性低O2高CO2对大鼠海马Bcl2、Bax基因表达和细胞凋亡的影响

1、性低O2高CO2对大鼠海马Bcl-2、Bax基因表达和细胞凋亡的影响【摘要】 目的:探讨慢性低O2高CO2对大鼠海马神经细胞凋亡的诱发作用及对Bcl-2、Bax基因表达的影响。方法:雄性SD大鼠50只，随机均分成5组：正常对照组（NC）、低O2高CO21周组（1HH）、2周组（2HH）、3周组（3HH）和4周组（4HH）。采用TUNEL法检测海马神经细胞凋亡；以RT-PCR检测海马Bcl-2 mRNA和Bax mRNA的表达。结果:随着低O2高CO2时间延长，凋亡指数(AI)及Bax mRNA水平进行性升高；Bcl-2 mRNA先升高后下降（均P<0.01）。AI与Bax mRN

2、A之间呈显著正相关（r=0.814，P<0.01），而与Bcl-2 mRNA/Bax mRNA比值之间呈显著负相关（r=-0.405，P<0.01）。结论:慢性低O2高CO2可以诱发大鼠海马神经细胞凋亡，Bcl-2/Bax比值下降是促进凋亡的重要因素。 【关键词】 海马 低氧 高碳酸血症 凋亡 Bcl-2 Bax Abstract: Objective: To explore the inducing effect of chronic hypoxic hypercapnia on the apoptosis of rat neural cells in the h

3、ippocampus, and the relationship between the apoptosis and Bcl-2 as well as Bax gene expression. Methods: Fifty male spragu-dawley rats were randomly divided into five groups: normal control group (NC), hypoxic hypercapnia 1-week (1HH), 2-week (2HH), 3-week (3HH) and 4-week (4HH) group. The in situ

4、cell apoptosis in the hippocampus was detected with TUNEL staining. The expression of Bcl-2 and Bax mRNA in the hippocampus were examined with RT-PCR. Results: Apoptosis index (AI) and the expression Bax mRNA were progressirely increased with the prolongation of duration of hypoxic hypercapnic expos

5、ure, and the expression of Bcl-2 mRNA was increased at first, then declined. There was a significant positive correlation between AI and the expression of Bax mRNA (r=0.814, P<0.01), and there was a significant negative correlation between AI and the ratio of Bcl-2 mRNA/Bax mRNA (r=-0.405, P&

6、amp;lt;0.01). Conclusion: Apoptosis can be induced by chronic hypoxic hypercapnia in rat hippocampus. The ratio of Bcl-2/Bax decline accelerates the occurrence of apoptosis.2 / 14 Key words: hippocampus; hypoxia; hypercapnia; apoptosis; Bcl-2; Bax 临床上慢性阻塞性肺疾病（chronic obstruc-tive pulmonary disease，C

7、OPD）由于通气功能障碍常引起低氧血症或伴高碳酸血症，病情持续发展可导致肺性脑病。动物实验也发现，慢性低氧能够引起脑组织结构和功能的损害1，2，但迄今为止，其发生机制尚未完全阐明。近年来研究发现，细胞凋亡可能在慢性低氧性脑损害中起重要作用3。本实验采用慢性低O2高CO2性肺动脉高压大鼠模型，通过不同低O2高CO2干预时间（1周、2周、3周、4周），动态观察大鼠海马神经细胞凋亡及凋亡相关基因表达的变化，初步探讨慢性低O2高CO2大鼠海马神经细胞凋亡的可能机制。 1 材料和方法 1.1 主要材料 常压低02高CO2舱（温州医学院肺心病研究室研制），CYESIl型O2、CO2气体测定仪（上海市嘉定学

8、联仪表厂生产），Medlab生物信号采集处理系统（南京美易科技有限公司生产），TUNEL试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司生产），梯度PCR仪（Effendorf公司生产），RT-PCR试剂盒（Fermentas公司提供）。 1.2 动物分组及模型制备4 雄性SD大鼠50只（温州医学院实验动物中心提供），体重180220 g。随机分成5组：即正常对照组（NC）、低O2高CO21周组（1HH）、2周组（2HH）、3周组（3HH）和4周组（4HH），每组10只。将后4组动物放入常压低O2高CO2舱内，舱内充入氮气（N2）使O2浓度维持在9%11%，CO2浓度维持在5.5%6.5%，每天8 h，连续

9、1周（1HH组）、2周（2HH组）、3周（3HH组）或4周（4HH组）。对照组大鼠除吸入空气外，其他饲养条件与各低O2高CO2组相同。动物饲养到规定时间后，用戊巴比妥钠（35 mg/kg）腹腔麻醉，右心导管法测定平均肺动脉压（mPAP）、平均颈动脉压（mCAP）。 1.3 取材和标本制作 经左颈总动脉插管处用4 生理盐水200 m1灌注10 min。将大鼠断头，取脑置于冰盘上，快速分离出左、右海马。左侧海马置于液氮迅速冷冻，再放-70 冰箱保存，用于RT-PCR检测。右侧海马放入4%多聚甲醛中固定4 h，依次进行梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、5m厚连续切片，用于细胞凋亡检测。 1.4

10、海马神经细胞凋亡原位检测 采用原位缺口末端标记（TUNEL）法，按试剂盒提供方法操作。镜检细胞核中有棕黄色颗粒者为凋亡细胞。随机计算5个高倍视野（×400）下的凋亡细胞数。凋亡指数（apoptosis index，AI）以凋亡细胞/100个细胞（%）表示。 1.5 Bcl-2和Bax基因的RT-PCR检测 Bcl-2和Bax引物根据Genebank资料，利用primer 5.0引物设计软件确定最优引物，然后经Blast匹对，由上海生工生物有限公司合成。Bcl-2引物：上游为5'-CTGGTGGACAACATCGCTCTG-3'，下游为5'-GGTCTGCTGA

11、CCTCACTTGTG-3'，扩增片段228 bp；Bax引物：上游为5'-GCGAATTGGAGATGAACTGG-3'，下游为5'-GTGAGCGAGGCGGTGAGGAC-3'，扩增片段366 bp。以GAPDH作为内参照，引物序列：上游为5'-AGTATGACTCCACTCACGGCAA-3'，下游为5'-TCTCGCTCCTGGAAGATGGT-3'，扩增片断100 bp。 取左侧海马组织匀浆后，提取1l RNA样品，采用紫外分光光度法测定RNA纯度，以OD260/OD280的比值表示，要求比值在1.82.0之间

12、。取2g RNA，采用M-MLV逆转录酶，按20l体系，42 ，逆转录1 h。多聚酶反应总体系为20l（包含GAPDH引物），所有引物退火温度为56 ，扩增35个循环，脂糖电泳，溴乙啶染色，紫外灯照相，凝胶图像扫描。 1.6 统计分析 多组样本均数比较进行方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析，方差齐性者用LSD检验，方差不齐者用Dunnett's T3检验。双变量相关分析用Pearman直线相关分析法分析。 2 结果 2.1 低O2高CO2对大鼠mPAP、mCAP、RV/（LV+S）的影响 慢性低O2高CO2各组mPAP、RV/（LV+S）均高于正常对照组（均P<0.

13、01），mPAP、RV/（LV+S）在慢性低O2高CO2 2周时达最高，34周渐趋稳定。各组间mCAP差异无显著性（均P>0.05）。见表1。 2.2 大鼠海马细胞凋亡检测 NC组海马神经细胞少量凋亡（见图1）；低O2高CO2各组与NC组比较，细胞凋亡均显著增加（P<0.05或P<0.01）。随着低O2高CO2时间的延长，细胞凋亡有逐渐增多的趋势，4HH组TUNEL阳性细胞最多（见图4）。4HH组AI较1HH组高261.6%（P<0.01），较2HH组高71.4%（P<0.01），较3HH组增高不明显（见表2）。 2.3 海

14、马Bcl-2 mRNA和Bax mRNA的表达及Bcl-2/Bax比值 低O2高CO2各组海马Bcl-2 mRNA和Bax mRNA表达上调，与NC组比较均有显著性差异（均P<0.01）。随着低O2高CO2时间延长，Bcl-2 mRNA表达先升高而后下降（见图5），而Bax mRNA表达逐渐增高（见图6）。Bcl-2/Bax比值的变化趋势同Bcl-2 mRNA，即随着低O2高CO2时间的延长，先升高而后下降（见表2）。 2.4 相关性分析 将海马神经细胞AI与Bcl-2 mRNA、Bax mRNA及Bcl-2 mRNA/Bax mRNA的比值作相关分析表明：AI与Bax mRNA

15、之间存在显著正相关（r=0.814，P<0.01），而与Bcl-2 mRNA/Bax mRNA比值之间存在显著负相关（r=-0.405，P<0.01）。 3 讨论 慢性低氧能够引起脑组织结构和功能的损害，细胞凋亡被证实在其中起着重要作用2，3。Gozal等5在研究大鼠间断性低氧模型时发现，在间断低氧14 d时，大鼠皮层和海马区细胞凋亡达到高峰。Xu等6在Gozal实验基础上进一步研究发现，在间断性低氧21 d、30 d时，细胞凋亡出现下降的趋势。而本实验显示，海马细胞凋亡指数随低O2高CO2时间延长呈逐渐升高，在第4周时未见下降。据推测可能是不同的实验条件和动物模型

16、使脑细胞凋亡出现不同变化趋势。另外，本实验与低O2同时存在的高CO2也可能是造成这种趋势的重要因素。因为，高CO2能明显抑制低氧诱导的脑血管密度增加，通过抑制脑血管重建而加重低氧性脑损害7，8；高CO2使大脑乳酸根浓度明显增加及葡萄糖浓度明显减少，使大脑发生能量代谢障碍9。 细胞凋亡是许多基因参与的程序化过程，有着非常复杂的调控机制，其中，Bcl-2基因家族是目前较为公认与凋亡密切相关的基因。Bcl-2家族包括两类成员，一类如Bcl-2、Bcl-xl等抑制凋亡发生，另一类如Bax、Bak、Bcl-xs、Bad、Bid、Bik等促进凋亡发生，Bcl-2/Bax增大时促进细胞存活，反之则导致细胞凋

17、亡10。本实验观察到，随着低O2高CO2干预时间的延长，海马Bcl-2 mRNA表达先升高后下降。这种变化出现的原因，可能是由于在低O2高CO2损伤早期，首先启动了Bcl-2基因表达以阻止细胞凋亡；而随着低O2高CO2时间延长，其他诱导凋亡因素持续存在，细胞损伤不断加重，最终Bcl-2的表达被抑制，细胞继而发生凋亡。另外，随着低O2高CO2干预时间的延长，海马Bax mRNA表达逐渐增多，表明低O2高CO2可引起海马Bax表达增多，进而诱导细胞凋亡，因而Bcl-2/Bax比值逐渐下降，海马神经细胞AI逐渐增高，两者呈显著负相关。本实验提示，慢性低O2高CO2可以诱发大鼠海马神经细胞凋亡。Bcl

18、-2/Bax比值下降可能是促进凋亡的重要因素。【参考文献】1 Mikati MA, Zeinieh MP, Kurdi RM, et al. Long-term effects of acute and of chronic hypoxia on behavior and on hippoc- ampal histology in the developing brain J. Brain Res Dev Brain Res, 2005, 157(1): 98-102.2 Benesova P, Langmeier M, Betka J, et al. Long-lasting changes

19、 in the density of nitrergic neurons following kainic acid ad- ministration and chronic hypoxia J. Physiol Res, 2005, 54 (5): 565-571.3 Schwartz ML, Vaccarino F, Chacon M, et al. Chronic neona- tal hypoxia leads to long term decreases in the volume and cell number of the rat cerebral cortex J. Semin

20、 Perinatol, 2004, 28(6): 379-388.4 胡良冈, 龚永生, 范小芳, 等. 常压低氧高二氧化碳清洁级动物饲养舱的研制J. 医疗卫生装备, 2003, 24(4): 16-17. 5 Gozal D, Daniel JM, Dohanich GP. Behavioral and anatomi- cal correlates of chronic episodic hypoxia during sleep in therat J. J Neurosci, 2001, 21(7): 2442-2450.6 Xu W, Chi L, Row BW, et al. Increased oxidative stress is associated with chronic intermittent hypoxia-mediated brain cortical neuronal cell apoptosis in a mouse model of sleep apnea J. Neuroscience, 2004, 126(2): 313-323.7 Xu K, Puchowicz MA, LaManna JC. Renormalization of re-gional brain blo