个月监测一次并在48周后继续监测加用更强的抗病

17、毒药物：每3个月监测一次假设第48周获得完全病毒学应对，那么继续治疗假设第48周未获得病毒学应对，那么加用一种更强且无交叉耐药的药物Keeffe，et al.Clinical Gastroenterology and Hepatology，2007，5：890897耐药基因位点变异与临耐药基因位点变异与临床挽救治疗方案床挽救治疗方案突变基因位点突变基因位点结果模式结果模式对应的耐药药物对应的耐药药物临床挽救治疗方案临床挽救治疗方案rt180M+rt204I/Vrt180M+rt204I/V拉米夫定（拉米夫定（LAMLAM）1 1、加用或换用、加用或换用TDFTDF2 2、加用、加用ADVADV

18、rt204I/Vrt204I/Vrt181V/Trt181V/T换用换用ETVETVrt180M+rt204I/Vrt180M+rt204I/V替比夫定（替比夫定（LdTLdT）1 1、加用或换用、加用或换用TDFTDF2 2、加用、加用ADVADVrt204Irt204Irt181V/Trt181V/T换用换用ETVETVrt181V/Trt181V/T阿德福韦酯（阿德福韦酯（ADVADV）1 1、加或换用、加或换用ETVETV2 2、加用、加用LAMLAM、LdT(rt181LdT(rt181位点未突变者位点未突变者) )rt236Trt236Trt180M+rt204I/Vrt180M+rt204I/V或或rt204I/Vrt204I/V184184I/S/A/F/LI/S/A/F/L恩替卡韦